Summary
Denna studie visar nytta och användarvänlighet kvantitativa cellmembranet förlängning mätning och dess korrelation till självhäftande kapacitet av celler. Som ett typexempel visar vi här det Dickkopf-relaterade proteinet 3 (DKK3) främjar ökad lobopodia bildning och cell vidhäftning i adrenokortikal cancer celler in vitro.
Abstract
Cellmembranets förlängning repertoar modulerar olika maligna beteenden av cancerceller, inklusive deras självhäftande och flyttfåglar potential. Förmågan att noggrant klassificera och kvantifiera cell tillägg och mäta effekten på cellens självhäftande kapacitet är avgörande för att fastställa hur cell-signalering händelser inverkan cancercellers beteende och aggressivitet. Vi beskriver här, in vitro- design och en cell filändelsen kvantifiering metod i samband med en vidhäftning kapacitet analys i en etablerad in vitro- modell för adrenokortikal carcinom (ACC). Specifikt, testar vi effekterna av DKK3, en förmodad tumörsuppressor och en Pro differentiering faktor, på membran förlängning fenotypen av raden cell ACC, SW-13. Vi föreslår dessa analyser att ge relativt enkel, tillförlitlig och lätt tolkningsbara mätvärden till åtgärder dessa egenskaper under olika experimentella förhållanden.
Introduction
Dysregulated WNT signalering spelar en avgörande roll i adrenokortikal maligniteter1. De metoder som används i denna studie undersöka om ljuddämpning av DKK3, en negativ regulator av WNT signalering, representerar en Dedifferentiering händelse i binjurebarken och främjar tumörbildning i samband av cell-extension repertoar förändringar. DKK3 är en 38 kDa utsöndras glykoprotein med en N-terminal signal peptid och tidigare studier har visat att dess påtvingade uttryck resulterade i cellcykelarrest, inhiberad aggressiva elakartade beteende och omvänd epitelial-mesenkymala övergången2.
Malignt beteende adrenokortikal carcinom (ACC) och andra cancerformer är, i del, influerad av tumörceller förmåga att samverka med de omgivande ytorna, inklusive den extracellular matrisen, vilket i sin tur underlättar tumör cell invasion och migration3. Rollen för specifika cellmembranet extensions i cancer progression demonstreras alltmer i olika sammanhang, främst via bildandet av filopodia. Överuttryck av L-typ kalciumkanaler har exempelvis visat att framkalla filopodia bildas och främja tumör cell invasion4. Likaså staden, en aktin bindande protein minimalt uttryckt i normal vävnad, är också överuttryckt i cancerceller i samband med filopodia bildning5. Lobopodia bildande möjliggör icke-maligna fibroblaster att migrera effektivt genom extra-cellulära matrisen, det har dock visat att fibrosarkom celler åberopa metalloproteinas aktivitet i stället för lobopodia att underlätta cellmigration och invasion6. Vi har visat att tumören dämpning, inklusive Ras association domän familj 1 isoform en (RASSF1A) och DKK3, kan funktionen för att ändra cytoskeletal element och främja lamellipodia bildning och hämmas invasiva egenskaper7,8.
Som sådan, är det viktigt att karakterisera effekterna av gener involverade i carcinogenes och deras relation till cellmembranet förlängning förändringar, särskilt bedöma filopodia, lobopodia och lamellipodia bildning under provningsförhållanden. Aktuella staten-of-the-art tekniker inkluderar användning av alltmer sofistikerade mikroskopi metoder, fluorescerande märkning eller komplexa datoralgoritmer för datainsamling och tolkning. Medan dessa metoder ger nya och kraftfulla analytiska verktyg, begränsar deras komplexitet deras utbredd användning och anpassningsförmåga i cellbiologi experiment. Dessutom är den exakt kvantifiering och observation av förändringar i cellmorfologi förlängning inte vanligtvis uppmätta9,10. Däremot införa vi en teknik här som exakt kvantifierar cell filändelsen förändringar med standard mikroskopiska tekniker och lätt anpassningsbar in vitro- metoder. Dessa metoder även kvantifiera varje celltyp förlängning samtidigt för varje cell som analyseras och fastställa övergripande förändringar i cellmembranet förlängning repertoar. Vi visar också hur dessa förändringar kan relatera till cell vidhäftningsegenskaper.
Som en experimentell exempel, kommer att vi använda en tidigare skapad cell fodrar SW-13, designerat SW-DDK3, som har transfekterats stabilt med pCMV6-posten/DKK3 plasmid vektorer och konstitutivt overexpresses DKK3, en särskiljande faktorn i binjuren. Icke-transfekterade SW-13 och SW-13 celler stabilt transfekterade med tom vektor (pCMV6-post), designerat SW-Neo, kommer att tjäna som experimentella kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell filändelsen egenskaper
- Underhålla SW-13, SW-Neo och SW-DKK3 celler i en standard befuktade inkubator vid 37,0 ° C och 5% CO2 i Dulbeccos modifierade Eagle Medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 10.000 U/mL penicillin och streptomycin (betecknas som 'odlingsmedium').
- Räkna celler som använder en hemocytometer, och platta 5 000 celler per brunn för SW-13, SW-Neo och SW-DKK3 linjer i separata 6-bra plattor och växer över natten i odlingsmedium på sterilt glas coverslips.
- Efter övernattning tillväxt, för varje brunn, aspirera odlingsmedium, tvätta cellerna med 1 mL varm fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), och sedan fixa cellerna med 1 mL av 3,7% formaldehyd i 10 min.
- Aspirera formaldehyd och fläcken celler i varje brunn med 1 mL 0,05% kristallviolett för 30 min. Tvätta överskott färga bort med hjälp av tre tvättar 1 mL avjoniserat vatten.
Obs: Beroende på graden av färgämne upptag, flera ytterligare tvättar behövas ta bort bakgrunden färgning för att främja cell visualisering.- Med fina lutad pincett, Hämta coverslips och placera dem ansikte nedåt på en märkt glasskiva med en droppe klart montering reagens.
- Under ett ljusmikroskop, slumpmässigt Välj 20 visningar av icke-överlappande celler från varje täckglas för cell filändelsen analysen.
- Ta mikrofotografier 400 x förstoring av varje synfält. Direkt räkna antalet varje typ av tillägg för varje 20 representativa cellerna.
Obs: som sådan, 20 isolerade celler bör granskas för varje testad villkor att säkerställa tillförlitliga resultat. Filopodia definierades av cellulär tillägg med en bas av 5 mikrometer eller mindre och en enda apex. Lobopodia definierades av cellulär tillägg med en bas av 5 till 20 µm längd innehållande tillägg med flera rotspetsar. Lamellipodia definierades av cell tillägg som är större än 20 mikrometer i längd och med eller utan rotspetsar. Beroende på den testade celltypen, storleken på cell tillägg kan variera och kan kräva förfining av anger parametrarna.
- Ta mikrofotografier 400 x förstoring av varje synfält. Direkt räkna antalet varje typ av tillägg för varje 20 representativa cellerna.
- Bestämma det genomsnittliga antalet varje cell tillägg i varje celltyp (dvs, KV-13, SW-Neo, SW-DDK) över 6 brunnarna undersökt.
- Med en envägs variansanalys (ANOVA) statistiska test, jämföra skillnader i den genomsnittliga procentandelen cellmembranet tillägg bland de olika test celltyper.
2. vidhäftning Assay
- Underhålla SW-13, SW-Neo och SW-DKK3 celler i en standard befuktade inkubator på 37,0 ° C och 5% CO2 i odlingsmedium.
- Använder en hemocytometer, räkna och platta 100 000 celler av SW-13, SW-Neo och SW-DKK3 per brunn i separata 6-bra plattor och växa över natten i odlingsmedium.
- Utsäde 6-väl plattor för varje celltyp testade, med en platta för varje 6 angivna tidpunkter testade nedan.
Obs: Tidpunkter kan variera för olika celltyper.
- Efter natten inkubation, tvätta cellerna med varma PBS en gång sedan Tillsätt 0,5 mL av 1 x icke-enzymatiska cell dissociation lösning till varje brunn.
- Snurra på plattan för att sprida cell dissociation lösningen. Aspirera utsedda plattan vid definierade tidpunkter (dvs 1, 2, 3, 5, 10 och 15 min) och sedan tvätta med 1 mL varm PBS lösning tre gånger.
- Mellan tvättar, knacka försiktigt på plattorna för att lossa löst bifogade celler.
- Aspirera eventuella återstående PBS och fixa cellerna återstående fäst plattan med 1 mL av 3,7% formaldehyd i 10 min.
- Färga celler med 1 mL 0,05% kristallviolett för 30 min sedan tvätta överflödig färg bort med 1 mL avjoniserat vatten. Titrera tvätt för att främja cell visualisering.
Obs: Beroende på graden av färgämne upptag, flera ytterligare tvättar behövas att främja cell visualisering. - Med ett ljusmikroskop vid 100 gångers förstoring, greve fäst de återstående celler i varje brunn för varje platta.
Obs: Användning av transparenta linjaler eller märkning fina penna guider på undersidan av plattan kommer att bidra till att undvika upprepade räkna av samma celler. - Avgöra det genomsnittliga antalet bifogade celler per brunn för varje platta.
- Jämföra graden av cell lösgörande mellan SW-13, SW-Neo och SW-DDK3 celler under given tidsperiod med en tvåvägs ANOVA statistiska test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekterna av DKK3 överuttryck på förlängning cellmorfologi och vidhäftning Cellegenskaper prövades i den etablerade ACC cell fodrar SW-13, in vitro-och använda de ovanstående analyserna. Celler överuttryck av DKK3 genererades av stabilt transfecting SW-13 celler med Myc-DDK märkta pCMV6-posten/DKK3 plasmid vektorer och utsett SW-DKK3. Likaså celler stabilt transfekterade med tom vektor pCMV6-posten skapades som en transfection och passaging kontroll och definieras som SW-Neo. SW-13 celler användes som en ytterligare förälder-cell-kontroll. Överuttryck av DKK3 i SW-DKK3 bekräftades av kvantitativ realtids-PCR och Western blot teknik8.
Kort, testade celler SW-13, SW-Neo och SW-DKK3 odlades över natten i 6 plattor på täckglas. Cellerna var sedan fixeras med formaldehyd och färgas med kristallviolett. Cellernas förlängning egenskaper kvantifierades sedan under mikroskopi per de parametrar som beskrivs ovan. På analys, SW-DKK3 celler visas en mer differentierad fenotyp som noteras av ökad lobopodia och mångfacetterat cell polaritet (p = 0,01, one-way ANOVA, figur 1 och figur 2), tyder på en brist på riktad motilitet. Däremot föräldrarnas SW-13 och SW-Neo celler underhålls polaritet och visas större filopodia ordnade i en planar orientering (p = 0,01, one-way ANOVA, figur 1 och figur 2)8.
För att avgöra huruvida ökad lobopodia bildandet ändras bilaga Cellegenskaper, vi utfört en cell adhesion test. Kort, celler odlades över natten och cell avlossning utfördes med icke-enzymatiska cell dissociation lösning på progressiva tid intervall upp till 15 min. celler var då fast med formaldehyd, målat med kristallviolett och räknade med en ljus Mikroskop. SW-DKK3 celler visade en signifikant större fastsättning affinitet jämfört med SW-13 och SW-Neo celler (p < 0,01, 2-vägs ANOVA, figur 3). Dessa resultat indikerar att DKK3 främjar lobopodia-formationen, vilken i sin tur främjar cell bilaga8.
Figur 1: påtvingade uttryck för DKK3 förändrar cellmembran förlängningar. SW-13 (A), SW-Neo (B)och SW-DKK3 (C) celler var odlas på glas coverslips, fast med formaldehyd, målat med kristallviolett och avbildas. Mikrofotografier är tagna med ett ljusmikroskop med 400 x förstoring. SW-13 och SW-Neo celler bildas mestadels filopodia (röda pilar) och lamellipodia (blå arc) cell filändelser. SW-DKK3 celler bildas däremot mer lobopodia (små gröna bågar), med nära avsaknad av lamellipodia, och mycket få filopodia. Medan de SW-13 (A) och SW-Neo (B) cellerna verkar vara polariserad (orange pilar) med filopodia i framkant och lamellipodia vid släpar kanten, celler SW-DKK3 (C) visade jämnt fördelade mångfacetterat lobopodia. Experimenten utfördes i två exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DKK3 främjar lobopodia bildandet. Den relativa representationen av filopodia, lobopodia och lamellipodia per cell för varje celltyp beräknades genom tabulering cell tillägg på enskilda celler. Celler i tjugo mikrofotografier av slumpmässigt tagna mikroskopiska fält av visningar (400 x förstoring) SW-13, SW-Neo och SW-DKK användes för kvantifiering. Felstaplar anges standardavvikelse och (*) indikerar p < 0,01 med en envägs ANOVA som representerar en betydande ökning av antalet lobopodia i SW-DKK celler. Sammanlagt 20 celler undersöktes för varje testad celltyp och experimenten utfördes i två exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: DKK främjar celladhesion. Hundra tusen SW-13, SW-Neo och SW-DKK3 celler per brunn 6-väl plattor tilläts växa över natten och behandlades för avlossning vid bestämda tidpunkter (x-axeln). Cellerna återstående bifogade var fast, målat och räknade och procentsatserna av celler återstående bifogade var uppritade (y-axeln). Felstaplar visar standardavvikelsen och (*) indikerar p < 0,01 och (*) indikerar p < 0,001 med en 2-vägs ANOVA som representerar en betydande ökning av SW-DKK cell fastsättning styrka. Varje experiment började med 100 000 celler och experimenten utfördes i två exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en in vitro- kvantitativ metod för att karakterisera cell tillägg med lätthet, några pit-faller och tillförlitlig reproducerbarhet som kan tillämpas för olika förhållanden. Dessutom kan enkel, kvantifierbara vidhäftning eller motilitet analyser utföras samtidigt för att korrelera potentiella funktionell betydelse av observerade förändringar i cellmembranet filändelser.
Dessa metoder kan dock medföra vissa potentiella begränsningar. Först, de kriterier som anges här att identifiera olika typer av cell tillägg baseras på adrenokortikal SW-13 cellmorfologi och därmed sannolikt behöver förfining i klassificera parametrar när de appliceras på andra celler typer och/eller experimentella förhållanden. Ytterligare, i utökad tid-rätters experiment, de potentiella påverkan av cellmembranet förlängning förändringar på cellcykeln och celldöd behöver beaktas.
Det andra åberopa protokollet potentiella individualiserad ringer av examinator, som skulle kunna begränsa de analysreproducerbarhet på grund av mellan observatör variation. Antalet celler som undersöks för varje testgrupp som sannolikt övervinner en del av denna bias; specifikt, när 20 celler undersöks för varje analys. Införandet av flera individer att utföra förlängning kräver i en blindat föreslås för att mildra eventuella subjektiva anropande bias.
Slutligen, försiktighet bör iakttas när associera förändringar i cell filändelsen klass switch med förändringar i egenskaper för bifogad fil, där en förenklad version av vidhäftande egenskaper kan vara resultatet av förändrad preferens för fastsättning underskikt snarare än det förändrade affinitet för de testade underskikt. Koppling växeln cell filändelsen klass med migrering eller invasion i samband av olika extra-cellulära matrix komponenter kunde klargöra de observerade vidhäftningsegenskaper.
Sammanfattningsvis, ger det protokoll som beskrivs här en enkel och tillförlitlig metod för att mäta den funktionella betydelsen av cellmembranet filändelsen switch under olika förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Ohse Grant stiftelsen finansierat detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
