Dette paper præsenterer en metode, der involverer syntese og karakterisering af monocyt-targeting peptid amphiphile micelles og de tilsvarende undersøgelser for at teste for biokompatibilitet og micelle evne til at binde til monocytter.
Åreforkalkning er en stor bidragyder til hjerte-kar-sygdom, den hyppigste årsag til dødsfald på verdensplan, som hævder 17,3 millioner liv hvert år. Åreforkalkning er også den hyppigste årsag til pludselig død og myokardieinfarkt, iværksat af ustabile plaques, som brud og occlude blodkar uden advarsel. Aktuelle imaging modaliteter kan ikke skelne mellem stabil og ustabil plaques, at briste. Peptid amphiphiles micelles (PAMs) kan overvinde denne ulempe, da de kan ændres med en bred vifte af målretning fraspaltning, der bindes specifikt til sygt væv. Monocytter har vist sig at være tidlige markører for åreforkalkning, mens store ophobning af monocytter er forbundet med plaques tilbøjelige til at briste. Derfor, nanopartikler, der kan målrette monocytter kan anvendes til at skelne forskellige stadier af åreforkalkning. Med henblik herpå, her, vi beskriver en protokol for forberedelse af monocyt-targeting PAMs (monocyt chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs samles selv gennem syntese under milde forhold til form nanopartikler af 15 nm i diameter med nær neutral overflade afgift. In vitro, PAMs fandtes for at være biokompatible og havde en høj bindende affinitet for monocytter. De metoder, der beskrives heri viser lovende for en bred vifte af applikationer i åreforkalkning samt andre inflammatoriske sygdomme.
Hjerte-kar-sygdomme er fortsat for at være de førende dødsårsager globalt med ca 17,3 millioner dødsfald på verdensplan1. Hjerte-kar-sygdomme er bidraget af åreforkalkning, en tilstand, hvor plaques ophobes i arterier, derved hæmmende blod og ilt flow til cellerne i kroppen2,3. Progression af aterosklerose indebærer fortykkelse og hærdning af arterierne ved en inflammatorisk respons, uregelmæssige lipid metabolisme og plaque oprustning, fører til plaque brud og myokardieinfarkt4,5. Endotelceller express cytokiner og vedhæftning molekyler, som omfatter MCP-1, der binder sig til C-C chemokine receptor (CCR2) fundet på overfladen af monocytter6,7,8. Oxideret kolesterol konverterer monocytter til makrofager i den tidlige fase af plaque dannelse, som forstærker den inflammatoriske reaktion i regionen og fører til vævsskade og dannelse af ustabile eller sårbare plaques9, 10.
Traditionelt, er åreforkalkning evalueret ved at vurdere luminale stenose af anatomiske imaging bruge angiografi eller ultralyd11,12. Men disse metoder kan kun bestemme svær forsnævring af arterievæggen og ikke den tidlige fase af åreforkalkning, som indledende plaque vækst forårsager arteriel remodeling at opretholde arterie størrelse og blood flow hastighed12,13, 14. Derfor underrepresent angiograms åreforkalkning prævalens. Derudover noninvasive billedbehandling teknikker som single photon emission beregnet tomografi, positron emissions tomografi og magnetisk resonans imaging har for nylig blevet brugt til at karakterisere plaque morfologi, som de kan give oprindelige detaljer og karakterisering af plaques. Men disse metoder er ofte begrænset af manglen følsomhed, rumlige opløsning, eller kræver brug af ioniserende stråling, gør imaging plaque progression på forskellige stadier langt mere udfordrende15,16, 17. En billeddannelse levering system, der ville specifikt at identificere plaques på forskellige stadier af åreforkalkning er stadig skal udvikles.
Nanopartikler har vist sig for at være en spirende platform for i vivo plaque målretning og diagnostik18,19,20,21. Især er PAMs fordelagtig på grund af deres kemiske diversitet og evnen til at rumme en række fraspaltning, kompositioner, størrelser, figurer og overflade functionalization22. Peptid amphiphiles (PAs) består af en hydrofil, peptid “headgroup” knyttet til en hydrofobe hale, som er typisk lipider; denne amphiphilic struktur giver selvsamlende kapaciteter og giver mulighed for en multivalent visning af peptider på overfladen af partikel22,23,24. Peptid headgroups kan påvirke partikel form gennem foldning og brint limning mellem peptider25. Peptider, fold gennem β-plade interaktion har vist sig at danne aflange micelles, mens α-spiralformet bekræftelse kan danne både sfærisk og aflange micelles22,23,24, 25,26,27. Polyethylenglycol (PEG) linkers, som skjold overflade afgiften af peptid kan placeres mellem den hydrofile peptid og den hydrofobe hale af PAMs, forbedre tilgængeligheden af nanopartikler i systemisk cirkulation28, 29 , 30 , 31. PAMs er ligeledes fordelagtig, fordi de er biokompatible og har vist sig at have en bred vifte af applikationer32,33. Micelles vandopløselighed tilbyder en fordel over andre nanopartikel-baseret systemer såsom visse polymere nanopartikler, der ikke er opløseligt i vand og suspenderes i solubilizers for injektioner34. Derudover gør mulighed for at oprette PAMs at demontere som svar på en specifik stimuli PAMs en attraktiv kandidat til kontrolleret intracellulære drug delivery35.
Ved at binde til CCR2 receptoren og akkumulere i aortabuen, var PAMs tidligere udviklet til monocyt målretning til at overvåge forskellige stadier af aterosklerotiske læsioner i aorta9. I ApoE– / – mus, monocyt akkumulering øges proportionalt til plaque progression36. Det konstateredes desuden, at patienter med brud-tilbøjelige, sene plaques indeholder større mængder af monocytter37. Ændring af PAMs at indarbejde MCP-1 er derfor nyttigt, fordi det giver mulighed for større målretning specificitet og differentiering mellem tidlige – og sene aterosklerotiske læsioner. Disse proof-of-concept undersøgelser også bekræftet at PAMs er sikker nok til at blive brugt pre-clinically og er ryddet renally38. Da monocytter og inflammation er karakteristiske for andre sygdomme, har MCP-1 PAMs potentiale til at blive anvendt til terapeutiske og diagnostiske programmer i andre sygdomme ud over åreforkalkning8,39,40 , 41.
Heri, rapporterer vi fabrikation af yderst skalerbar og selvsamlede MCP-1 PAMs, som viste partiklen optimal størrelse, overflade afgift og selektiv målretning til monocytter for forøget tænkelig andragender i åreforkalkning.
MCP-1 PAMs er en lovende molekylær billeddannelse platform, bestående af en hydrofil målretning peptid og hydrofobe hale, der driver nanopartikel selvsamlede karakter. Denne monocyt-targeting micelle kan fremstilles ved simpel syntese og rensning trin af MCP-1 peptid og DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs har mange gavnlige egenskaber for i vivo molecular imaging som deres samlesæt under milde betingelser, iboende bionedbrydelighed og strukturelle og kemiske mangfoldighed giver mulighed for indarbejdning af andre bi…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende den finansielle støtte fra University of Southern California, National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli og Edythe bred Innovation Award og Larsen Whittier Foundation Non-kræft Translationel forskning Award givet til Quraishy. Forfatterne takke centrum for Elektron Mikroskopi og mikroanalyser, Center of Excellence i NanoBiophysics, Center of Excellence for Molekylær karakterisering og Translational Imaging Center ved University of Southern California for bistand i instrumental opsætninger.
1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |