Summary
ويصف هذه المخطوطة أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) مع تحقيقات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. سمفيش هو أسلوب تصور يسمح الكشف المتزامن، والترجمة، والتقدير الكمي لواحد مرناً الجزيئات في الخلايا الفردية الثابتة.
Abstract
يتم وصف أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) في البكتيريا الثابتة للاستخدام في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. يسمح سمفيش قياس التغير خلية إلى خلية في عدد النسخ مرناً للجينات للفائدة، فضلا عن موقع سوبسيلولار للنصوص. الخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها هي تثبيت ثقافة الخلية البكتيرية، permeabilization أغشية الخلايا، والتهجين النصوص المستهدفة مع مجموعات من المسابر اليغنوكليوتيد المسمى فلوريسسينتلي القصيرة المتاحة تجارياً. يمكن أن تسمح سمفيش تصوير وقائع جينات متعددة في نفس الخلية، مع القيود التي فرضتها التداخل الطيفي بين علامات مضيئة مختلفة. وعقب انتهاء البروتوكول هو موضح أدناه، خلايا يمكن سهولة تصويرها استخدام مجهر مقترنة بكاميرا مناسبة للأسفار المنخفضة الكثافة. هذه الصور، جنبا إلى جنب مع ملامح الخلية التي تم الحصول عليها من تجزئة المرحلة التباين الإطارات، أو تلطيخ غشاء الخلية، السماح لحساب توزيع مرناً نسخة رقم عينة خلايا باستخدام برمجيات المصدر المفتوح أو كتب مخصصة. يمكن أيضا تطبيق الأسلوب وضع العلامات الموصوفة هنا لنسخ الصورة مع التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة).
Introduction
ستوتشاستيسيتي هو أحد جوانب الأساسية والتي لا يمكن تجنبها للتعبير الجيني ويؤدي إلى الخلية الخلية التغايرية1، سواء على مستوى النصوص والبروتينات2،3. التحديد الكمي للتفاوت بين الخلايا تحت ظروف محددة جيدا توفر نافذة فريدة من نوعها في العمليات الأساسية التي تكمن وراء التعبير الجيني ولائحته. واحد مصدرا هاما للخلية عدم التجانس في البكتيريا تجري على المستوى النسخي. تتباين أرقام نسخة ليس فقط بسبب ستوتشاستيسيتي للنسخ، ولكن أيضا لعمليات بوستترانسكريبشونال مثل تنظيم الكشف ورناسيس صغيرة2. طريقة واحدة للوصول مباشرة إلى هذا التباين بطريقة كمية علامات النصوص الفردية لجين معين فلوريسسينتلي في سمفيش. هذه المنهجية يسمح بالكشف عن والتعريب سوبسيلولار من جزيئات الحمض النووي الريبي خاصة في ثابتة، الخلايا البكتيرية الفردية4. يتم تهجين مرناس مع مجموعة من المسمى فلوريسسينتلي ~ 20 قاعدة طويلة النوكليوتيد التي تهدف إلى ربط بشكل انتقائي للمحاضر الحرفية للفائدة5،6. العلامات متعددة تضمن الكشف أعلاه الخلفية الفلورية، والفرد مرناً الجزيئات تظهر كبقع حيود محدودة تحت مجهر الأسفار7 (انظر الشكل 1). وهناك نهج أخرى لوصف جزيئات مرناً، التي تحمل تحقيقات تكميلية oligomer haptens مترافق (مثلاً، البيوتين أو ديجوكسيجينين) التي تم الكشف عنها باستخدام تقنيات مراسل الثانوي المسمى فلوريسسينتلي8.
وهناك أساليب أخرى توفر معلومات كمية عن النصوص، بالإضافة إلى سمفيش. بعضها، مثل الشمالي لطخة أو PCR الكمي، التحقيق الجزء الأكبر وهكذا يمكن قياس عدد نسخ مرناً لا موقفهم في الخلايا الفردية. ولهذه الأساليب ليست مناسبة لقياس التغير خلية إلى خلية. تم تطوير تقنية المستندة إلى الصورة الأخيرة التي تسمح للتقدير الكمي لعدد نسخ الكشف داخل الخلايا، فضلا عن موقعها داخل الخلايا، ودعا متعدد الأسفار خطأ قوية في الموقع التهجين (ميرفيش). ميرفيش يستند تعيين رمز شريطي فريد يتألف من مجموعة محددة من عدد محدد من المسابر اليغنوكليوتيد المسمى فلوريسسينتلي. يتم قراءة هذه الرموز الشريطية في جولات متتابعة من القياسات سمفيش، مع فوتوبليتشينج بعد كل جولة من التهجين، وبالتالي زيادة الإنتاجية بأوامر اثنين من حجم9،10. يتطلب هذا الأسلوب سائل الآلي التعامل مع النظام والتصميم السليم لمجموعة التحقيق.
يتيح الجمع بين عدة fluorescence تسمية النصوص الفردية، جنبا إلى جنب مع تقنيات رواية القرار عظمى مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)11، بزيادة عشرة إضعاف في القرار في سوبسيلولار ترجمة النصوص. في العاصفة، يسمح مزيج مناسب من المسابر الفلورسنت والمخزن المؤقت للتصوير لدورات متعددة من انبعاث الأسفار كل جزيء مسبار (وامض). كما يمكن استخدام العاصفة صورة الترنسكربيتوم كولاي ومراقبة منظمة الجينوم المنظومة المكانية من الجيش الملكي النيبالي، بوسم جميع وقائع الفائدة12في وقت واحد.
تستند كافة الأساليب وحيدة الخلية التي تم استعراضها أعلاه التصوير المحاضر في الخلايا الثابتة. ومن ثم فإنها لا توفر أية معلومات تتعلق بالخصائص الحركية للنصوص داخل الخلايا. متابعة المحاضر في الخلايا الحية13، يمكن أن تعتبرها مرناس انصهار الجينات التي تهم مجموعة من مواقع الربط. هذه الأخيرة هي ثم يقرها بروتين الحمض النووي الريبي ملزمة، مثل عاثية MS2 معطف البروتين، الذي هو تنصهر فيها بروتين فلوري مثل البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء)10،،من1415.
هنا يصف لنا طريقة لوسم مرناس الفردية مع مجموعة من المجسات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في التجارب سمفيش، ولا سيما في كولاي. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أنه يمكن استخدام نفس نظام وضع العلامات للقياسات العاصفة مع تعديلات طفيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-التحقيق في التصميم
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول المسابير اليغنوكليوتيد المتاحة تجارياً علامات تمييز بالفعل مع فلوروفوريس. المسابير تتكون من مجموعة من تسلسل معين مكملة لهدف مرناً، كل التحقيق يجري مترافق لجزيء فلوري واحد. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن إرفاق علامات مضيئة للتحقيقات، كما هو موضح في مكان آخر5،16.
- تحقيقات سمفيش التصميم باستخدام خوارزمية16 "مصمم التحقيق" وضعتها راج أرجون (van أووديناردين مختبر معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا)؛ تسلسل المسابر سمفيش المستخدمة في هذه المخطوطة المذكورة في الجدول للمواد.
ملاحظة: الحد الأدنى لعدد من تحقيقات في مجموعة لإشارة قابلة للاكتشاف هو ~ 30. قد تختلف العدد الدقيق وفقا للجين موضع الاهتمام، خاصة إذا كان يتم قياس نصوص قصيرة جداً. - اختر صبغة تناسب الإعداد الضوئية (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: صبغة Cy3 أو صبغ ما يعادل بصريا مع قابلية منخفضة لتبييض الصورة ينصح بشدة. هو مرشح للتسمية المزدوجة Cy5 أو أي ما يعادل بصريا صبغ (انظر الجدول للمواد). الأصباغ مناسبة لتصوير العاصفة من مرناً المسمى تتميز بقدرتها على دورات متعددة من الانبعاثات الأسفار. يمكن استخدام بعض الأصباغ سمفيش لتصوير العاصفة (انظر الجدول للمواد). الصورة في النصوص اثنين (أو أكثر) المقابلة لجينات مختلفة في نفس الخلية، واحدة ينبغي اختيار المسابر اليغنوكليوتيد مترافق بالأصباغ الأطياف التي قد تداخل قليلاً أو لا.
2-كاشف إعداد
ملاحظة: من المهم الاحتفاظ بعينات مجانية رناسي باستخدام خالية رناسي المواد الاستهلاكية مثل نصائح ماصة المصفاة وأنابيب، والحفاظ على أي بيئة عمل نظيفة. لتفادي تدهور النصوص المستهدفة، يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة بعد تثبيت الخلية خالية من نوكلاس (انظر الجدول للمواد) أو ديثيلبيروكاربوناتي (ديبك)-معاملة وتعقيمها.
- المخازن المؤقتة سمفيش
- تعد خالية من رناسي 1 x برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة، الحل مع تركيز 0.01 متر عازلة فوسفات وتركيز كلوريد الصوديوم 0.154 م، (الرقم الهيدروجيني 7.4)). تمييع خالية رناسي 10 x برنامج تلفزيوني (انظر الجدول للمواد) في خالية من نوكلياسي والمياه (انظر الجدول للمواد) في 01:10 نسبة v/v.
- بدلاً من ذلك إعداد معاملة ديبك 1 × برنامج تلفزيوني.
- تعد خالية من رناسي 2 x SSC (سترات الصوديوم المالحة المخزن المؤقت، وكلوريد الصوديوم م 0.3 في 0.03 م سترات الصوديوم، (pH 7.0)). تمييع خالية رناسي 20 x SSC (انظر الجدول للمواد) في المياه خالية من نوكلياسي في 01:10 نسبة v/v.
- بدلاً من ذلك، إعداد 2 تعامل ديبك x SSC.
- تعد خالية من رناسي 1 x برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة، الحل مع تركيز 0.01 متر عازلة فوسفات وتركيز كلوريد الصوديوم 0.154 م، (الرقم الهيدروجيني 7.4)). تمييع خالية رناسي 10 x برنامج تلفزيوني (انظر الجدول للمواد) في خالية من نوكلياسي والمياه (انظر الجدول للمواد) في 01:10 نسبة v/v.
- اليغنوكليوتيد المسبار حل الأسهم.
- إعادة حل الخليط مسبار اليغنوكليوتيد المجففة في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت الشركة المصرية للاتصالات (10 مم تريس-HCl، 1 مم يدتا، pH 8.0) لإنشاء مخزون مسبار من 25 ميكرومتر. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وثم دوامة وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز.
- لتجنب تجميد وذوبان الأنبوب الحل الأسهم، جعل مختبرين عدة الحل الأسهم، المقابلة للمبلغ المتوقع لاستخدامه في تشغيل تجريبي واحد. تخزين في حل الأسهم في-20 درجة مئوية أو أقل وحماية من الضوء.
ملاحظة: يمكن أن توفر مجموعة مسبار نمول 5 ردود فعل التهجين يصل إلى 250.
- المخزن المؤقت التهجين (عقب سكينر et al. 7 ):
- إضافة 5 مل نوكلاس خالية من الماء إلى أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية الشكل السفلي. أضف 1 غرام كبريتات ديكستران للماء وحله قبل فورتيكسينج قوية. خلط المحتويات في شاكر مداري حتى تختفي فقاعات (~ 30 دقيقة).
- إضافة إلى ميليلتر الحل 3,530 من منزوع ميثلامين، 10 ملغ من كولاي الحمض الريبي النووي النقال، 1 مل 20 × التعاون بين بلدان الجنوب، 100 ميليلتر من مجمع ريبونوكليوسيدي فاناديل 200 ملم وميليلتر 40 50 ملغم/مل جيش صرب البوسنة. يصل الحجم النهائي إلى 10 مل بإضافة ديبك معاملة المياه أو المياه خالية من نوكلياسي، ودوامه الحل حتى أنها متجانسة.
ملاحظة: لتجنب التجميد والذوبان من الحل، جعل مختبرين عدة الحل الأسهم، المقابلة للمبلغ المتوقع لاستخدامه في تشغيل تجريبي واحد. مخزن الحل الأسهم عند-20 درجة مئوية. تأكد من السماح ميثلامين الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح الزجاجة. للحد من الخلفية، ويقترح لمعايرة تركيز ميثلامين الأمثل (نسبة 10-40% v/v).
تنبيه: تحذير! ميثلامين شديدة السمية وتناسليا معروفة. تجنب ملامسة العينين أو الجلد أو الاستنشاق أو الابتلاع. التعامل مع ذلك تحت غطاء دخان أثناء ارتداء معطف مختبر وقفازات واقية. - تعقيم الحل بتمريره من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تبقى في مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية إلى سنة واحدة.
- إعداد التثبيت المخزن المؤقت (4.6% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني 1 x) عن طريق إضافة 37% فورمالدهيد (v/v) إلى برنامج تلفزيوني 1 x (انظر 2.1.1) v/v نسبة 1:8 ودوامه.
تنبيه: تحذير! الفورمالديهايد شديدة السمية ومسرطنة معروفة. التعامل مع ذلك تحت غطاء دخان أثناء ارتداء معطف مختبر وقفازات واقية. - إعداد المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي سمفيش (ميثلامين 20% في 2 x SSC) عن طريق إضافة ميثلامين منزوع إلى 2 x SSC (انظر 2.1.2) v/v نسبة 1:4 ودوامه.
- إعداد المخزن المؤقت للتصوير سمفيش بإضافة 5 مم سيستيميني والأكسجين الزبالين (7 ميكرومتر الجلوكوز أوكسيديز، 56 نانومتر الكاتالاز، والجلوكوز 10% (w/v)) لغسل المخزن المؤقت (ميثلامين 20% في 2 x SSC)
- المخازن المؤقتة للعاصفة
- إعداد المخزن المؤقت A عن طريق إضافة HCl تريس 50 و 10 ملم كلوريد الصوديوم إلى المياه خالية من نوكلاس.
ملاحظة: مخزن في RT لسنوات. - إعداد "المخزن المؤقت ب" بإضافة 50 مم تريس-HCl، 10 مم كلوريد الصوديوم، و 10% w/v الجلوكوز للمياه خالية من نوكلاس.
ملاحظة: مخزن في 4 درجات مئوية لتصل إلى سنة. - إعداد المخزن المؤقت لاتفاق بيئي متعدد الأطراف بحل سيستيميني 77 mg في 1 مل من المخزن المؤقت A (يجعل حل م 1).
ملاحظة: يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. - إعداد المخزن المؤقت جلوكسي بإضافة (وحدات التعسفي) الاتحاد الأفريقي 8,440 الجلوكوز أوكسيديز والمخزن المؤقت 70,200 كاتالاز الاتحاد الأفريقي لمل 1 ألف
ملاحظة: يجعل 50 س الحل الأسهم، يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. - إعداد المخزن المؤقت للتصوير للعاصفة بإضافة 50 مم من المخزن المؤقت لشركة طيران الشرق الأوسط و 1 × جلوكسي المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت ب
ملاحظة: المخزن المؤقت تصوير للعاصفة تتكون من 5 مم سيستيميني والأكسجين الزبالين (أوكسيديز الجلوكوز ميكرومتر 7 و 56 نانومتر كتالاز) في 50 ملم تريس مع 10 ملم كلوريد الصوديوم والجلوكوز 10 ٪ على درجة الحموضة 8.0. التحضير قبل التصوير، ويمكن تخزينها والمستخدمة في RT لحوالي 2 ح.
- إعداد المخزن المؤقت A عن طريق إضافة HCl تريس 50 و 10 ملم كلوريد الصوديوم إلى المياه خالية من نوكلاس.
3-نموذج التثبيت
- تنمو الخلايا البكتيرية (مثلاً، هاء
ملاحظة: لتحديد الخلفية بسبب الربط غير محددة التحقيقات، القياسات في سلالة تم حذف الجينات للاهتمام الذي ينبغي أن تجري، اتباع نفس الإجراءات (انظر Δجالك في الشكل 1 و Δسودب في الشكل 2).
ملاحظة: إذا لم يكن لديه المجهر المختارة التباين المرحلة أو قدرات التدخل التفاضلية على النقيض، يمكن المسمى كولاي الأغشية الخارجي مع 2 ميكرومتر محبتين علامة نيون (انظر الجدول للمواد)، التي ينبغي أن تضاف إلى تعليق 20 دقيقة قبل التثبيت17من البكتيريا. إنجاز التثبيت وتلقى المزيد من العلاج كما هو موضح أدناه. ويجب الحرص على اختيار علامة نيون وجود طيف انبعاث مختلفة، للتقليل من التداخل الطيفي مع مجموعة مسبار المسمى.
4-نموذج بيرميبيليزيشن
- إزالة المادة طافية بعناية فائقة. استخدام الماصات صغيرة الحجم، إذا لزم الأمر، لإزالة جميع السائل خارج بيليه.
- ريسوسبيند في 300 ميليلتر ديبك معاملة المياه أو المياه خالية من نوكلاس. إضافة درجة عالية ميليلتر 350 الإيثانول المطلق (99 ٪) وتخلط بلطف بعكس الأنبوب. إضافة آخر ميليلتر 350 الإيثانول والمزيج مرة أخرى، للوصول إلى تركيز إيثانول نهائي من 70% (نسبة v/v).
تنبيه: تحذير! الإيثانول قابل للاشتعال. - تدوير العينة مع المدورة أنبوبة 20 لفة في الدقيقة ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT)، أو عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قد يتم تخزين العينات عند 4 درجة مئوية إلى أسبوع واحد.
5-التهجين
- خلايا بيليه بالطرد المركزي لدقيقة 7، 750 س ز، 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية.
- أضف 1 مل 20% يغسل المخزن المؤقت للعينات وترك مكانة لعدة دقائق، أو ماصة لإذابة بيليه تماما.
- خلايا بيليه بالطرد المركزي لمدة دقيقة 7، في س 750 ز، 4 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية بلطف جداً من بيبيتينج. استخدام الماصات صغيرة الحجم إذا لزم الأمر لإزالة جميع السائل خارج بيليه.
- إضافة تعيين المسبار اليغنوكليوتيد حل الأسهم إلى قاسمة المخزن المؤقت التهجين حيث يكون تركيز اليغنوكليوتيد النهائي 250 نانومتر؛ الدوامة بقوة.
ملاحظة: واحد تسمية مرناس مستهدفة مختلفة اثنين أو أكثر في وقت واحد في نفس الخلية. إضافة مجموعات التحقيق من كلا الهدفين إلى المخزن المؤقت التهجين. ويجب الحرص على اختيار الأصباغ بعد مختلف أطياف الانبعاث للتقليل من التداخل الطيفي (مثلاً، Cy3 و Cy5). تأكد من أن العينات المقصود لتصوير العاصفة هي تهجين مع مسبار اليغنوكليوتيد تعيين مترافق مع صبغة مناسبة للعاصفة (مثلاً، في الجدول للمواد). - تعليق عينات (راجع الخطوة 5، 4) في 50 المخزن المؤقت التهجين ميليلتر يحتوي على مجسات اليغنوكليوتيد، مع تجنب توليد فقاعات (الحل لزج تماما).
- ترك عينات بين عشية وضحاها في كتلة ساخنة في 30 درجة مئوية في الظلام.
ملاحظة: بعد هذا، عينات قد تكون مخزنة لمدة تصل إلى 6 أشهر في 4 درجات مئوية.
6-الغسل
- استخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي جديد واحد لكل عينة للصورة. أضف 1 مل أغسل المخزن المؤقت.
- إضافة 10-15 ميليلتر من العينات المهجن إلى الأنبوب الجديد الذي يحتوي على المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، ومزيج/دوامة.
- خلايا بيليه بالطرد المركزي لمدة 7 دقائق، 750 غ س في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
ملاحظة: للحد من الخلفية، احتضانها ح 1 في 30 درجة مئوية. - تغسل مرتين أكثر (ريسوسبيند في 1 مل أغسل المخزن المؤقت والطرد المركزي وإزالة بيليه).
- ريسوسبيند في 25 ميليلتر يغسل العازلة.
ملاحظة: بغية الحد من تبييض الصورة واحد إضافة إلى المخزن المؤقت يغسل أكسجين مسح النظام (2.6) لتحسين الاستقرار صبغ في صف واحد-جزيء تجارب6.
7-إعداد العينات للتصوير
ملاحظة: الخلايا بحاجة إلى أن تكون معطلة من أجل السماح بتصوير السليم تحت مجهر الأسفار وعلى النقيض للمرحلة. يمكن استخدام الأساليب التالية لإعداد العينات التي يمكن تصويرها عرض لحقول مختلفة في مختلف الطائرات المحورية.
- إعداد [اغروس] هلام
- إضافة 150 ملغ [اغروس] إلى 10 مل 2 x SSC المخزن المؤقت. لا تقم بإضافة 2 x SSC على [اغروس]، وأﻻ فإنها سوف لا تذوب بشكل صحيح.
- الموجات الدقيقة عن 10-15 ثانية كل مرة حتى تبدأ فقاعات كبيرة في النموذج. جانبا لتبرد لبضع دقائق.
- ضع إطار سيليكون فصل على الشريحة حتى يظل مركز الشريحة المكشوفة.
- ضع حلقة جامدة على مستوى (1-2 مم) 10 ملم في وسط الشريحة وإيداع كمية صغيرة من هلام، للختم. انتظر لبضع دقائق لأنها تتصلب.
- إضافة هلام أكثر حتى يتم تشكيل شكل قبة عالية. انتظر 10 دقائق لذلك تصلب، وإزالة الطوق (باستخدام الملقط غرامة أو أي طريقة أخرى).
- إيداع ~ 10 ميكروليتر من غسلها الخلايا البكتيرية (انظر 6.5) على جل وختم مع شريحة ساترة #0.
- إعداد نموذج الدائرة سمفيش
- وبدلاً من ذلك (في الخطوة 7، 1) إعداد العينات للتصوير بشل حركة الخلايا البكتيرية غسلها (انظر 6.5) على الزجاج بولي-د-يسين-المغلفة أسفل المتاح أطباق بيتري البلاستيك.
- احتضان هذه العينات في الظلام، في درجة حرارة الغرفة، بين عشية وضحاها قبل التصور للسماح لالتصاق الخلايا إلى السطح. قبل التصور يغسل مرة واحدة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (-5)؛ الاحتفاظ بالعينة رطبة مع الغسيل buffer(2.5) أو تصوير المخزن المؤقت لسمفيش (2.6).
- إعداد نموذج الدائرة للعاصفة
- إعداد العينات للعاصفة للتصوير على الزجاج بولي-د-يسين-المغلفة أسفل المتاح أطباق بيتري البلاستيك.
- احتضان هذه العينات في الظلام، في الرايت، بين عشية وضحاها. قبل التصور يغسل مرة واحدة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي سمفيش (2.5)؛ وإضافة المخزن المؤقت للتصوير للعاصفة (2.7.5).
8.التصور نسخة
- صورة الخلايا مع مجهر الأسفار واسع المجال مجهزة بمرحلة إليه (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: لتعديل العاصفة، واستخدام الخلايا المسماة مع صبغة قادرة على دورات متعددة من الانبعاثات الأسفار. صورة العينة باستخدام نظام التصوير 3D القرار العظمى (مثلاً، انظر الجدول للمواد). - استخدام (مستحسن) 60-100 × N.A > النفط 1.3 الغمر مرحلة التباين الهدف العدسة مع مصدر ضوء قوي، مثل الزئبق أو مصباح هاليد معدني؛ ويوصي أيضا مصادر الضوء على أساس الصمام.
- استخدام معيار تبريد كاميرا CCD، الأمثل من الناحية المثالية للتصوير الإضاءة المنخفضة المستوى بدلاً من السرعة (نستخدم كاميرا بحجم بكسل ميكرومتر 16) (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: الاستخدام من امككد تبريد (إلكترون ضرب الجهاز المسؤول إلى جانب) كاميرا CCD كاميرا ضروري للحد من الضوضاء الحرارية الذي يمنع كشفها، لا سيما من جزيئات مفردة. - استخدام عامل تصفية مجموعات مناسبة فلوروفوريس اختياره.
- لتحديد بشكل صحيح حدود الخلية, الحصول على صور عرض لحقول مختلفة في كل عينة مع مرحلة التباين البصريات، أو بوصفها فلوريسسينتلي غشاء الخلية الخارجي. الحصول على الصور في مختلف الطائرات المحورية (z-المكدس) لجميع القنوات (عادة ما تكون مفصولة شرائح 13 250 نانومتر وتؤخذ).
ملاحظة: ينبغي أن تسيطر مرحلة يجهز المجهر ومجموعات التصفية عليها التجارية (انظر الجدول للمواد) أو البرامج الداخلية التي يمكن التقاط كومة من الصور في تسلسل.
9-بيانات التحليل
- تحويل رصات الصور بشكل ملائم لتحليل البيانات.
- تقدير عدد نسخ الهدف مرناً من مجموع شدة الفلورسنت البؤر في الخلية بدلاً من عد منفصلة 'البقع' كما هو الحال في غيرها من البروتوكولات المتوفرة حاليا.
- القيام بتحليل الصور مع برمجيات المصدر المفتوح18 أو مع برنامج المواصفات. للاطلاع على تفاصيل تصوير البيانات والتحليل انظر سكينر et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بتنفيذ قياسات سمفيش النصوص جالك وسودب في الخلايا كولاي . تم تهجين النصوص مع مجموعة من تسلسل معين مكملة لتسلسل المستهدفة، كل التحقيق يجري مترافق لجزيء فلوري واحد (انظر الجدول للمواد). الأسفار والمرحلة على النقيض من الصور من MG1655 البرية من نوع سلالة كولاي (WT) أو JW0740 (مجموعة كيو)19 حذف جالك سلالة (Δجالك) تعرضوا إلى 2 ملم د-فوكس مبينة في الشكل 1A و 1B. تم إصلاح خلايا على الأقل 3 ح بعد التعرض إلى د-فوكس. اللوحات في الشكل 1A (أعلى) إظهار إطار واحد من أصل 13، المقابلة للارتفاع التي معالم الخلية في التركيز، يمثل مستوى التعريفي جالك ردا على تركيزات د-فوكس خارج الخلية المتغيرة. تناظر البقع داخل الخلايا في الصور fluorescence أما النصوص جالك واحد أو عدد قليل، ويجري تحديد عدد المحاضر في كل خلية بالتحديد الكمي للأسفار المترجمة. وتعتبر بقع عديدة في معظم الخلايا، عند إضافة 2 مم د-فوكوسي لثقافة البكتيرية، بينما تعتبر بقع قليلة نظراً لعدم وجود الخلية د-فوكوسي. ولوحظت لا بقع في سلالةجالك Δ على الخلفية كما كان متوقعا. سطح الوسم بعلامة نيون محبتين يرد في الشكل 1 باء (أسفل).
وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصويرها المحاضر سودب في ثقافة كولاي البكتيرية نمت في المتوسط رطل في مرحلة النمو لوغاريتمي. كما يرد في الشكل 2 ألفالأسفار ومرحلة التباين الصور من سمفيش في وزن أو JW1648 (مجموعة كيو)19 حذف سودب سلالة (Δسودب). اللوحات في الشكل 2 أ (أعلى) إظهار إطار واحد من أصل 13، المقابلة للارتفاع في الخلية التي معالم في التركيز، وهو ما يمثل مستوى سودب. في سلالةسودب Δ، لوحظت لا بقع على الخلفية، كما كان متوقعا.
الثقافات نفسها تم تصويرها قبل العاصفة (أعلى) وتم تحديد حدود الخلايا مع سطح العلامات باستخدام علامة نيون محبتين لتوضيح توطين سودب داخل الخلايا. تلوين الغشاء يسمح تحديد المواقع الدقيقة للنصوص في الخلية (الشكل 2). واتخذ سلالةسودب Δ كإشارة الخلفية وتحديد حجم الكتلة الحد الأدنى (انظر الشكل 2). عدد المحاضر يعني سمفيش2 والعاصفة قابل للمقارنة.
رقم 1: آثار فوكوسي د على النصوص جالك تصور استخدام سمفيش- (أ) أعلى: الصور سمفيش من الأسفار جالك مرناً في فرادى كولاي الخلايا. عبئا البرية من نوع MG1655 (وزن) أو JW0740 (مجموعة كيو) جالك-حذف سلالة (Δجالك)19 قد نمت مع أو بدون مم 2 د-فوكس. تم تهجين المستنسخات جالك لتحقيقات تكميلية مترافق مع صبغة بصريا أي ما يعادل Cy3 (انظر الجدول للمواد). أسفل: نفس الحقول للعرض في المرحلة عالي التباين. (ب) كانت تزرع الخلايا WT مع أو دون 2 مم صبغ د-فوكس المسمى مع 2 ميكرومتر من غشاء محبتين والمذكورة أعلاه (انظر الجدول للمواد) لمدة 20 دقيقة قبل التثبيت. أعلى: صف الصور من جالك مرناً باستخدام سمفيش. الصور تم التقاطها باستخدام مجهر تسيطر برمجيات تجارية استخدام عدسة هدف المقابل مرحلة غمر 100 × N.A 1.45 نفط (انظر الجدول للمواد) وكاميرا امككد (انظر الجدول للمواد). وكانت عوامل التصفية المستخدمة كما هو موضح في الجدول للمواد. صورة تباين مرحلة اكتسب تليها z-كومة شرائح 13 وتباعد نانومتر 250 من الصور الفلورسنت مع الوقت التكامل s 2 لكل شريحة. الأوسط: نفس الحقول للعرض مع تصوير المرحلة-التباين. أسفل: الخلايا المسماة بعلامات نيون محبتين، مع عوامل التصفية المناسبة الموضحة في "الجدول المواد". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التصوير من سودب مجموعة النصوص المسمى بالتحقيق نفسه في سمفيش وعاصفة. (أ) أعلى: الصور سمفيش من الأسفار سودب مرناً في فرادى كولاي الخلايا. كانت تزرع سلالة البرية من نوع MG1655 (وزن) أو JW1648 (مجموعة كيو) سودب-حذف سلالة (Δسودب)19 في المتوسط رطل. تم تهجين المستنسخات سودب لتحقيقات تكميلية مترافق مع صبغة بصريا أي ما يعادل Cy5 (انظر الجدول للمواد). أسفل: نفس الحقول للعرض في المرحلة عالي التباين. (ب) تراكب الجزيئات الفلورسنت (النقاط الملونة الفردية) المترجمة بالعاصفة (670 نانومتر الانبعاثات) ولقطة أغشية الخلايا في نفس الحقل للعرض. تم تسمية الخلايا مع صبغة محبتين، متحمس مع ليزر أرجون في 488 نانومتر في 1% طاقة القصوى (0.05 كيلو واط/سم2) مع ذروة انبعاثات في 510 نانومتر وتصويرها بمناسبة تصفية (انظر الجدول للمواد). خلايا وزن و سودب كانت تزرع كما هو موضح أعلاه والمسمى مع 2 غشاء محبتين ميكرومترات صبغ (انظر الجدول للمواد) لمدة 20 دقيقة قبل التثبيت. وسجلت صور فائقة الدقة مجهر تجاري (انظر الجدول للمواد). النصوص المسمى مع صبغة بصريا أي ما يعادل Cy5 كانت المترجمة باستخدام ليزر إثارة في 647 نانومتر في مخزن مؤقت تصوير للعاصفة. وسجلت الصور استخدام 60 x، 1.2 غ الماء الغمر الهدف (انظر الجدول للمواد) وكاميرا امككد (انظر الجدول للمواد) مع الحصول على 50، الإطار معدل 50 هرتز، والطاقة القصوى من 647 و 405 نانومتر الليزر في 5 و 0.05 كيلو واط/سم2 ، على التوالي. وكان العدد الإجمالي لإطارات المكتسبة 8,000. تم تحليل البيانات باستخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول المواد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد قمنا بقياس في المختبر عدد نسخة من جينات مختلفة في الخلايا كولاي باستخدام الأسلوب سمفيش2. باختصار، هذا الإجراء يتكون من الخطوات التالية: تثبيت الخلية، permeabilization الأغشية للسماح لاختراق التحقيق، التحقيق في التهجين، وعينه التصوير باستخدام مجهر الأسفار قياسية. ويستند هذا الإجراء تلك المنشورة سابقا مع بعض التعديلات6،،من716. قيل سابقا أن سمفيش يتطلب أن عدد المجسات اليغنوكليوتيد تكمن في حدود 48-72، بغية تحقيق إشارة الكذب جيدا فوق الخلفية7. وقد أظهرنا أن هذا العدد قد يكون في الواقع أصغر20، تبعاً للتسلسل الجيني الاهتمام والإعداد بصري، وشروط تجريبية محددة.
يجب أن تكون كل مسبار النيوكليوتيدات 17-22 طويلة، مع فصل تحقيق المشترك بين اثنين على الأقل النيوكليوتيدات ومحتوى GC ~ 45%، من أجل الحد من الآثار غير محددة، إيقاف المستهدفة ملزمة. قد تفشل بعض المسابير لربط هدفا، ويمكن تحسين الكفاءة الكلية للربط بإدخال تعديلات على إجراءات تجريبية مثل شروط التثبيت والتهجين21. هو عامل مهم يجب أن يؤخذ في الاعتبار اختيار فلوروفوريس. فإنه ينصح بشدة لتسمية التحقيقات مع صبغة مع قابلية منخفضة لتبييض الصورة. يمكن تحقيق تدنية تبييض الصورة الأمثل لمصادر الإضاءة، التعرض مرات ومرات التكامل للحصول على الصور، وإضافة الأوكسجين مسح النظام.
وينبغي تقييم مدى أحداث غير محددة ملزمة بإجراء تجارب سمفيش مع خلايا من سلالات في التي تستهدف جينات يتم حذف، على سبيل المثال من مجموعة كيو19. إذا كانت إشارة أساسية عالية، وينبغي زيادة عدد ومدة الغسيل الخطوات، أو الخلايا ينبغي المحتضنة في المخزن المؤقت ليغسل في 30 درجة مئوية ح 1 وثم غسلها مرتين. وعلاوة على ذلك، يقترح خفض الخلفية، لتحسين تركيز ميثلامين (نسبة 10-40% v/v) في التهجين ومخازن المياه والصرف الصحي. زيادة تركيز ميثلامين يقلل الربط غير محدد، ولكن قد يقلل أيضا من ربط المسابير الهدف مرناً. أثناء الخطوة التهجين، من المهم إزالة المادة طافية بالكامل؛ المخزن مؤقت تهجين تمييع قد يؤدي إلى تناقص وسم الكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون الهدف الكشف طويلة بما فيه الكفاية من أجل الحصول على بقعة جيدا مترجمة أعلاه خلفية. التحسينات الأخيرة في إشارة إلى نسب الضوضاء وملزمة خصوصية من خلال تعديل العمود الفقري التحقيقات الآن جعل من الممكن الكشف عن الحمض النووي الريبي أقصر الأجزاء، مثل ميكرورناس حقيقية النواة أو البكتيرية صغيرة غير الترميز الكشف2، 10-نوصي بأنه يجب التحقق من عدد نسخ يعني الحصول على سمفيش مع7،PCR الكمي16.
وقد أظهرنا في هذه المخطوطة أنه يمكن تعديل هذا الأسلوب مع تغييرات طفيفة لدراسة ترجمة النصوص في كولاي مع الدقة البصرية أعلى باستخدام إعادة الإعمار البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)11.
وباختصار، سمفيش هو أسلوب تنوعاً لإنارة الجيش الملكي النيبالي الذي يسمح بقياس مباشر للتغير خلية في عدد نسخة وترجمة النصوص المستهدفة في الخلية، وفي حقيقيات النوى وبدائيات النوى. أنها توفر معلومات كمية عن العمليات الأساسية للتعبير الجيني ويمكن بسهولة تطبيق لتصوير العاصفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل منحة من "مؤسسة العلوم إسرائيل" 514415 (إلى ج. س.) وقوات أمن الحدود الهندية-جبهة الخلاص الوطني (المجلس) منحة 2016707 (ج. س.). دعم من سيغفريد وأولمان إيرما كرسي الأساتذة (إلى ج. س.) من المسلم به أيضا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
