Dette manuskriptet beskriver en metode for merking personlige budbringer RNA (mRNA) utskrifter med fluorescently-merket DNA sonder, for bruk i enkelt-molekylet fluorescens i situ hybridisering (smFISH) eksperimenter i E. coli. smFISH er en visualisering metode som tillater samtidig deteksjon, lokalisering og kvantifisering av enkelt mRNA molekyler i fast enkeltceller.
En metode er beskrevet for merking personlige budbringer RNA (mRNA) utskrifter i fast bakterier for bruk i enkelt-molekylet fluorescens i situ hybridisering (smFISH) eksperimenter i E. coli. smFISH lar måling av celle-til-celle variasjon i mRNA kopien antall gener rundt, samt subcellular plasseringen av transkripsjoner. De viktigste trinnene involvert er fiksering av bakteriell cellekultur, permeabilization av celle membraner og blanding av målet transkripsjoner med sett av kommersielt tilgjengelig kort fluorescently-merket oligonucleotide sonder. smFISH kan tillate avbilding av utskrifter av flere gener i samme celle, med begrensninger pålagt av spectral overlappingen mellom forskjellige fluorescerende markører. Etter at protokollen nedenfor, celler kan lett avbildes bruker et mikroskop kombinert med et kamera som er egnet for lav intensitet fluorescens. Disse bildene, med cellen konturer innhentet fra segmentering av fase kontrast rammer, eller cellemembranen flekker, tillate beregningen av mRNA kopi nummer fordelingen av celler med åpen kildekode eller tilpasset skrevet. Merking metoden beskrevet her kan også brukes på bildet utskrifter med Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM).
Stochasticity er en grunnleggende og uunngåelig del av genuttrykk og gir opphav til celle-celle heterogenitet1, både på nivå utskrifter og proteiner2,3. Kvantifisere variasjon mellom celler under veldefinerte forhold tilbyr et unikt vindu i den grunnleggende prosesser underlie genuttrykk og dens regulering. En viktig kilde til celle-celle heterogenitet i bakterier foregår på transcriptional nivå. Transkripsjon tall varierer skyldes stochasticity transkripsjon, men også post-transcriptional prosesser som regulering av små RNAs og RNAases2. En måte å direkte tilgang til denne heterogene i en kvantitativ måte er ved fluorescently merking personlige utskrifter med et gitt i smFISH. Denne metoden gjør at gjenkjenning og subcellular lokalisering av bestemt RNA molekyler i faste, personlige bakterieceller4. mRNAs er hybridiserte med en fluorescently-merket ~ 20 base lange oligonucleotides, som er utformet for å binde selektivt til transkripsjoner interesse5,6. Flere merking sikrer gjenkjenning over bakgrunnen fluorescens og mRNA molekyler vises som Diffraksjon-begrenset flekker under en fluorescens mikroskop7 (se figur 1). Det finnes andre metoder for merking mRNA molekyler, som utfyllende oligomer sonder bære konjugert kan (f.eks, biotin eller digoxigenin) som blir funnet ved hjelp av sekundære fluorescently-merket reporter teknikker8.
Det finnes andre metoder som gir kvantitativ informasjon om transkripsjoner, i tillegg til smFISH. Noen, som nordlige blot eller kvantitativ PCR, undersøke bulk og dermed kan måle verken antall mRNA Kopier eller deres posisjon i enkeltceller. Derfor er disse metodene ikke egnet til å kvantifisere celle til celle variasjon. En siste bilde-basert teknikk som gir mulighet for kvantifisering av både kopien antall RNAs i cellene samt deres intracellulær sted, kalt multiplekset feil-robust fluorescens i situ hybridisering (MERFISH) har blitt utviklet. MERFISH er basert på tildeling av en unik strekkode består av en definert kombinasjon fra et bestemt antall fluorescently-merket oligonucleotide sonder. Disse strekkodene leses i sekvensielle runder med smFISH mål, med photobleaching etter hver runde av hybridisering, og dermed øke gjennomstrømming av to størrelsesordener9,10. Denne teknikken nødvendiggjør en automatisert væske system og skikkelig utformingen av sonden settet.
Kombinasjonen av flere fluorescens merking av personlige transkripsjoner, sammen med romanen super-oppløsning teknikker som Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)11, gjør en ti-fold økning i oppløsning i den subcellular lokalisering av transkripsjoner. I STORM gir en passende kombinasjon av fluorescerende sonder og tenkelig buffer flere sykluser av fluorescens utslipp per sonde molekyl (blinker). STORMEN kan også brukes til image E. coli transcriptome og observere genomet hele romlig organisering av ved merking samtidig alle utskrifter av rundt12.
Alle encellede metodene nevnt over er basert på imaging utskrifter i fast celler. Derfor gir de ikke informasjon om egenskapene kinetic utskrifter i celler. For å følge utskrifter i lever celler13, kan mRNAs merkes av sammensmeltingen av genet av interesse for en rekke bindende områder. Disse sistnevnte er så anerkjent av et RNA-bindende protein, som bacteriophage MS2 pels protein, som er sammensmeltet med et fluorescerende protein som grønne fluorescerende protein (GFP)10,14,15.
Her beskriver vi en metode for merking personlige mRNAs med en fluorescently-merket DNA sonder, for bruk i smFISH eksperimenter, spesielt i E. coli. Videre viser vi at samme merking ordningen kan brukes for STORM målinger med mindre modifikasjoner.
Vi har målt i vårt laboratorium transkripsjon antall ulike gener i E. coli celler ved hjelp av smFISH metoden2. I korthet, denne prosedyren består av følgende trinn: cellen fiksering, permeabilization av membraner å tillate sonde penetrasjon, undersøke hybridisering og prøve bildevisning standard fluorescens mikroskop. Denne fremgangsmåten er basert på tidligere publiserte de med noen modifikasjoner6,7,<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Israel Science Foundation stipend 514415 (til js) og BSF-NSF (kalt MCB) stipend 2016707 (til js). Støtte fra en Siegfried og Irma Ullman professorkompetanse stol (til js) er også anerkjent.
Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
#0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
Hot block | M.R.C | ||
Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
Probe Sequence for galK mRNA: | |||
gtgttttttctttcagactc | |||
tagccaaatgcgttggcaaa | |||
ctgaatggtgtgagtggcag | |||
caccaatcaaattcacgcgg | |||
acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
tgataatcaatcgcgcaggg | |||
gtggtgcacaactgatcacg | |||
acgcgaactttacggtcatc | |||
gctgattttcataatcggct | |||
gcatcgagggaaaactcgtc | |||
gttttcatgtgcgacaatgg | |||
cacgccacgaacgtagttag | |||
ttacgcagttgcagatgttt | |||
tccagtgaagcggaagaact | |||
tgctgcaatacggttccgac | |||
gtccagcggcagatgataaa | |||
tgaccgttaagcgcgatttg | |||
agcctacaaactggttttct | |||
gcggaaattagctgatccat | |||
aaggcatgatctttcttgcc | |||
cagtgagcggcaatcgatca | |||
tgggcatggaaactgctttg | |||
gatgatgacgacagccacac | |||
gggtacgtttgaagttactg | |||
gtgttgtattcgctgccaac | |||
ggtttcgcactgttcacgac | |||
tggctgctggaagaaacgcg | |||
ttcaatggtgacatcacgca | |||
catgcgcaacagcgttgaac | |||
ggcgttttcagtcagtatat | |||
atacgtttcaggtcgccttg | |||
tgagactccgccatcaactc | |||
gaaatcatcgcgcatagagg | |||
caatttgcggcacggtgatt | |||
ttgacgatttctaccagagt | |||
acctttgtcgccaatcacag | |||
ggatcagcgcgacgatacag | |||
atattgttcagcgacagctt | |||
gtctctttaatacctgtttt | |||
ctccttgtgatggtttacaa | |||
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
gtgttttttctttcagactc | |||
tagccaaatgcgttggcaaa | |||
ctgaatggtgtgagtggcag | |||
caccaatcaaattcacgcgg | |||
acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
tgataatcaatcgcgcaggg | |||
gtggtgcacaactgatcacg | |||
acgcgaactttacggtcatc | |||
gctgattttcataatcggct | |||
gcatcgagggaaaactcgtc | |||
gttttcatgtgcgacaatgg | |||
cacgccacgaacgtagttag | |||
ttacgcagttgcagatgttt | |||
tccagtgaagcggaagaact | |||
tgctgcaatacggttccgac | |||
gtccagcggcagatgataaa | |||
tgaccgttaagcgcgatttg | |||
agcctacaaactggttttct | |||
gcggaaattagctgatccat | |||
aaggcatgatctttcttgcc | |||
cagtgagcggcaatcgatca | |||
tgggcatggaaactgctttg | |||
gatgatgacgacagccacac | |||
gggtacgtttgaagttactg | |||
gtgttgtattcgctgccaac | |||
ggtttcgcactgttcacgac | |||
tggctgctggaagaaacgcg | |||
ttcaatggtgacatcacgca | |||
catgcgcaacagcgttgaac | |||
ggcgttttcagtcagtatat | |||
atacgtttcaggtcgccttg | |||
tgagactccgccatcaactc | |||
gaaatcatcgcgcatagagg | |||
caatttgcggcacggtgatt | |||
ttgacgatttctaccagagt | |||
acctttgtcgccaatcacag | |||
ggatcagcgcgacgatacag | |||
atattgttcagcgacagctt | |||
gtctctttaatacctgtttt | |||
ctccttgtgatggtttacaa |