Этот документ представлен метод синтеза и характеристика ориентации Моноцит пептидные Амфифильность мицелл и соответствующий assays для проверки на биосовместимость и мицеллы возможность связывать моноцитов.
Атеросклероз является крупный вклад сердечно-сосудистых заболеваний, ведущей причиной смерти во всем мире, который утверждает 17,3 миллиона человеческих жизней ежегодно. Атеросклероз является также основной причиной внезапной смерти и инфаркт миокарда, подстрекаемые нестабильной бляшки, которые разорвать и конторах кровеносного сосуда без предупреждения. Текущие изображения формы не может различать стабильного и нестабильного бляшки, которые разрыву. Пептидные amphiphiles мицелл (ПАМС) может преодолеть этот недостаток, как они могут быть изменены с различными ориентации постановление, которые связывают специально для пораженной ткани. Моноциты было показано, быть ранних маркеров атеросклероза, в то время как большие накопления моноцитов ассоциируется с металлическими пластинками, склонных к разрыву. Следовательно наночастицы, которые можно ориентировать моноцитов может использоваться для дискриминации различных стадиях атеросклероза. С этой целью здесь, мы описать протокол для подготовки Моноцит ориентация ПАМС (Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) ПАМС). MCP-1 ПАМС собираются самостоятельно через синтез условиях мягкая форма наночастиц 15 Нм в диаметре с рядом нейтральных поверхности заряда. В пробирке, пам были найдены быть биосовместимых и имеют высокое сродство для моноцитов. Методы, описанные здесь обещают для широкого круга приложений, атеросклероз, а также других воспалительных заболеваний.
Сердечно-сосудистые заболевания остаются ведущих причин смерти во всем мире с приблизительно117,3 миллиона случаев смерти во всем мире. Сердечно-сосудистые заболевания являются представленные атеросклероза, условие, в котором металлические пластинкы накапливаться в артерий, тем самым блокируя крови и поток кислорода в клетки тела2,3. Прогрессирование атеросклероза предполагает утолщение и твердеть артерий воспалительной реакции, нерегулярные липидного обмена и наращивания зубного налета, ведущих к доска разрыв и инфаркт миокарда4,5. Эндотелиальные клетки Экспресс цитокинов и сцепления молекул, которые включают MCP-1, который привязывает к C-C хемокиновых рецепторов (CCR2), нашли на поверхности моноциты6,,78. Окисленного холестерина преобразует моноцитов в макрофаги на ранней стадии формирования зубного налета, который усиливает воспалительный процесс в регионе и приводит к повреждения тканей и формированию нестабильных или уязвимых бляшек9, 10.
Традиционно атеросклероз оценивается путем оценки Люминал стенозом анатомических изображений с помощью ангиографии или УЗИ11,12. Однако, эти методы может только определить сужение тяжелой артериальной стенки и не на ранней стадии атеросклероза, как первоначальный налета роста вызывает артериальной ремоделирования поддерживать размер артерии и крови поток скорость12,13, 14. Таким образом ангиограмм underrepresent распространенности атеросклероза. Кроме того, неинвазивные методы визуализации таких выбросов одиночных фотонов компьютерная томография, позитронно-эмиссионная томография и магнитно-резонансной томографии, недавно были использованы характеризовать налета морфологии, как они могут обеспечить начальной детали и характеристика бляшек. Однако эти условия часто ограничивается отсутствием чувствительности, пространственное разрешение, или требуют использования ионизирующего излучения, делая изображений прогрессии налета на разных стадиях гораздо более сложной,15,16 17. Тепловизионная система доставки, которая бы конкретно определить бляшек на разных стадиях атеросклероза предстоит разработать.
Наночастицы показали быть возникающих платформы в vivo доска ориентации и диагностика18,19,20,21. В частности из-за их химического разнообразие и возможность размещения различных постановление, композиции, размеров, форм и поверхности функционализации22выгодны пам. Пептидные amphiphiles (ССА) состоят из гидрофильные, пептидный «headgroup» придают гидрофобным хвост, который обычно являются липиды; Эта структура амфифильных наделяет самостоятельной сборки возможности и позволяет многовалентных отображения пептидов на поверхности частиц22,23,24. Headgroups пептид может влиять на формы частиц путем складывания и водородных связей между пептидами25. Было показано, что пептиды, которые раз через β-лист взаимодействия форме удлиненных мицеллы, в то время как α-винтовой подтверждения могут образовываться как сферических и удлиненные мицеллы22,23,24, 25,,2627. Полиэтиленгликоль (PEG) компоновщики, щит поверхности заряд пептида могут быть размещены между гидрофильные пептида и гидрофобные хвост пам, повышение доступности наночастиц в кровообращения28, 29 , 30 , 31. СМУУ также выгодно, потому что они биосовместимых и было показано, имеют широкий спектр приложений32,33. Значения растворимости в воде мицелл предлагает преимущество перед другими системами, на основе наночастиц, например некоторых полимерных наночастиц, не растворим в воде и должны быть приостановлены в solubilizers для инъекций34. Кроме того возможность создания ПАМС которые разбирать в ответ на конкретные стимулы делает ПАМС привлекательным кандидатом для доставки контролируемых наркотиков внутриклеточных35.
Связывание с рецепторами CCR2 и накапливается в аорты, СМУУ ранее были разработаны для Моноцит ориентации для мониторинга различных этапах атеросклеротических поражений аорты9. В ароЕ мышей– / – накопление Моноцит возрастает пропорционально налета прогрессии36. Кроме того было установлено, что пациенты с подверженных разрыв, поздней стадии таблички содержат большее количество моноцитов37. Таким образом изменение ПАМС включить MCP-1 полезно, потому что она позволяет для большей нацеленности специфичность и дифференциации между ранней и поздней стадии атеросклеротических поражений. Эти доказательства в концепция исследования также подтвердили ПАМС достаточно безопасно, чтобы использоваться в pre-clinically и очищаются парентеральному38. Поскольку моноцитов и воспаление характерны для других заболеваний, СМУУ MCP-1 имеют потенциал, чтобы быть использованы для лечебных и диагностических приложений в других заболеваний за пределы атеросклероза8,,3940 , 41.
Здесь мы приводим изготовление высокомасштабируемую и собственн-собранные ПАМС MCP-1, которая продемонстрировала оптимальный размер частицы, поверхности заряд и избирательного отношения к моноциты для расширения графических приложений в атеросклероза.
ПАМС MCP-1 являются перспективным молекулярной визуализации платформа, состоящая из гидрофильного таргетинга пептида и гидрофобных хвост, что диски собственн-собранные характер наночастиц. Эта ориентация Моноцит мицеллы можно приготовить путем простой синтеза и очистки шагов MCP-1 пепт?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить финансовую поддержку от университета Южной Калифорнии, Национальный сердца, легких и крови института (NHLBI), R00HL124279, Эли Edythe Широкое Innovation Award и л.к. Уиттиер фонд Non-рак Переводческая премия предоставлено ЕЕК. Авторы благодарят центр за электронная микроскопия и микроанализ, центр повышения квалификации в NanoBiophysics, центр повышения квалификации для молекулярная характеристика и переводческая изображений центра в университете Южной Калифорнии для помощи в Инструментальная установок.
1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |