Summary
Bu çalışmada yardımcı programı ve kolaylığı nicel hücre zarı uzantısı ölçüm ve hücre yapışkanlı kapasite için onun korelasyon gösterir. Temsil edici bir örnek olarak, biz burada Dickkopf ilgili biraz protein 3 (DKK3) artan lobopodia oluşumu teşvik ve vitroAdrenokortikal Karsinom hücre adhesiveness hücreleri göstermek.
Abstract
Hücre zarı'nın uzantısı repertuar onların ya da göçmen potansiyelleri de dahil olmak üzere kanser hücrelerinin çeşitli kötü huylu davranışlar modüle. Nasıl hücre sinyallemesi olayların etkisi kanser hücre davranış ve saldırganlık belirlemek için kritik doğru şekilde sınıflandırmak ve hücre uzantıları ölçmek ve bir hücrenin yapışkanlı kapasitesi üzerindeki etkisini ölçmek için yeteneğidir. Burada, vitro tasarım ve bir hücre uzantısı quantification yöntemiyle birlikte kurulan vitro modelinde bir yapışma kapasite tahlil Adrenokortikal Karsinom (ACC) için kullanımını açıklar. Özellikle, DKK3, sözde Tümör baskılayıcı ve bir yanlısı farklılaşma faktörü üzerine etkileri membran uzantısı fenotip ACC hücre satırının SW-13 test ediyoruz. Biz nispeten basit, güvenilir sağlamak için bu deneyleri teklif ve kolay yorumlanabilir ölçümleri bu özellikleri çeşitli deneysel koşullarda ölçer.
Introduction
Dysregulated WNT sinyal Adrenokortikal maligniteler1' de kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışmada kullanılan yöntemleri DKK3 susturmak, WNT sinyal, negatif bir regülatör adrenal korteks dedifferentiation olayını temsil eder ve bağlamında tümör oluşumu hücre-uzantı repertuar değişir teşvik olup olmadığını araştırmak. DKK3 38 kDa ile bir N-terminal sinyal peptid glikoprotein salgılanan ve önceki çalışmalar zorunlu ifadesini hücre döngüsü tutuklama sonuçlandı, saldırgan kötü huylu davranış inhibe ve Mezenkimal epitel ters göstermiştir olduğunu geçiş2.
Adrenokortikal Karsinom (ACC) ve diğer kanser Malign davranışını tümör hücreleri çevreleyen yüzeyler ile arayüz yeteneği etkisinde bölümünde sırayla tümör hücre işgali kolaylaştırır hücre dışı matriks dahil olmak üzere ve geçiş3. Öncelikle filopodia oluşumu ile çeşitli bağlamlarda belirli hücre zarı kanseri ilerleme uzantılarında rolünün giderek gösterilen. Örneğin, overexpression L tipi kalsiyum kanal filopodia oluşumu teşvik ve tümör hücre işgali4teşvik bulundu. Benzer şekilde, Fascin, en az bağlayıcı protein bağlıdır bir aktin dokusu normal ifade de kanser hücrelerinin filopodia oluşumu5ile birlikte overexpressed mevcuttur. Lobopodia oluşumu sağlar etkili ekstra hücresel matris ile geçirmek non-Malign fibroblastlar, Fibrosarkom hücreleri metalloproteinaz etkinliği hücre geçişi kolaylaştırmak için lobopodia yerine itimat gösterilmiştir ancak, ve istila6. Biz o tümörü göstermiştir bastırıcılarının Ras Derneği etki alanı aile 1 izoformu (RASSF1A) de dahil olmak üzere ve DKK3, hücre iskeleti öğeleri değiştirebilir ve lamellipodia oluşumu teşvik ve invaziv özellikleri7,8taş koymak için işlev görebilir.
Bu nedenle, bu genlerin karsinojenezis ve hücre zarının uzantısı değişiklikler, özellikle filopodia, lobopodia ve lamellipodia oluşumu test koşullarında değerlendirilmesi ile ilişkilerini katılan etkileri karakterize etmek için önemlidir. Geçerli state-of-art teknikleri veri toplama ve yorumu giderek karmaşık mikroskobu yöntemleri, floresan etiketleme ve/veya karmaşık bilgisayar algoritmaları kullanımını içerir. Bu yöntemler yeni ve güçlü analitik araçlar sağlarken, kendi karmaşıklığı onların yaygın kullanımı ve adaptasyon hücre biyolojisi deneylerde sınırlar. Ayrıca, kesin miktar ve hücre uzantısı Morfoloji değişimler gözlenmesi değil genellikle ölçülen9,10. Buna ek olarak, biz doğru bir şekilde standart mikroskobik teknikler ve kolayca adapte vitro yöntemleri kullanarak hücre uzantısı değişiklikler quantifies bir teknik tanıtmak. Bu yöntemler aynı zamanda her hücre uzantı türü aynı anda her hücre analiz için sayısal ve hücre zarının uzantısı repertuar genel değişiklikleri belirlemek. Biz de nasıl bu değişiklikler hücre adezyon özellikleri için ilgili olabilir gösterir.
Deneysel örnek olarak, önceden oluşturulmuş hücre kültürünü SW-13, SW-DDK3, stabil pCMV6-giriş/DKK3 plazmid vektörleri ile transfected ve yapısal DKK3, böbrek üstü bezi bir farklılaştırıcı faktör overexpresses belirlenmiş kullanacağız. Sigara transfected SW-13 hücreleri ve stabil SW-Neo, belirlenmiş boş ile vektör (pCMV6-giriş), transfected SW-13 hücreleri deneysel denetimler olarak görev yapacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre uzantısı özellikleri
- SW-13, SW-Neo ve CO2 ' Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 fetal sığır serum ve 10.000 U/mL penisilin ve streptomisin ('büyüme aracı olarak' belirlenmiş) ile desteklenmiş bir standart oksijen kuluçka 37,0 ° C'de ve %5 SW-DKK3 hücreleri korumak.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve iyi SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 hat başına 5000 hücre ayrı 6-şey kalıplara plaka ve gecede büyüme aracı olarak steril cam coverslips üzerinde büyür.
- Her şey için gecede büyüme Aspire edin sonra büyüme orta, hücreleri 1 mL sıcak fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın ve hücreleri % 3.7 formaldehit 10 dk 1 mL ile düzeltin.
- Her şey ile 1 mL % 0.05 kristal Menekşe 30 dk. yıkama aşırı aspiratı formaldehit ve leke hücrelerinde uzak üç yıkama 1 mL deiyonize su kullanarak boya.
Not: boya alımı düzeyine bağlı olarak, birkaç ek yıkar hücre görselleştirme tanıtmak için boyama arka plan çıkarmak için gerekli olabilir.- İnce uçlu forseps kullanarak, coverslips almak ve yüzü aşağı bir damla temiz montaj reaktif etiketli cam Slayttaki yer onları.
- Işık mikroskobunda rastgele her coverslip hücre uzantısı tahlil için hücrelerin üst üste 20 sayısı seçin.
- Photomicrographs her görüş alanı 400 x büyütme oranında al. Doğrudan uzantısı türlerinin her biri 20 temsilcisi hücreleri için saymak.
Not: Bu nedenle, güvenilir sonuçlar alabilmek sınanan her koşul için 20 izole hücreler incelenmesi gerekir. Filopodia 5 mikron veya daha az bir üs ve tek bir tepe ile hücresel uzantıları tarafından tanımlanan. Lobopodia bir üs 5 ila 20 mikron, birden çok apices uzunluğu içeren uzantıları ile hücresel uzantıları tarafından tanımlanan. Lamellipodia 20 mikron uzunluğunda olan veya olmayan apices daha büyük hücre uzantıları tarafından tanımlanan. Test edilmiş hücre türüne bağlı olarak hücre uzantıları boyutları farklı olabilir ve parametreleri tanımlama arıtma gerektirebilir.
- Photomicrographs her görüş alanı 400 x büyütme oranında al. Doğrudan uzantısı türlerinin her biri 20 temsilcisi hücreleri için saymak.
- Her hücre türü (Yani, SW-13, SW-Neo, SW-DDK) her hücre uzantısında muayene 6 kuyular arasında belirlemek.
- Bir tek yönlü Varyans analizi (ANOVA) istatistiksel test kullanarak, hücre zarının uzantıları farklı test hücre tipleri arasında ortalama yüzdesini farklılıkları karşılaştırın.
2. yapışma tahlil
- SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 hücreleri 37,0 ° C ve % 5 CO2 büyüme orta'de standart bir oksijen kuluçka korumak.
- Bir hemasitometre kullanarak, say ve iyi başına 100.000 hücre SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 ayrı 6-şey kalıplara plaka ve gecede büyüme ortamında büyümek.
- Her biri aşağıda test 6 belirlenen zaman puan için bir tabak kullanarak tohum 6-şey plakaları her hücre türü için test.
Not: Zaman Puan farklı hücre tipleri için farklı olabilir.
- Gecede kuluçka sonra sıcak PBS bir kez yıkama hücrelerle sonra her şey için 0.5 mL 1 x enzimatik olmayan hücre ayrılma çözümü ekleyin.
- Hücre ayrılma çözümü yaymak için plaka girdap. Tanımlanan zaman noktaları (Yani, 1, 2, 3, 5, 10 ve 15 dk) belirlenen plaka Aspire edin ve sonra üç kez 1 mL sıcak PBS solüsyon ile yıkayın.
- Yıkama arasında hafifçe gevşek bağlı hücreler ayırmak plakalara dokunun.
- Kalan PBS ve kalan hücreleri ile 1 mL % 3.7 formaldehit 10 min için plaka bağlı düzeltme Aspire edin.
- 1 mL % 0.05 kristal Menekşe 30 dk için hücrelerle leke sonra aşırı boya uzak 1 mL deiyonize su ile yıkayın. Hücre görselleştirme tanıtmak için yıkama titre.
Not: boya alımı düzeyine bağlı olarak, birkaç ek yıkar hücre görselleştirme tanıtmak için gerekli olabilir. - 100 x büyütme hafif bir mikroskop kullanarak, her şey her tabak içinde kalan ekli hücreleri saymak.
Not: Saydam cetvelleri veya ince kalem kılavuzları plaka alt tarafında işaretleme kullanımı tekrarlanan aynı hücreleri sayma önlemek için yardımcı olacaktır. - Her plaka için iyi başına bağlı hücre ortalama sayısını belirleyin.
- SW-13, SW-Neo ve SW-DDK3 hücreleri arasında hücre dekolmanı kullanarak iki yönlü ANOVA istatistiksel test belirli bir dönem içinde oranı karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki deneyleri kullanarak, hücre uzantısı morfoloji ve hücre adezyon özellikleri DKK3 overexpression etkileri kurulan ACC hücre hattında SW-13, vitrotest edildi. DKK3 overexpressing hücreleri stabil Myc-DDK etiketli pCMV6-giriş/DKK3 plazmid Vektörler ve SW-DKK3 belirlenmiş hücrelerle SW-13 transfecting tarafından üretildi. Benzer şekilde, stabil boş vektör pCMV6-giriş ile transfected hücreleri transfection ve passaging denetimi olarak oluşturulan ve SW-Neo olarak tanımlanmış. SW-13 hücreleri bir üst hücreyi denetimi olarak kullanılmıştır. SW-DKK3 DKK3 overexpression nicel gerçek zamanlı PCR tarafından doğrulandı ve Western blot teknikleri8.
Kısaca, test hücreleri SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 gecede kapak paket fişi 6 iyi tabaklar içinde yetiştirilen vardı. Hücreleri sonra formaldehit ile sabit ve kristal violet ile lekeli. Hücre uzantısı özellikleri sonra yukarıda açıklanan parametreleri başına mikroskobu altında sayısal. Analiz, SW-DKK3 hücreleri artan lobopodia ve çok yönlü hücre polarite tarafından kaydetti daha farklılaşmış bir fenotip görüntülenen (p = 0,01, tek yönlü ANOVA, şekil 1 ve Şekil 2), yönlü hareketliliği eksikliği düşündüren. Buna ek olarak, ebeveyn SW-13 ve SW-Neo hücre polarite muhafaza ve büyük filopodia düzlemsel bir yönde düzenlenmiş görüntülenir (p = 0,01, tek yönlü ANOVA, şekil 1 ve Şekil 2)8.
Artan lobopodia oluşumu hücre ek özellikleri değiştirilmiş olup olmadığını belirlemek için bir hücre adezyon tahlil yapılır. Kısaca, hücreleri gecede yetiştirilmiştir ve hücre dekolmanı aralıkları 15 dk. hücreleri kadar vardı o zaman formaldehit ile sabit, kristal violet ile lekeli ve bir ışık kullanarak sayılan progresif anda enzimatik olmayan hücre ayrılma çözümü ile gerçekleştirildi mikroskop. SW-DKK3 hücreleri SW-13 ve SW-Neo hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha fazla bir eki yakınlık gösterdi (p < 0,01, 2-way ANOVA, şekil 3). Bu sonuçlar DKK3 sırayla hücre ek8teşvik lobopodia oluşumu teşvik gösterir.
Şekil 1: DKK3 zorunlu ifade değiştirir hücre zarı uzantıları. SW-13 (A), SW-Neo (B)ve SW-DKK3 (C) hücreleri cam coverslips üzerinde yetiştirilen, formaldehit ile sabit, kristal violet ile lekeli ve görüntüsü. Photomicrographs 400 x büyütme hafif bir mikroskop kullanarak alınır. SW-13 ve SW-Neo hücreleri çoğunlukla filopodia (kırmızı ok uçları) ve lamellipodia (mavi ark) hücre uzantıları kurdu. Buna ek olarak, SW-DKK3 hücreleri daha fazla lobopodia (küçük yeşil kemerler), lamellipodia ve çok az filopodia çevre yokluğu ile kurdu. SW-13 (A) ve SW-Neo (B) hücreleri polarize (turuncu oklar) öncü, filopodia ve lamellipodia ahşap kaplama kenarı ile görünmektedir iken, SW-DKK3 eşit olarak dağıtılmış çok yönlü lobopodia gösterdi (C) hücreleri. Deneyler yinelenen içinde gerçekleştirilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: DKK3 teşvik lobopodia oluşumu. Filopodia, lobopodia ve lamellipodia her hücre için hücre başına göreli temsil hesaplanan hücre uzantıları üzerinde tek tek hücreler tabulating tarafından. SW-13, SW-Neo ve SW-DKK (400 x büyütme) görüşlerini rasgele alınan mikroskobik alanın yirmi photomicrographs hücrelerde miktar için kullanılmıştır. Hata çubukları belirtilen standart sapma ve (*) gösterir p < 0,01 lobopodia SW-DKK hücrelerdeki sayısında önemli bir artış gösteren bir tek yönlü ANOVA kullanarak. Toplam 20 hücre her test hücre türü için muayene ve deneyler yinelenen içinde gerçekleştirilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: DKK teşvik hücre adezyon. Yüz bin SW-13, SW-Neo ve 6-şey plakalar kuyusu başına SW-DKK3 hücreleri gecede büyümeye izin verildi ve dekolmanı belirlenen zaman noktalarda (x ekseni) için tedavi edildi. Ekli kalan hücreleri, lekeli, sayılır ve düzeltildi ve yüzdeleri bağlı kalan hücrelerin çizilen (y ekseni) idi. Hata Çubuklarõn standart sapma ve (*) gösterir p < 0,01 ve (*) gösterir p < 0,001 SW-DKK önemli bir artış gösteren bir 2 yönlü ANOVA kullanarak hücre ek güç. Her deney 100.000 hücreleri ile başlayan ve deneyler yinelenen içinde gerçekleştirilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada hücre uzantıları kolaylığı, birkaç çukur-falls ve çeşitli test koşulları uygulanabilir güvenilir tekrarlanabilirlik ile karakterize bir vitro nicel yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, basit, ölçülebilir yapışma ve/veya hareketliliği deneyleri fonksiyonel önemini potansiyel: hücre zarı uzantılarında gözlenen değişiklikler ilişkilendirmek için aynı anda gerçekleştirilebilir.
Ancak, bu yöntemlerin olası bazı sınırlamalar takdim edebilir miyim? İlk, burada hücre uzantıları farklı türlerini belirlemek üzere belirtilen ölçütlerle Adrenokortikal SW-13 hücre morfolojisi üzerinde temel alan ve bu nedenle büyük olasılıkla diğer hücre türleri ve/veya deneysel koşullar uygulandığında parametreler sınıflandırma içinde arıtma gerekir. Ayrıca, Genişletilmiş zaman ders deneylerde hücre zarı uzantısı değişiklikler olası etkileri hücre döngüsü ve hücre ölümü dikkate alınması gerekir.
İkinci olarak, protokol tahlil'ın tekrarlanabilirlik arası gözlemci değişim nedeniyle sınırı olabilir sınav tarafından potansiyel bireyselleştirilmiş arama üzerinde güveniyor olabilir. Her test grubu için büyük olasılıkla incelenir hücreleri yüksek sayıda parçası bu önyargı üstesinden gelir; Özellikle, ne zaman 20 hücreleri her tahlil için incelenir. Kör bir biçimde arama uzantısı gerçekleştirmek için birden çok kişiye eklenmesi olası öznel Arama Önyargı azaltmak için önerilmektedir.
Hücre uzantısı sınıf anahtarının değişimler değişikliklere ek özellikleri, nerede yapışma özellikleri basitleştirilmiş bir sürümünü sonucu olabilir ilişkilendirmek için ek terkedilemeyen tercih değiştirilmiş son olarak, bakım alınmalıdır yerine değiştirilmiş benzeşme test terkedilemeyen için. Hücre uzantısı sınıf anahtarının geçiş veya içeriğinde işgali çeşitli ekstra hücresel matris bileşenleri ile kaplin gözlenen adezyon özellikleri açıklamak.
Sonuç olarak, burada özetlenen Protokolü hücre zarı uzantısı anahtarının çeşitli test koşullarda fonksiyonel önemini ölçmek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Ohse Grant Vakfı Bu eser finanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
