単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法
Summary
本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA 分子の定量化を可能にする可視化手法です。
Abstract
固定細菌エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光の使用のための個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書をラベル付けアルゴリズムを述べる。smFISH では、興味の遺伝子の mRNA のコピーの数の細胞間の可変性の測定として、転写産物の細胞内局在をことができます。主な手順は、細菌の細胞培養の固定、細胞膜の透過および市販の短い蛍光標識したオリゴヌクレオチド プローブのセットとターゲットの転写産物の交配です。smFISH は、異なる蛍光マーカー間スペクトルの重なりによって課された制限と同じ細胞の複数の遺伝子の転写産物のイメージングを許可できます。下図のプロトコルが完了した後、低輝度蛍光に適したカメラと組み合わせて顕微鏡を用いた細胞が容易にイメージ化します。位相コントラスト フレームの分割細胞膜が染色から得られたセルの輪郭と共に、これらのイメージは、オープン ソースまたはカスタム作成されたソフトウェアを使用して細胞のサンプルの mRNA のコピー数の分布の計算を許可します。ここで説明したラベリング法を確率論的光再建顕微鏡 (嵐) イメージを成績証明書に適用もできます。
Introduction
確率は遺伝子発現の基礎的、やむを得ない面であり、細胞多様性1、両方の成績証明書および蛋白質の2,の3レベルに上昇を与えます。明確に定義された条件の下でセル間変動の定量化は、遺伝子の発現とその制御の根底にある基本的なプロセスに、ユニークなウィンドウを提供しています。細菌における細胞多様性の 1 つの重要な源は、転写レベルで行われます。成績証明書番号は、転写、転写プロセス調節などにも確率のためだけではなくを小さな Rna と RNAases2によって異なります。定量的な方法で多様性に直接アクセスする方法の 1 つは、蛍光 smFISH のある特定の遺伝子の個々 の成績証明書を付けることです。この方法では、検出と特定の RNA の分子の細胞内局在性固定、個々 の細菌細胞4をことができます。利息5,6のトラン スクリプトに選択的に結合するように設計、蛍光標識 〜 20 拠点長のオリゴヌクレオチドのセットを持つ Mrna を交配します。複数のラベル付けにより、上記のバック グラウンド蛍光検出と個々 の mRNA 分子は、回折限界のスポットが蛍光顕微鏡7 (参照してください図 1) として表示されます。相補的なオリゴマー プローブが二次蛍光標識した記者のテクニック8を使用して検出されます共役の皮膚 (例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン) を運ぶ mRNA 分子の分類のための他のアプローチがあります。
SmFISH に加えて成績証明書についての定量的な情報を提供する他の方法があります。北など、いくつかのしみまたは量的な PCR の大部分をプローブし従って mRNA のコピーの数も個々 の細胞内での位置を測定できます。これらのメソッドは細胞間変動の定量化に適していません。呼ばれる、細胞内の場所と同様、両方の細胞内 Rna のコピー数の定量誤差に頑健な蛍光の in situハイブリダイゼーション (MERFISH) を多重化できる最近イメージ ベースの技術を開発しました。MERFISH は、蛍光標識したオリゴヌクレオチド プローブの固定数から定義された組み合わせから成る一意のバーコードの割り当てに基づいています。これらのバーコードで読み取られ、smFISH 測定の連続ラウンド、退色と各次の交配、それにより 2 桁の9,10によってスループットの向上のラウンドします。このテクニックは、自動液体処理システムおよびプローブ セットの適切な設計を必要とします。
確率光再建顕微鏡 (嵐)11など小説の超解像技術と個々 のトラン スクリプトの複数蛍光標識の組み合わせにより、十倍の解像度で、転写産物の細胞内局在。嵐、蛍光プローブとイメージングのバッファーの適切な組み合わせは、(点滅) プローブ分子あたりの蛍光性の放出の複数のサイクルをできます。嵐は、大腸菌トランスクリプトームのイメージし、関心12の同時にすべての転写産物の分類によって rna のゲノム広い空間組織を観察にも使えます。
上記のレビューすべての単一細胞方法は固定細胞の転写物をイメージングに基づいています。それ故に、彼らは細胞内での転写産物の動力学的性質に関する情報を提供しません。生きているセル13成績証明書に従う、Mrna を結合部位の配列への興味の遺伝子の融合によるラベルことができます。これらの後者は、バクテリオファージ MS2 のコート蛋白質、緑色蛍光タンパク質 (GFP)10,14,15などの蛍光タンパク質を融合したなどの RNA 結合蛋白質によって認識されます。
ここで大腸菌で特に蛍光標識 DNA プローブ、smFISH 実験で使用するためのセットを個々 の mRNAs をラベリングの手法について述べる。さらに、マイナーな修正と嵐測定用同じラベル付けスキームが紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
当研究室で smFISH メソッド2を使用してE. 大腸菌細胞の異なる遺伝子のコピー数で測定しました。簡単に言えば、この手順は次の手順で構成されています: セル固定、プローブの浸透を可能に膜の透過プローブの交配、そして標準的な蛍光顕微鏡を用いたイメージングのサンプルします。この手順は、いくつかの変更6,7,</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、(バッハ) にイスラエル科学技術振興財団助成金 514415 と (バッハ) に BSF NSF (MCB) グラント 2016707 によって支えられました。ジークフリートとイルマ ウルマン (バッハ) 教授の椅子はまた認めたからサポートします。
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda, ., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence “Turn-On” Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
