Summary
Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.
Abstract
Een methode is beschreven voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften in vaste bacteriën voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH kunt de meting van cel naar cel variabiliteit in exemplaaraantal van mRNA van genen van belang, evenals de subcellular locatie van de transcripten. De belangrijkste stappen zijn fixatie van de cultuur van de bacteriële cel, permeabilization van celmembranen en kruising van de afschriften van de doelgroep met sets van verkrijgbare korte fluorescently-geëtiketteerden oligonucleotide sondes. smFISH kunnen de beeldvorming van de transcripties van meerdere genen in dezelfde cel, met de beperkingen die worden opgelegd door de spectrale overlap tussen verschillende fluorescente markeringen. Na voltooiing van het protocol hieronder geïllustreerd, cellen kunnen worden gemakkelijk beeld met behulp van een combinatie met een camera geschikt voor lage-intensiteit fluorescentie Microscoop. Deze beelden, samen met de cel contouren verkregen uit segmentatie van fase contrast frames, of uit het celmembraan kleuring, toestaan dat de berekening van de mRNA kopie nummer verdeling van een steekproef van cellen met behulp van open-source of aangepaste-geschreven software. De hier beschreven labeling methode kan ook worden toegepast op afbeelding chat-kopieën met de wederopbouw van stochastische optische microscopie (STORM).
Introduction
Onzekerheden is een fundamentele en onvermijdelijk aspect van genexpressie en geeft aanleiding tot cel heterogeniteit1, zowel op het niveau van afschriften en eiwitten2,3. Kwantificeren van de variabiliteit tussen de cellen onder welomschreven voorwaarden biedt een uniek venster in de fundamentele processen die ten grondslag liggen van genexpressie en de verordening. Een belangrijke bron van cel-cel heterogeniteit in bacteriën vindt plaats op het transcriptional niveau. De nummers van de transcript variëren niet alleen vanwege de onzekerheden van transcriptie, maar ook voor post-transcriptional processen zoals verordening door kleine RNAs en RNAases2. Unidirectioneel van het direct toegang tot deze heterogeniteit op een kwantitatieve manier is door fluorescently tagging afzonderlijke afschriften van een bepaald gen in smFISH. Deze methode kan de detectie en subcellular localisatie van bepaalde molecules van RNA in vaste, individuele bacteriecellen4. mRNAs zijn gekruist met een set van fluorescently-geëtiketteerden ~ 20 base-lange oligonucleotides, die zijn ontworpen om selectief te binden aan afschriften van belang5,6. Meerdere labeling zorgt voor detectie boven achtergrond fluorescentie en individuele mRNA moleculen als diffractie-limited vlekken onder een fluorescentie Microscoop7 (Zie Figuur 1). Er zijn andere benaderingen voor het labelen van mRNA moleculen, waarin de aanvullende oligomeren sondes voeren geconjugeerd haptens (b.v., biotine of Heksenkruid) die met behulp van secundaire fluorescently-geëtiketteerden verslaggever technieken8worden gedetecteerd.
Er zijn andere methoden die kwantitatieve informatie over afschriften, naast smFISH verschaffen. Sommigen, zoals de noordelijke vlek of kwantitatieve PCR, sonde van de bulk en dus het aantal exemplaren van mRNA, noch hun positie in afzonderlijke cellen kunnen meten. Deze methoden zijn dus niet geschikt om te kwantificeren van cel naar cel variabiliteit. Een recente beeld-gebaseerde techniek die het mogelijk maakt voor de kwantificering van zowel het exemplaaraantal van RNAs binnen cellen evenals hun intracellulaire locatie, genaamd multiplexed fout-robuuste fluorescentie in situ hybridisatie (MERFISH) ontwikkeld. MERFISH is gebaseerd op de toewijzing van een unieke barcode die bestaat uit een gedefinieerde combinatie van een vast aantal fluorescently-geëtiketteerden oligonucleotide sondes. Deze streepjescodes worden gelezen uit in opeenvolgende ronden van smFISH metingen, met photobleaching na elke ronde van hybridisatie, waardoor de doorvoer door twee ordes van grootte9,10. Deze techniek vereist een geautomatiseerde Vloeistofbehandeling systeem en het juiste ontwerp van de sonde set.
De combinatie van meerdere fluorescentie labeling van afzonderlijke afschriften, samen met roman super resolutie technieken zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)11, maakt een tienvoudige toename van de resolutie in de Subcellular Localisatie van afschriften. In de STORM zorgt een geschikte combinatie van fluorescent sondes en imaging buffer voor meerdere cycli van fluorescentie emissie per sonde molecuul (knippert). STORM kan ook worden gebruikt voor image E. coli transcriptome & genoom-brede ruimtelijke organisatie van RNA, observeren door gelijktijdig alle de transcripties van belang12labeling.
Alle methoden van de eencellige herzien boven zijn gebaseerd op imaging afschriften in vaste cellen. Vandaar, zij bieden niet alle informatie met betrekking tot de kinetische eigenschappen van afschriften binnen cellen. Volg afschriften in levende cellen13en kan mRNAs worden aangeduid door de fusie van het gen van belang zijn voor een matrix van bindende sites. Deze laatste worden vervolgens herkend door een RNA-bindende eiwit, zoals de bacteriofaag MS2 jas-eiwit, dat aan een fluorescente proteïne zoals de groen fluorescente proteïne (GFP)10,14,15is gesmolten.
Hier beschrijven we een methode voor het labelen van individuele mRNAs met een set van fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in smFISH proeven, met name in E. coli. Bovendien laten we zien dat het dezelfde labelschema mogen worden gebruikt voor STORM metingen met kleine wijzigingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sonde Design
Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van commercieel beschikbare oligonucleotide sondes al gelabeld met fluorophores. De sondes bestaan uit een set van specifieke opeenvolgingen complementair aan een doelwit mRNA, elke sonde wordt geconjugeerd met een enkel fluorescerende molecuul. Anderzijds is het fluorescente markeringen koppelen aan sondes, zoals elders beschreven5,16.
- Ontwerp smFISH sondes met behulp van de sonde Designer16 algoritme ontwikkeld door Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); sequenties van smFISH sondes gebruikt in dit manuscript staan in de tabel van materialen.
Opmerking: Het minimum aantal sondes in een set voor een opspoorbaar signaal is ~ 30. Het precieze aantal kan variëren volgens het gen van belang, met name als zeer korte afschriften worden gemeten. - Kies een kleurstof die de optische setup past (zie tabel van materialen).
Opmerking: De Cy3 kleurstof of een optisch gelijkwaardig kleurstof met een lage gevoeligheid voor foto-bleken wordt sterk aanbevolen. Een kandidaat voor het labelen van dual is Cy5 of een optisch gelijkwaardige kleurstof (zie tabel van materialen). Geschikte kleurstoffen voor STORM beeldvorming van gelabelde mRNA worden gekenmerkt door hun capaciteit voor meerdere cycli van fluorescentie emissie. Sommige smFISH-kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor STORM beeldvorming (zie tabel van materialen). Naar image twee (of meer) afschriften overeenkomt met verschillende genen in dezelfde cel staan, moet men kiezen oligonucleotide sondes geconjugeerd met kleurstoffen waarvan spectra weinig of geen overlapping hebben.
2. reagens voorbereiding
Opmerking: Het is belangrijk om te houden van de RNAse-gratis monsters met behulp van RNase-vrije verbruiksartikelen zoals gefilterde Pipetteer tips en buizen, en elke werkomgeving schoon te houden. Om te voorkomen dat de aantasting van de afschriften van de doelgroep, moeten alle reagentia gebruikt na cel fixatie nuclease-gratis (zie tabel van materialen) of diethylpyrocarbonate (DEPC)-behandeld en gesteriliseerd.
- Buffers voor smFISH
- Bereiden RNase-gratis 1 x PBS (phosphate buffered saline, oplossing met een fosfaat buffer concentratie van 0,01 M en een concentratie van het natriumchloride 0.154 m, (pH 7.4)). Verdun RNase-gratis 10 x PBS (zie tabel van materialen) in nuclease-vrij water (zie tabel van materialen) op een 1:10 v/v-verhouding.
- Alternatief bereiden DEPC-behandelde 1 x PBS.
- Bereiden RNase-gratis 2 x SSC (saline-Natriumcitraat buffer, 0.3 M NaCl in 0.03 M Natriumcitraat, (pH 7.0)). Verdun RNase-vrije 20 x SSC (zie tabel van materialen) in nuclease-gratis water bij een 1:10 v/v-verhouding.
- Als alternatief, het bereiden van 2 DEPC-behandeld x SSC.
- Bereiden RNase-gratis 1 x PBS (phosphate buffered saline, oplossing met een fosfaat buffer concentratie van 0,01 M en een concentratie van het natriumchloride 0.154 m, (pH 7.4)). Verdun RNase-gratis 10 x PBS (zie tabel van materialen) in nuclease-vrij water (zie tabel van materialen) op een 1:10 v/v-verhouding.
- Oligonucleotide sonde stamoplossing.
- Opnieuw het ontbinden van de gedroogde oligonucleotide sonde mix in 200 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) maken een sonde voorraad van 25 µM. Meng goed door pipetteren op en neer, en vervolgens vortex en centrifuge kort.
- Om te voorkomen bevriezen en ontdooien van de stockoplossing buis, moet u verschillende hoeveelheden van de stamoplossing, overeenkomt met het bedrag moeten worden gebruikt in een enkele experimentele uitvoeren. Opslaan van de stockoplossing bij-20 ° C of lager en beschermen tegen licht.
Opmerking: Een sonde set 5 nmol bieden maximaal 250 hybridisatie reacties.
- Hybridisatie buffer (naar aanleiding van Skinner et al. 7 ):
- Voeg 5 mL nuclease-gratis water toe tot een polypropyleen conische bodem-tube van 50 mL. 1 g dextran sulfaat toevoegen aan het water en los het door krachtige vortexing. Meng de inhoud in een roteerschudapparaat tot bubbels verdwijnen (~ 30 min).
- Voeg aan de oplossing 3,530 µL gedeïoniseerd formamide, 10 mg van E. coli tRNA, 1 mL 20 x SSC, 100 µL van 200 mM vanadyl-ribonucleoside complex en 40 µL van 50 mg/mL BSA. Breng het eindvolume tot 10 mL door toevoeging van water DEPC-behandeld of nuclease-gratis water en vortex de oplossing totdat het homogene.
Opmerking: Om te voorkomen dat bevriezen en ontdooien van de oplossing, maken verschillende hoeveelheden van de stamoplossing, overeenkomt met het bedrag moeten worden gebruikt in een enkele experimentele uitvoeren. Opslaan van de stockoplossing bij-20 ° C. Zorg ervoor dat laat de formamide warm tot kamertemperatuur alvorens de fles te openen. Verklein de achtergrond en wordt voorgesteld om het kalibreren van de concentratie van de optimale formamide (10-40% v/v-verhouding).
Let op: WAARSCHUWING! Formamide is zeer giftig en een bekende teratogen. Vermijd contact met ogen of huid, inademing of inslikken. Omgaan onder een zuurkast terwijl het dragen van een laboratoriumjas en beschermende handschoenen. - Het steriliseren van de oplossing in het passeren van een 0.22-µm filter. Houd in aliquots en opslaan bij-20 ° C tot één jaar.
- Bereiden van fixatie buffer (4,6% formaldehyde in 1 x PBS) door toevoeging van 37% formaldehyde (v/v) naar 1 x PBS (zie 2.1.1) op een 1:8 v/v-verhouding en vortex.
LET OP: WAARSCHUWING! Formaldehyde is zeer giftig en een bekend carcinogeen. Omgaan onder een zuurkast terwijl het dragen van een laboratoriumjas en beschermende handschoenen. - Was buffer voorbereiden smFISH (20% formamide in 2 x SSC) door toevoeging van gedeïoniseerd formamide aan 2 x SSC (ziepunt 2.1.2) naar een 1:4 v/v-verhouding en vortex.
- SmFISH imaging buffer voorbereiden door toevoeging van 5 mM cysteamine en zuurstof aaseters (7 µM glucose oxidase, 56 nM katalase en 10% glucose (g/v)) om te wassen van de buffer (20% formamide in 2 x SSC)
- Buffers voor STORM
- Bereiden Buffer A door toevoeging van 50 mM Tris-HCl en 10 mM NaCl nuclease-gratis water.
Opmerking: Winkel op RT jarenlang. - Bereiden Buffer B door toevoeging van 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl en 10% w/v glucose tot nuclease-gratis water.
Opmerking: Bewaren bij 4 ° C voor maximaal een jaar. - Bereiden MEA buffer door ontbinding van 77 mg cysteamine in 1 mL buffer A (maakt een oplossing van 1 M).
Opmerking: Het kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 maand. - Gloxy buffer bereiden door toe te voegen 8440 AU (willekeurige eenheden) glucose oxidase en 70,200 AU katalase tot 1 mL buffer A.
Opmerking: 50 x stockoplossing, maakt het voor 1 maand bij 4 ° C kan worden opgeslagen. - STORM imaging buffer voorbereiden door toevoeging van 50 mM van MEA buffer en 1 x Gloxy buffer voor buffer B.
Opmerking: De imaging buffer voor STORM is samengesteld uit 5 mM cysteamine, zuurstof aaseters (7 µM glucose-oxidase en 56 nM katalase) in 50 mM Tris met 10 mM NaCl en 10% glucose op pH 8,0. Voorbereiden voordat u imaging, kan het worden opgeslagen en gebruikt op RT voor ongeveer 2 h.
- Bereiden Buffer A door toevoeging van 50 mM Tris-HCl en 10 mM NaCl nuclease-gratis water.
3. voorbeeld fixatie
- Groeien van bacteriële cellen (bijvoorbeeld E.
Opmerking: Om te bepalen van de achtergrond als gevolg van niet-specifieke binding van de sondes, metingen in een stam waarin het gen van belang is verwijderd dienen te worden uitgevoerd, volgens de zelfde procedures (Zie Δ,galk in Figuur 1 en ΔsodB in Figuur 2).
Opmerking: Als de gekozen Microscoop geen fase contrast of differentiële interferentie contrast vermogens heeft, E. coli buitenste membranen kunnen gelabeld zijn met 2 μM lipofiele fluorescerende marker (zie tabel van materialen), die moet worden toegevoegd aan de bacteriële suspensie 20 min voorafgaand aan de fixatie17. Fixatie en verdere behandeling uitgevoerd zoals hieronder beschreven. Wees voorzichtig om te kiezen een fluorescerende marker hebben een verschillende emissie spectrum, te minimaliseren van de spectrale overlap met de label-sonde set.
4. monster Permeabilization
- Supernatant zeer zorgvuldig verwijderen. Gebruik kleine volume pipetten, indien nodig, voor het verwijderen van alle van de vloeistof buiten de pellet.
- Resuspendeer in 300 µL DEPC-behandeld water of nuclease-gratis water. Voeg 350 µL hoogwaardige absolute ethanol (99%) en meng voorzichtig door het omkeren van de buis. Voeg een ander 350 µL van ethanol en mix opnieuw tot een definitieve ethanol concentratie van 70% (v/v-verhouding).
LET OP: WAARSCHUWING! Ethanol is ontvlambaar. - Draaien van het monster met een buis rotator bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT), of bij 4 ° C's nachts. Monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot één week.
5. hybridisatie
- Pellet cellen door centrifugeren voor 7 min, 750 x g, 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof.
- Voeg 1 mL 20% buffer om de monsters te wassen en laat staan voor enkele minuten, of pipet te ontbinden de pellet volledig.
- Pellet cellen door centrifugeren voor 7 min, 750 x g 4 ° C.
- Verwijder het supernatant heel zachtjes door pipetteren. Gebruik kleine-volume pipetten indien nodig te verwijderen van alle van de vloeistof buiten de pellet.
- Voeg de sonde oligonucleotide stockoplossing op de kruising buffer aliquot ingesteld zodat de definitieve oligonucleotide concentratie 250 is nM; Vortex krachtig.
Opmerking: Men kan twee of meer verschillende doelgroepen mRNAs tegelijk in dezelfde cel label. Sonde sets van beide doelen toevoegen aan de hybridisatie buffer. Wees voorzichtig om te kiezen van kleurstoffen hebben verschillende spectra van de uitstoot tot een minimum beperken van de spectrale overlap (bvCy3 en Cy5). Zorg ervoor dat de monsters voor STORM imaging zijn gekruist met een sonde van de oligonucleotide instellen geconjugeerd met een geschikt kleurstof voor STORM (bijvoorbeeldin de tabel van materialen). - Schorten monsters (zie stap 5.4) in 50 µL hybridisatie buffer waarin de oligonucleotide sondes, terwijl het vermijden van de generatie van bubbels (de oplossing is zeer visceuze).
- Laat 's nachts monsters op een warm blok bij 30 ° C in het donker.
Opmerking: Na dit, monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal 6 maanden bij 4 ° C.
6. wassen
- Gebruik één nieuwe microcentrifuge tube voor elk monster naar afbeelding. Voeg 1 mL was buffer.
- 10-15 µL uit de gehybridiseerde monsters toevoegen aan de nieuwe buis waarin de was buffer en mix/vortex.
- Pellet cellen door centrifugeren voor 7 min, 750 x g bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof.
Opmerking: Verklein achtergrond en incubeer gedurende 1 h bij 30 ° C. - Wassen tweemaal meer (resuspendeer in 1 mL was buffer, centrifugeren en pellet verwijderen).
- Resuspendeer in 25 µL was buffer.
Opmerking: Teneinde een foto-bleken kunt toevoegen aan de was buffer een zuurstof opruiming systeem (2.6) om kleurstof stabiliteit in single-molecuul fluorescentie experimenten6te verbeteren.
7. bereiding van de monsters voor Imaging
Opmerking: Cellen moeten worden geïmmobiliseerd zodat de juiste beeldvorming onder een Microscoop fluorescentie en fase contrast. De volgende methoden kunnen worden gebruikt ter voorbereiding van de monsters waarin verschillende gezichtsveld image op verschillende vlakken die focal kan worden gemaakt.
- Voorbereiding van het agarose gel
- Voeg 150 mg agarose aan 10 mL 2 x SSC buffer. Voeg geen 2 x SSC aan agarose, of anders het zal niet goed oplossen.
- Magnetron voor 10-15 s telkens tot grote bubbels beginnen te vormen. Gereserveerd voor een paar minuten afkoelen.
- Plaats een scheitrechter siliconen frame op de dia, zodat de dia center blootgesteld blijft.
- Plaatsen van een 10 mm breed (1-2 mm dik) rigide ring in het midden van de dia en storting van een kleine hoeveelheid gel, voor verzegeling. Wacht een paar minuten daarvoor te verharden.
- Voeg meer gel totdat de vorm van een hoge koepel wordt gevormd. Wacht 10 min. voor het te verharden en verwijderen van de ring (met fijne pincet of een andere methode).
- ~ 10 μL van gewassen bacteriële cellen (zie 6.5) op de gel en de verbinding met een #0 dekglaasje aan dia storten.
- Bereiding van de monsters van de kamer voor smFISH
- U kunt ook (naar stap 7.1) monsters voor imaging te bereiden door het immobilizing van de gewassen bacteriële cellen (zie 6.5) op poly-D-lysine-gecoate glazen bodem wegwerp plastic petrischaaltjes.
- Incubeer de monsters in het donker, op kamertemperatuur, 's nachts voor visualisatie waarmee de hechting van de cellen aan de oppervlakte. Voor visualisatie keer wassen met wash buffer (. 5); Houd het monster nat met was buffer(2.5) of imaging buffer voor smFISH (2.6).
- Bereiding van de monsters van de kamer voor de STORM
- Monsters voorbereiden door STORM voor imaging op poly-D-lysine-gecoate glazen bodem wegwerp plastic petrischaaltjes.
- Incubeer de monsters in het donker, bij RT, 's nachts. Voor visualisatie wassen eens met was buffer voor smFISH (2.5); en voeg imaging buffer voor STORM (2.7.5).
8.Transcript visualisatie
- Het beeld van cellen met een breed-gebied fluorescentie Microscoop uitgerust met een gemotoriseerde stadium (zie tabel van materialen).
Opmerking: Voor het wijzigen van de STORM, cellen aangeduid met een staat van meerdere cycli van fluorescentie emissie kleurstof gebruiken. Afbeelding van het monster met behulp van de resolutie van 3D Super imaging systeem (b.v., zie tabel van materialen). - Gebruiken (aanbevolen) een 60-100 x N.A > 1.3 olie onderdompeling fase contrast objectief met een sterke lichtbron, zoals een kwik- of metaal halide lamp; LED-gebaseerde lichtbronnen worden ook aanbevolen.
- Gebruik een standaard CCD camera, ideaal voor laag-licht niveau beeldvorming plaats snelheid gekoelde (wij gebruiken een camera met 16 µm pixelgrootte) geoptimaliseerd (zie tabel van materialen).
Opmerking: Het gebruik van een gekoeld EMCCD (elektron te vermenigvuldigen charge gekoppeld apparaat) camera CCD camera is nodig om te verminderen van thermische ruis, waardoor de detectie, met name van afzonderlijke moleculen. - Gebruik filter ingesteld geschikt is voor de fluorophores gekozen.
- Om te bepalen naar behoren celbegrenzing, beelden van verschillende gezichtsveld in elk monster met fase contrast optiek of door labeling fluorescently de buitenste celmembraan te verwerven. Verwerven van afbeeldingen op verschillende focal vlakken (z-stack) voor alle kanalen (meestal 13 segmenten gescheiden door 250 nm worden genomen).
Opmerking: De gemotoriseerde fase van de Microscoop en de filter sets moet worden gecontroleerd door commerciële (zie tabel van materialen) of in-house software die een stapel van beelden in volgorde vangen kan.
9. de gegevensanalyse
- De afbeeldingsstapels omzetten in een geschikt formaat voor data-analyse.
- Schatten van het exemplaaraantal van het streefcijfer mRNA van de totale intensiteit van fluorescerende foci in de cel, in plaats van het tellen van discrete 'spots' zoals in de andere beschikbare protocollen.
- Beeldanalyse met open-sourcesoftware18 of met een op maat gemaakte programma uitvoeren. Zie voor details gegevens beeldvorming en analyse Skinner et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij uitgevoerd smFISH metingen van afschriften van de galK en sodB in cellen van E. coli . De transcripties werden gekruist met een aantal specifieke opeenvolgingen complementair aan de target-reeks, elke sonde wordt geconjugeerd met een enkel fluorescerende molecuul (zie tabel van materialen). Fluorescentie en fase contrast beelden van MG1655 wild-type E. coli stam (WT) of een JW0740 (Keio-collectie)19 galK-deleted stam (ΔgalK) werden blootgesteld aan 2 mM D-fucose worden weergegeven in figuur 1A en 1B. Cellen werden vastgesteld ten minste 3 uur na de blootstelling aan D-fucose. De panelen in figuur 1A (boven) Toon één frame uit 13, overeenkomt met de hoogte waarop cel contouren in focus zijn, die het niveau van galK inductie in reactie op variabele extracellulaire D-fucose concentraties vertegenwoordigen. Plekken binnen cellen in de beelden van de fluorescentie corresponderen met ofwel één of enkele galk afschriften en de bepaling van het transcript getal in elke cel wordt uitgevoerd door het kwantificeren van de gelokaliseerde fluorescentie. Tal van plekken worden gezien in de meeste cellen, wanneer 2 mM D-fucose wordt toegevoegd aan de bacteriële cultuur, overwegende dat een paar plekken te in het ontbreken van extracellulaire D-fucose zien zijn. In de stam van degalK Δ worden geen spots waargenomen op de achtergrond als verwachte. Oppervlak labelen met lipofiele fluorescerende marker is afgebeeld in figuur 1B (onder).
Bovendien, beeld we de afschriften van de sodB in E. coli bacteriecultuur gegroeid in LB medium in de logaritmische groeifase. Fluorescentie en fase contrast beelden van smFISH in WT of om een JW1648 (Keio-collectie)19 sodB-deleted stam (ΔsodB) worden weergegeven in figuur 2A. De panelen in figuur 2A (boven) Toon één frame uit 13, overeenkomt met de hoogte op welke cel contouren in focus zijn, die het niveau van sodBvertegenwoordigen. In de ΔsodB stam, worden geen spots waargenomen op de achtergrond, zoals verwachte.
De dezelfde culturen waren beeld door STORM (boven) en de grenzen van de cellen waren vastbesloten met oppervlak labelen met behulp van een lipofiele fluorescerende markering ter illustratie van de lokalisatie van sodB binnen de cellen. Kleuring van het membraan kan nauwkeurige positionering van afschriften in de cel (figuur 2B). De stam van desodB Δ werd genomen als het signaal van de achtergrond en om te bepalen van de minimale clustergrootte (Zie figuur 2B). Het gemiddelde transcriptie aantal smFISH2 en STORM is vergelijkbaar.
Figuur 1: effecten van D-fucose op galK transcripten gevisualiseerd met behulp van smFISH. (A) Top: smFISH beelden van fluorescentie van galK mRNA in individuele E. coli cellen. Een MG1655 wild-type stam (WT) of een JW0740 (Keio-collectie) galK -verwijderd stam (ΔgalK)19 werden geteeld met of zonder 2 mM D-fucose. De afschriften van de galK werden gekruist om aanvullende sondes geconjugeerd met een optisch gelijk aan Cy3 kleurstof (zie tabel van materialen). Bodem: hetzelfde gezichtsveld in fase contrast. (B) WT cellen werden gekweekt met of zonder 2 mM D-fucose als hierboven en gelabeld met 2 μM van een lipofiele membraan kleurstof (zie tabel van materialen) gedurende 20 minuten voorafgaand aan de fixatie. Top: fluorescentie afbeeldingen van galK mRNA met behulp van smFISH. Beelden werden genomen met een microscoop gecontroleerd door een commerciële software met behulp van een objectief 100 × N.A 1.45 olie onderdompeling fase contrast (zie tabel van materialen) en een EMCCD camera (zie tabel van materialen). De filters gebruikt werden zoals beschreven in de tabel van materialen. Een fase contrast beeld werd verworven gevolgd door een z-stack van 13 segmenten en 250 nm afstand van fluorescerende beelden met 2 s integratie tijd voor elk segment. Midden: hetzelfde gezichtsveld met fase contrast beeldvorming. Bodem: cellen aangeduid met lipofiele fluorescente markeringen, met passende filters wordt beschreven in de tabel van de materialen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Imaging van sodB afschriften aangeduid met de dezelfde sonde set in smFISH en STORM. (A) Top: smFISH beelden van fluorescentie van sodB mRNA in individuele E. coli cellen. Een MG1655 wild-type stam (WT) of een JW1648 (Keio-collectie) sodB -verwijderd stam (ΔsodB)19 waren gegroeid in LB medium. De afschriften van de sodB werden gekruist om aanvullende sondes geconjugeerd met een optisch gelijk aan Cy5 kleurstof (zie tabel van materialen). Bodem: hetzelfde gezichtsveld in fase contrast. (B) Overlay van fluorescerende moleculen (afzonderlijke gekleurde puntjes) vertaald door STORM (670 nm emissie) en een momentopname van celmembranen in het hetzelfde gezichtsveld. De cellen waren gemarkeerd met een lipofiele kleurstof, opgewekt met een laser argon op 488 nm bij 1% van de maximale kracht (0,05 kW/cm2) met een uitstoot piek bij 510 nm en beeld met de juiste filteren (zie tabel van materialen). WT en sodB cellen werden geteeld zoals hierboven beschreven en voorzien van een 2 μM lipofiele membraan kleurstof (zie tabel van materialen) gedurende 20 minuten voorafgaand aan de fixatie. Super resolutiebeelden met een commerciële Microscoop werden opgenomen (zie tabel van materialen). Afschriften voorzien van een kleurstof optisch gelijk aan Cy5 waren gelokaliseerd met behulp van een laser excitatie op 647 nm in een imaging buffer voor ONWEER. Beelden werden opgenomen met behulp van een 60 x, NB 1.2 water onderdompeling doelstelling (zie tabel van materialen) en een EMCCD camera (zie tabel van materialen) met winst vastgesteld op 50, frame rate op 50 Hz, en de maximale kracht van 647 en 405 nm lasers vastgesteldop 5 en 0,05 kW/cm2 , respectievelijk. Het totale aantal frames verworven was 8.000. Gegevens werd geanalyseerd met behulp van commerciële software (Zie materialen tabel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben gemeten in ons laboratorium het transcript aantal verschillende genen in E. coli cellen met behulp van de smFISH methode2. Kortom, deze procedure bestaat uit de volgende stappen: cel fixatie, permeabilization van membranen voor sonde penetratie, hybridisatie sonde, en proef de geschikt zijn met behulp van een standaard fluorescentie Microscoop. Deze procedure is gebaseerd op eerder gepubliceerde degenen met enkele wijzigingen6,7,16. Het is eerder gemeld dat smFISH vereist dat het aantal oligonucleotide sondes liggen in het bereik 48-72, met het oog op een signaal liggen ruim boven de achtergrond7. We hebben aangetoond dat dit nummer eigenlijk kleinere20, afhankelijk van de germinale genetische identiteit van belang, de optische setup en de specifieke experimentele omstandigheden kan zijn.
Elke sonde moet 17-22 nucleotiden lang, met een scheiding tussen sonde van ten minste twee nucleotiden en een GC-inhoud van ~ 45%, teneinde de gevolgen van niet-specifieke, uit doelsoort zijn bindend. Sommige sondes kunnen niet binden van een doel, en de algehele efficiëntie van bindend kan worden geoptimaliseerd door wijzigingen van de experimentele procedures zoals de voorwaarden voor fixatie en kruising21. Een belangrijke factor waarmee rekening moet worden gehouden is de keuze van fluorophores. Het is sterk aanbevolen om het label van de sondes met een kleurstof met lage gevoeligheid voor foto-bleken. Foto-bleken minimalisering kan worden bereikt door optimalisering van blootstelling tijden, verlichting bronnen en integratie tijden van Beeldacquisitie en door de toevoeging van een zuurstof opruiming systeem.
De mate van niet-specifieke binding gebeurtenissen moet worden beoordeeld door het uitvoeren van smFISH experimenten met cellen uit stammen in welke doelgroep genen zijn verwijderd, bijvoorbeeld van de Keio collectie19. Als het signaal van de achtergrond hoog is, het aantal en de duur van het wassen stappen moeten worden verhoogd, of cellen moeten worden geïncubeerd in was buffer bij 30 ° C gedurende 1 uur en dan tweemaal gewassen. Bovendien, verklein de achtergrond en wordt voorgesteld om het optimaliseren van de concentratie van formamide (10-40% v/v-verhouding) in de kruising en de buffers wassen. Verhoging van de concentratie van formamide vermindert niet-specifieke binding, maar kan ook een vermindering van de afhankelijkheid van sondes naar het doel mRNA. Tijdens de kruising stap is het belangrijk om het supernatant volledig; een verdunde hybridisatie buffer kan leiden tot verminderde efficiëntie labeling. Bovendien, moet doel RNAs lang genoeg om een goed gelokaliseerde plek boven achtergrond. Recente verbeteringen in de signaal-ruis verhouding en de bindende specificiteit door ruggengraat wijziging van de sondes nu maken het mogelijk om te detecteren kortere RNA fragmenten, zoals eukaryotische microRNAs of bacteriële kleine niet-coderende RNAs2, 10. het is raadzaam dat de gemiddelde exemplaaraantal verkregen door smFISH moet worden gevalideerd met kwantitatieve PCR7,16.
In dit manuscript hebben wij aangetoond dat deze methode kan worden aangepast met kleine wijzigingen aan het bestuderen van de lokalisatie van afschriften in E. coli met hogere optische resolutie met behulp van stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)11.
Kortom is smFISH een veelzijdige methode voor RNA verlichting waarmee de rechtstreekse meting van de variabiliteit van de cel in afschrift aantal en de lokalisatie van de afschriften van de doelgroep in de cel, in prokaryoten en eukaryoten. Het kwantitatieve informatie over de basisprocessen van genexpressie en kan gemakkelijk worden geïmplementeerd voor STORM imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van Israël Science Foundation 514415 (naar J.S.) en een subsidie van de BSF-NSF (MCB) 2016707 (voor J.S.). Steun van een Siegfried en Irma Ullman Professorial stoel (J.S.) wordt ook erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S.
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
