Summary
Dieses Papier stellt eine Methode, mit der Synthese und Charakterisierung von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen und den entsprechenden assays für Biokompatibilität und Fähigkeit der Micelle binden an Monozyten zu testen.
Abstract
Atherosklerose ist ein wesentlicher Faktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, die häufigste Todesursache weltweit, der jährlich 17,3 Millionen Todesopfer fordert. Atherosklerose ist auch die häufigste Ursache des plötzlichen Tod und Myokardinfarkt, angestiftet von instabilen Plaques, die platzen und verdecken das Blutgefäß ohne Vorwarnung. Aktuelle bildgebende Modalitäten kann nicht unterscheiden zwischen stabilen und instabilen Plaques, die platzen. Peptid amphiphilen Micellen (PAMs) können diesen Nachteil überwinden, wie sie können, mit einer Vielzahl geändert werden von targeting Moieties, die speziell auf erkranktes Gewebe zu binden. Monozyten haben gezeigt, zu frühe Marker für Arteriosklerose, während große Ansammlung von Monozyten Plaques anfällig für Bruch zugeordnet ist. Daher können Nanopartikel, die Monozyten abzielen kann verwendet werden, verschiedene Stadien der Arteriosklerose zu unterscheiden. Zu diesem Zweck hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vorbereitung des Monocyte-targeting PAMs (Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sind selbst zusammengebaut durch Synthese unter milden Bedingungen, Form Nanopartikel von 15 nm im Durchmesser mit in der Nähe von neutralen Oberflächenladung. In Vitro, PAMs erwiesen sich biokompatible und hatte eine hohe Bindungsaffinität für Monozyten. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, Versprechen für ein breites Anwendungsspektrum in Atherosklerose sowie anderen entzündlichen Erkrankungen.
Introduction
Herz-Kreislauf-Krankheiten bleiben die führenden Todesursachen weltweit mit etwa 17,3 Millionen Todesfälle weltweit1. Herz-Kreislauf-Krankheiten sind durch Arteriosklerose, eine Bedingung trugen in denen Plaques in den Arterien, dadurch hemmende Blut- und Sauerstoffzufuhr zu den Zellen des Körpers2,3bauen. Die Progression der Atherosklerose beinhaltet die Verdickung und Verhärtung der Arterien durch eine entzündliche Reaktion, unregelmäßige Fettstoffwechsel und Plaquebildung, führt zu Plaque Ruptur und Myokardinfarkt4,5. Endothelzellen express Zytokine und Adhäsion Moleküle, die MCP-1, die an den C-C Chemokin-Rezeptor (CCR2 enthalten) auf der Oberfläche der Monozyten6,7,8bindet. Oxidiertes Cholesterin wandelt Monozyten zu Makrophagen in der frühen Phase der Plaquebildung, die verstärkt der entzündlichen Reaktion in der Region und führt zu Gewebeschäden und die Bildung von Plaques instabil oder gefährdeten9, 10.
Traditionell wird Arteriosklerose durch die Beurteilung der luminalen Stenose durch anatomische Bildgebung mit Ultraschall oder Angiographie11,12ausgewertet. Diese Methoden können aber nur feststellen starke Verengung der Arterienwand und nicht die frühen Stadium der Arteriosklerose, wie erste Gedenktafel Wachstum führt zu arteriellen Umbau um Arterie Größe beizubehalten und blood Flow Rate12,13, 14. Daher underrepresent Angiogramme Atherosklerose Prävalenz. Darüber hinaus nicht-invasive bildgebende Verfahren wie single Photonenemission berechnet Tomographie, Positronen-Emissions-Tomographie und Magnetresonanz-Bildgebung vor kurzem wurden verwendet, um Plaque-Morphologie zu charakterisieren, da sie erste Details bieten können und Charakterisierung von Plaques. Aber diese Modalitäten sind oft begrenzt durch den Mangel an Sensibilität, räumliche Auflösung, oder erfordern die Verwendung von ionisierender Strahlung, machen bildgebende Plaque Fortschreiten in den verschiedenen Phasen viel mehr herausfordernde15,16, 17. Ein bildgebendes System der Lieferung, das speziell Plaques in den verschiedenen Phasen der Atherosklerose identifizieren würde bleibt entwickelt werden.
Nanopartikel haben eine neue Plattform für in Vivo Plaque-targeting und Diagnostik18,19,20,21gezeigt. Insbesondere sind PAMs vorteilhaft aufgrund ihrer chemischen Vielfalt und die Fähigkeit, eine Vielzahl von Moieties, Kompositionen, Größen, Formen und Oberflächen Funktionalisierung22unterbringen. Peptid amphiphilen (PAs) bestehen aus einem hydrophilen, Peptid "Headgroup" befestigt eine hydrophobe Schwanz, die in der Regel sind Lipide; Diese amphiphile Struktur verleiht selbstorganisierende Funktionen und ermöglicht eine multivalente Anzeige der Peptide auf der Oberfläche der Partikel22,23,24. Die Peptid-Headgroups beeinflussen die Kornform durch Falt- und Wasserstoffbindung zwischen Peptide25. Peptide, die durch die Interaktion der β-Blatt Falten haben gezeigt, dass längliche Micellen zu bilden, während α-helikale Bestätigung sowohl sphärische und längliche Micellen22,23,24, bilden kann 25,26,27. Polyethylenglykol (PEG) linker, die Oberflächenladung des Peptids schützen können zwischen der hydrophilen Peptid und das hydrophobe Ende der PAMs, Verbesserung der Verfügbarkeit der Nanopartikel im Körperkreislauf28, platziert werden 29 , 30 , 31. PAMs sind auch vorteilhaft, weil sie biokompatibel sind und gezeigt haben, dass ein breites Spektrum von Anwendungen32,33. Die Wasserlöslichkeit von Micellen bietet einen Vorteil gegenüber anderen Nanopartikel-basierten Systemen wie z. B. bestimmte Polymere Nanopartikel, die nicht in Wasser löslich und in Lösungsvermittler für Injektionen34ausgesetzt werden. Darüber hinaus macht die Fähigkeit zum Erstellen von PAMs, das Zerlegen in Reaktion auf bestimmte Reize PAMs einen attraktive Kandidaten für kontrollierte intrazellulären Droge Lieferung35.
Durch Bindung an den Rezeptor CCR2 und akkumulieren in den Aortenbogen, wurden zuvor PAMs für Monocyte gezielt zur Überwachung der verschiedener Phasen von atherosklerotischen Läsionen in der Aorta9entwickelt. ApoE- / - Mäusen Monocyte Ansammlung steigt proportional zu Plaque Fortschreiten36. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Patienten mit Ruptur neigende, Spätstadium Plaques höhere Mengen an Monozyten37 enthalten. Daher ist die Änderung der PAMs, MCP-1 einzubeziehen nützlich, denn es größere targeting Spezifität und Differenzierung zwischen frühen und späten Stadium atherosklerotische Läsionen ermöglicht. Diese Proof-of-Concept-Studien überprüft auch, ob PAMs sind sicher genug vorklinisch verwendet werden und renally38deaktiviert sind. Da Monozyten und Entzündungen charakteristisch für andere Krankheiten sind, haben MCP-1 PAMs das Potenzial, für therapeutische und diagnostische Anwendungen in anderen Krankheiten über Arteriosklerose8,39,40 verwendet werden , 41.
Hier berichten wir über die Herstellung von hoch skalierbare und selbst-zusammengebauten MCP-1 PAMs, die optimale Größe, Oberflächenladung und gezielte Ausrichtung auf Monozyten für erweiterte imaging-Anwendungen in Atherosklerose des Teilchens nachgewiesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Lesen Sie das MSDS für Reagenzien und befolgen Sie alle chemischen Sicherheitsmaßnahmen gemäß lokalen Institution.
1. Vorbereitung des MCP-1 PAMs
-
Vorbereitung von MCP-1-Peptid
- Wiegen Sie 0,25 Mmol Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in einem Reaktionsgefäß (RV). Spülen Sie die Seite des RV mit 5 mL Dimethylforamide (DMF) in einem chemischen Abzug.
- Laden Sie die RV auf eine automatisierte Benchtop-Peptid-Synthesizer. Last abgepackte Aminosäure Ampullen, N "- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C", aus dem C, N-Terminus. Enthalten Sie eine Leere Phiole am Ende für den endgültigen Deprotection Schritt.
Hinweis: Eine verschlüsselte Peptid mit Sequenz, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', kann auch synthetisiert werden über das gleiche Protokoll. - Sobald Synthese abgeschlossen ist, übertragen Sie die Peptide auf Harz von der RV auf das Funkeln Fläschchen mit ca. 2-3 mL Methanol bis alle Harze übertragen werden. Nachdem das Harz auf den Boden gesunken ist, entfernen Sie überstand das Methanol zu und verdunsten Sie, die restlichen bis trocken. Vakuum für weitere 2 h oder über Nacht bei Raumtemperatur trocken.
- 12 mL Dekolleté-Lösung mit Trifluoracetic Säure (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 Vol % in einem chemischen Abzug zu machen. Schwenken Sie die Dekolleté-Lösung, um sicherzustellen, dass alles gleichmäßig vermischt ist.
Achtung: Da Triisopropylsilane und Ethanedithiol luftempfindlichen, Argon purge Lager Fläschchen mit Triisopropylsilane und Ethanedithiol für 1 min vor dem Ablegen wieder. - Stellen Sie die Synthese Gefäß (SV) auf einem Arm-Shaker durch Spannen der unteren Hälfte des SV. Übertragen Sie Peptid-Harz auf die SV mit 2 mL Dekolleté-Lösung, bis alle der Peptid-Harze übertragen werden.
- Waschen Sie die Seiten des SV mit 3 mL Dekolleté-Lösung. Schließen Sie den Deckel des SV und schütteln bei 300 Schwingungen/min für 4 h.
- Eine leere 50 mL Zentrifugenröhrchen abwiegen. Notieren Sie die Masse.
- Entleeren Sie nach 4 h die gespalten Peptidlösung vom SV in der 50 mL Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die SV mehrmals mit der restlichen Dekolleté-Lösung.
- Verdunsten Sie gespalten Peptidlösung mit Stickstoff bis gibt es weniger als 4 mL in die Zentrifugenröhrchen bleiben.
- 36 mL eiskaltes Äther der Peptid gespalten Projektmappe hinzufügen.
- Vortex ist die Lösung bis es komplett weiß oder gelb. Zentrifugieren bei 3.000 x g für 5 min bei 4 ° C, und den Überstand abgießen.
- Der Tube 40 mL eiskaltes Äther hinzufügen. Wirbel und beschallen wieder. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Den Überstand abgießen.
- Trocknen Sie das rohe PA-Pellet mit Stickstoff Gas spülen, bis der Äther sichtbar verdunstet ist.
- Geben Sie 20 mL bidestilliertem Wasser, Wirbel und beschallen bis das Peptid in Lösung vollständig gelöst ist.
- Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.
- Sobald das Peptid getrocknet ist, wiegen Sie die Masse der Zentrifugenröhrchen, das rohe-Peptid enthält. Das rohe Peptid in 5 mg/mL Wasser auflösen.
- 25 mg von Rohöl MCP-1-Peptid in 5 mL bidestilliertem Wasser eine totale Konzentration von 5 mg/mL zu lösen. Reinigen Sie das rohe MCP-1-Peptid durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit 0,1 % TFA in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1 % TFA in Acetonitril (Lösungsmittel B) als mobilen Phasen auf einer C8-Reverse-Phase-Spalte. Injizieren Sie die 5 mL des Peptids in der HPLC.
Hinweis: Die erste mobile Phase bestand aus 100 % Lösungsmittel A bei einer Durchflussrate von 9,0 mL/min Lösungsmittel A langsam auf 30 % in 27 min zu verringern und halten Sie in dieser Zusammensetzung für 3 min. Rückkehr der Gradient zu 100 % Lösungsmittel eine über 3 min und halten an dieser Komposition für 1 min zu geben eine Gesamtlaufzeit von 34 min. halten die Spalte Temperatur bei 55 ° C. Verwenden Sie positive Ionen Quellmodus für die Analyse. Ameisensäure kann anstelle von TFA, verwendet werden, wenn TFS zu sauer für die HPLC-Säule. Es wird empfohlen, die organische Lösungsmittel Zusammensetzung Rampe Geschwindigkeit 2%/min für bessere Trennung nicht überschreiten sollte. - Jede Fraktion mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) Massenspektrometrie für das erwartete Produkt m/Z bei 2.890 zu analysieren.
Hinweis: Lösen Sie α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure bei 1 mg/mL in Acetonitril/Wasser (50: 50 Vol-% auf) als die Matrixlösung. Vor Ort 0,75 µL Matrixlösung auf den MALDI-Teller, gefolgt von 0,75 µL der einzelnen Fraktionen. Führen Sie die Analyse mit einem positiven reflektierende Ionen-Modus im Massenbereich von 500-5.000 Da. - Kombinieren Sie Produkt Brüche, Abblasen Acetonitril, Einfrieren und lyophilize gereinigte Peptide bis trocken.
-
Vorbereitung von MCP-1 PA
- Bereiten Sie ein 1.1 molaren Überschuss von 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[Amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000) Maleimide Peptid in separaten funkeln Fläschchen. Lösen Sie beide Verbindungen in bidestilliertem Wasser machen ~ 15 mg/mL. Beschallen Sie für 15 Minuten oder bis beide Lösungen völlig klar sind.
Hinweis: DSPE-PEG (2000)-Cy5 synthetisiert unter Verwendung des gleichen Protokolls mit DSPE-PEG (2000)-Amin und N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester funktionalisiert Cy5, mit Ausnahme von Schritt 1.2.3, wo der pH-Wert der Lösung bis 8,5 eingestellt wird. - Die Peptidlösung DSPE-PEG (2000)-Maleimide-Lösung hinzufügen. Wirbel und beschallen.
- Fügen Sie 1 M NaOH tropfenweise (1 µL) nacheinander, bis der pH-Wert der Lösung 7 beträgt.
- Stickstoff-Aufräum-Lösung für 5 min. Rühren Sie die Lösung über Nacht.
- Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.
- Sobald das Rohprodukt getrocknet ist, lösen Sie den Feststoff in 5 mg/mL Wasser auf.
- Reinigen Sie mit HPLC, wie oben beschrieben.
Hinweis: Unconjugated Peptid und DSPE-PEG(2000) sollte zwischen 15-30 % organische Konzentration (Vol%), während DSPE-PEG eluieren (2000)-MCP-1-Konjugat sollte zwischen 40-50 % Bio Konzentration eluieren. - Analysieren Sie jede Fraktion mittels MALDI Massenspektrometrie für die entsprechenden m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 eine breite m/Z-Spitze bei 5.760 haben sollte.
Hinweis: 2,5-Dihydroxybenzoic Acid wird am besten als Matrix für DSPE-PEG (2000)-MCP-1 mit MALDI verwendet.
- Bereiten Sie ein 1.1 molaren Überschuss von 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[Amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000) Maleimide Peptid in separaten funkeln Fläschchen. Lösen Sie beide Verbindungen in bidestilliertem Wasser machen ~ 15 mg/mL. Beschallen Sie für 15 Minuten oder bis beide Lösungen völlig klar sind.
-
Montage von MCP-1 PAMs
- Auflösen von 1,75 mg MCP-1 PAs mit 3 mL Methanol in einem 1-Dram-Fläschchen. Beschallen Sie bis die MCP-1 PA vollständig gelöst ist.
Hinweis: Cy5 amphiphilen können in einem molaren Verhältnis von 10: 90 MCP-1 PA für imaging-Anwendungen integriert werden. - Verdampfen Sie das Methanol unter Stickstoff in einer kreisförmigen Bewegung während der Seite des Röhrchens das restliche Methanol abspülen, bis ein gleichmäßiger Film an der Unterseite der Flasche entsteht. Vakuum-trockenen Film über Nacht.
- Den Film mit 3 mL Wasser oder Phosphat-Puffer-Hydrat Kochsalzlösung (PBS), eine 100 µM-Lösung von MCP-1 PAMs zu machen. Sanft Wirbel und beschallen die Lösung bis frei. Bei 80 ° C für 30 min inkubieren.
Hinweis: Die erhöhte Temperatur hat gezeigt, dass die Selbstmontage Prozess beschleunigen und ermöglicht es der Peptid-Komponente, die stabilste Sekundärstruktur zu bilden, während die Senkung der kritischen Micelle Konzentration (CMC)42,43. - Die resultierende Dispersion auf Raumtemperatur abkühlen.
- Auflösen von 1,75 mg MCP-1 PAs mit 3 mL Methanol in einem 1-Dram-Fläschchen. Beschallen Sie bis die MCP-1 PA vollständig gelöst ist.
2. Charakterisierung von MCP-1 PAMs
-
Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zetapotenzial
- Platz 100 µM von MCP-1 PAM oder Rührei PAM in eine Küvette gemäß den Anweisungen des DLS oder Zeta potential Instruments.
Hinweis: DLS und Zeta potential Küvetten können unterschiedlich sein auf der Grundlage des Instruments Anweisungen. - Equilibrate das Instrument auf Raumtemperatur. Messen Sie die Größe und die Oberflächenladung der PAM.
- Platz 100 µM von MCP-1 PAM oder Rührei PAM in eine Küvette gemäß den Anweisungen des DLS oder Zeta potential Instruments.
-
Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)
- Fügen Sie 7 µL von 50 µM MCP-1 PAM oder Rührei PAM auf ein TEM-Raster ausgesetzt in eine selbstschließende Pinzette für 5 min. Docht das Tröpfchen mit einem heiklen Aufgabe abwischen.
- Fügen Sie 7 µL Wasser um das Raster zu waschen. Docht entfernt das Droplet.
- Fügen Sie 7 µL 1 wt % Phosphotungstic Acid für 2 min. Docht entfernt das Droplet. Wiederholen Sie Schritt 2.2.2.
- Trocknen Sie die TEM-Raster vor TEM Analyse.
-
Kreisförmigen Dichroismus (CD) Spektroskopie
- Schalten Sie den Stickstoff für 5-10 min vor dem Gebrauch des Gerätes.
- Küvette 300 µL des Rohlings (Wasser oder PBS) entgegenbringen.
- Spektren bei 190-265 nm, 0,2 mm-Länge mit einem 1 s Integrationszeit und 1 nm Bandbreite bei Raumtemperatur zu messen. Sammeln Sie 3 Wiederholungen.
- Maßnahme 100 µM-MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, kletterte Peptid und Rührei PAM unter den gleichen Bedingungen im Schritt 2.3.3 beschrieben. Subtrahieren Sie vom Rohling.
- Passen Sie die Daten über eine lineare Interpolation von Polylysin Grundlage Spektren.
- Schalten Sie das Gerät. Warten Sie 10 Minuten vor dem Ausschalten des Stickstoffs.
3. in-vitro- Analyse der MCP-1 PAMs
-
In-vitro- Biokompatibilität
- Kultur und erweitern WEHI 274,1 murine Monozyten in Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol in 37 ° C weniger als 5 % CO2 , Abschnitt 5.
Hinweis: WEHI 274,1 sind Aussetzung Zellen. Bei der Kultivierung, sollten die Medien alle 2-3 Tage wieder aufgefüllt. - Pipettieren Monozyten in den Medien in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Die alten Medien Aspirieren und in 10 mL frische Medien in die Zentrifugenröhrchen Aufschwemmen. Mischen, langsam, bis die Zellen in den Medien gleichmäßig verteilt sind. Zählen der Zellen verwenden Trypan blau Färbung und eine Hemocytometer.
- Verdünnen Sie die Zellen so, dass es 4.000 Monozyten pro 90 µL Medien pro Bohrloch. Fügen Sie 90 µL Zellen in Brunnen eine 96-Well-Platte. 24 h inkubieren.
Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung der Brunnen auf der Außenkante der Platte, um Unterschiede bei der Verdunstung und thermische Veränderungen in der Platte zu vermeiden. Füllen Sie die äußere Vertiefungen mit 100 µL PBS. - 0,15 µmol MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, Rührei Peptid oder Rührei-PAM in 150 µL PBS in separaten, sterilisierte Mikrozentrifugenröhrchen auflösen. Führen Sie serielle Verdünnung um 65 µL 1, 10 und 100 µM jeder Probe zu machen.
- Fügen Sie 10 µL PBS für jede Konzentration in Brunnen mit WEHI 274,1 (Gesamtvolumen: 100 µL pro gut, 6 Zeilen, insgesamt 96 Wells). 72 h inkubieren.
- Fügen Sie 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) in jede Vertiefung. 1 h inkubieren.
- Analysieren Sie die Absorption mit einem Teller Reader auf 490 nm oder basierend auf den Anweisungen des Herstellers.
- Kultur und erweitern WEHI 274,1 murine Monozyten in Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol in 37 ° C weniger als 5 % CO2 , Abschnitt 5.
-
In-vitro- Micelle Bindung
- Samen 500.000 Monozyten in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 2 mL Medium mit 100 µM Cy5-Label MCP-1 PAM (10: 90 Molverhältnis von DSPE-PEG (2000)-Cy5 und MCP-1 PA). 1 h inkubieren.
- Sammeln Sie WEHI 274,1 durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die Medien.
- Aufschwemmen Sie und waschen Sie die Zellen in 2 mL PBS. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 2 mL PBS. Aspirieren Sie die PBS.
- Fügen Sie 2 mL kalten 4 % Paraformaldehyd, die Zellen zu beheben. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
- Pipettieren der fixen Zellen auf einem sterilen Glas Deckgläschen in Brunnen von einem 6-Well-Platte. 400 X g für 5 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie die Paraformaldehyd. Waschen und Spülen mit 2 mL PBS einmal. Mit 1 mL PB Aufschwemmen
Hinweis: Beim Spülen, nicht zu stören die Zellen auf das Deckglas. - Setzen Sie 10 µL von 90 % Glycerin mit PBS-Puffer auf eine Folie. Benutzen Sie eine Nadel und Pinzette um zu holen das Deckglas. Trocknen Sie den Rand des Deckglases. Legen Sie vorsichtig das Deckglas auf einer Folie verdeckt.
- Versiegeln Sie vorsichtig den Rand des Deckglases mit klaren Nagellack. Legen Sie in den Kühlschrank bis bereit für die Bildgebung.
- Verwenden einen konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) installiert mit Lasern für Cy5 bei λErregung = 650 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vorbereitung von MCP-1 PAM
Das CCR2-Bindung-Motiv (Rückstände 13-35) der MCP-1 Protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] oder Rührei Peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] wurde modifiziert, indem ein Cystein-Reste auf dem N-Terminus. Das MCP-1-Peptid wurde durch eine Fmoc-vermittelten Festphasen-Methode unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesizers synthetisiert. Das rohe-Peptid wurde gereinigt, durch Reverse-Phase-HPLC auf eine Spalte C8 bei 50 ° C mit 0,1 % TFA in Acetonitril/Wasser-Gemischen und zeichnet sich durch MALDI-Massenspektrometrie (Abbildung 1). Das Cystein-haltigen Peptid wurde auf DSPE-PEG2000-Maleimide DSPE-PEG (2000)-Peptid Konjugate über ein Gestänge Thioether Ausbeute konjugiert. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Rohprodukt durch HPLC (Abbildung 2) gereinigt. DSPE-PEG (2000)-Cy5 wurde mit einer NHS-Ester-Reaktion synthetisiert. Monocyte-targeting PAMs Co montiert mit DSPE-PEG (2000)-MCP-1 und DSPE-PEG (2000)-Cy5 wurden durch Auflösen in Methanol, die dann von N2eingedampft wurde hergestellt, und der resultierende Film wurde über Nacht unter Vakuum getrocknet und selbst im Wasser montiert oder PBS durch die hydrophoben Wechselwirkungen der Form MCP-1 PAMs "Schweif Gruppen".
Charakterisierung von MCP-1 PAM
DLS-Daten und TEM Bilder von Monocyte-targeting PAMs zeigte gut dispergierte, kugelförmigen Nanopartikel von 15,3 ± 2,0 nm im Durchmesser (Abbildung 3 und Tabelle 1). MCP-1 PAMs und Rührei PAMs zeigten einen leichten positiven Zeta potential von 12,1 ± 3,1 mV und 13,7 ± 1,9 mV, bzw. (Tabelle 1). CD hat gezeigt, dass die Einbeziehung von MCP-1-Peptid innerhalb der Micelle die Sekundärstruktur verbessert (Tabelle 2, MCP-1 PAMs: 46,2 ± 0,9 % β-Sheet, 53.1 ± 1,4 % zufällige Spule und kostenlose MCP1: 34,2 ± 3,5 % β-Sheet, 65.8 ± 3,5 % zufällige Spule).
In-vitro- Analyse von MCP-1 PAM
In-vitro- Biokompatibilität und Monocyte Bindung von MCP-1 PAMs wurden von konfokalen Mikroskopie beobachtet. Maus Monozyten mit steigenden Konzentrationen von MCP-1, MCP-1 PAM, Rührei Peptid und Rührei PAM für 72 h inkubiert wurden, und die Zellen erwiesen sich tragfähige und biokompatible bis zu 100 µM (Abbildung 4). Darüber hinaus zeigte konfokalen Mikroskopie spezifische Bindung der Monozyten, MCP-1 PAMs im Vergleich zu Rührei PAMs (Abbildung 5).
Abbildung 1 : HPLC-Chromatogramm bei 220 nm (Wellenlänge von Peptidbindungen) und 254 nm (Tyrosin Wellenlänge) MCP-1-Peptid (A) und Rührei Peptid (B) (Boxed Spitze bei 7,4 min). MALDI-TOF Massenspektrum von MCP-1-Peptid (C) und Rührei Peptid (D) bei einer Reichweite von 500-5.000 Da zeigt die Spitze [M + h]+ bei m/Z 2.888 (erwartete 2.890). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: HPLC-Chromatogramm bei 220 nm (Wellenlänge von Peptidbindungen) und 254 nm (Tyrosin Wellenlänge) der DSPE-PEG (2000)-MCP-1 (A) und der DSPE-PEG (2000)-(B) verschlüsselt. (Boxed Peak bei 16,9 min). (C) MALDI-TOF Masse Spektrum der DSPE-PEG (2000)-MCP-1 bei einer Reichweite von 1.000-10.000 Da zeigt die Gipfel [M + h]+ bei m/Z 2.888 (erwartete 2.890) für MCP-1 und m/Z 5.758 (erwartete 5.760) für DSPE-PEG (2000)-MCP-1. (D) MALDI-TOF Masse Spektrum der DSPE-PEG (2000)-verschlüsselt in einem Bereich von 1.000-10.000 Da zeigt die Peaks für [M + H]+ bei m/Z 2.887 (erwartete 2.890) für verschlüsselte Peptid und m/Z 5.761 (erwartete 5.760) für DSPE-PEG-verschlüsselt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : TEM Bilder von MCP-1 PAM (A) und kletterte PAM (B). Maßstabsleiste = 100 nm. Anzahl-Durchschnitt Größenverteilung von MCP-1 PAM (C) und kletterte PAM über DLS (D). Daten sind Mittelwert ± S.D. (n = 3). (E) CD-Analyse von MCP-1 und Rührei Peptide und PAMs (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : In-vitro- Lebensfähigkeit des WEHI 274,1 murinen Monozyten nach 72 h MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, Rührei Peptid und verschlüsselte PAM. Daten sind Mittelwert ± S.D. (n = 6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: CLSM Bilder von MCP-1 PAM (A) und Rührei PAM (B) integriert mit 10 Mol% Cy5 PA (rot) mit WEHI 274,1 für 1 h. Maßstabsleiste inkubiert = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| PAMs | Anzahl-Ave Durchmesser (nm) | PDI | Zeta-Potential (mV) |
| MCP-1 | 15,3 ± 2.0 | 0.119 ± 0,006 | 12,1 ± 3,1 |
| Rührei | 16.9 ± 1,4 | 0.232 ± 0,019 | 13.7 ± 1,9 |
| In PBS-Puffer gemessen. Daten werden ausgedrückt als ± SD bedeuten | |||
Tabelle 1: Größe, Polydispersität und Zeta-Potential von PAMs.
| a-Helix (%) | b-Blatt (%) | Zufällige Spule (%) | |
| MCP-1-Peptid | 0.0 ± 0.0 | 36.2 ± 2,2 | 63,8 ± 1,8 |
| MCP-1 PAM | 0,7 ± 0,6 | 46,2 ± 0,9 | 53.1 ± 1,4 |
| Verschlüsselte Peptid | 0.0 ± 0.0 | 43,7 ± 2,1 | 56,3 ± 3,5 |
| Verschlüsselte PAM | 0.0 ± 0.0 | 60.7 ± 0,2 | 39,3 ± 0,2 |
Tabelle 2: Sekundärstruktur Zusammensetzung der Peptide und PAMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCP-1 PAMs sind eine vielversprechende molekulare Bildgebung-Plattform, bestehend aus einer hydrophilen targeting Peptid und hydrophobe Endstück, das treibt die selbstgebaute Natur der Nanopartikel. Diese Monocyte-targeting Micelle kann durch einfache Synthese und Reinigungsschritte der MCP-1-Peptid und DSPE-PEG (2000)-MCP-1 hergestellt werden. PAMs haben viele vorteilhafte Eigenschaften für molekulare Bildgebung in Vivo wie ihre Selbstmontage unter milden Bedingungen, intrinsische biologische Abbaubarkeit und strukturelle und chemische Vielfalt ermöglicht die Einbeziehung der anderen bildgebenden Moieties oder Ausrichtung Peptide, gezielt auf einen bestimmten Standort des Interesses zu liefern. Ihre Partikelgröße, Form und Zusammensetzung können abgestimmt werden, indem das Peptid, hydrophobe Schweif oder Micelle Konzentration, so dass optimale chemische und physikalische Eigenschaften für eine Vielzahl von Anwendungen22,33.
Ein paar Einschränkungen dieses Protokolls sollte erwähnt werden. Zuerst, da PAMs durch hydrophobe Wechselwirkungen getrieben werden, ist es notwendig, gezielt Peptide zu konstruieren, die hydrophilen, wodurch das targeting Abstimmungsunterlagen auf der Oberfläche der Micelle vorzulegen sind. Wenn der Peptidsequenz hydrophob ist, ein Zusatz von ein oder zwei hydrophile Aminosäuren am C-Terminus untergebracht werden kann, aber der Zusatz von Aminosäuren die Peptid-Sekundärstruktur innerhalb der Micelle beeinflussen könnten, und ändern der Eigenschaften der Peptid in seinen Heimatstaat in das Protein44,45. Zweitens bei niedrigen Konzentrationen haben PAMs schlechte Stabilität in wässrigen Umgebungen, sind stark abhängig von der CMC, die minimale Konzentration benötigt für PAs ein Mizellen Struktur46zu bilden. Unterhalb der CMC Micelle zerlegt zu einzelnen PA-Monomere und der Micelle fungieren als Träger und Entladen ein Medikament bei einem bestimmten Standort47begrenzt. Um diesen Nachteil zu beheben, kann die CMC verringert werden, durch die Erhöhung der Kettenlänge der hydrophoben Schweif48,49. Zu guter Letzt ist die langfristige Lagerung von PAMs in Lösung nicht empfohlen, da PA Sekundärstruktur mit der Zeit ändern kann und beeinträchtigt dadurch die Mizellen Struktur und Stabilität, sowie Effizienz bei der Ligand verbindliche26.
In der Summe zeigt dieses Protokoll eine robuste, selbstgebaute Peptid Micelle-basierte Nanomedizin Strategie für Atherosklerose-Bildgebung. MCP-1 PAMs sind biokompatibel, biologisch abbaubar und ungiftig, da Komponenten der Micelle von endogenen Elemente an den Körper inspiriert sind. Noch wichtiger ist, haben die MCP-1 PAMs bevorzugte Bindung an Monozyten, die proportional zu Plaque Progression zu erhöhen, einen nicht-invasive Ansatz zur Differenzierung Stufen von atherosklerotischen Plaques zu erleichtern. Aufgrund der Modularität dieser Plattform können PAMs Therapeutika, zusätzliche Ausrichtung Peptide, bildgebenden Moieties und Nukleinsäuren integrieren. Daher glauben angesichts solch dynamischen Fähigkeiten von dieser multifunktionalen Micellen, wir, dass diese Teilchen große Versprechung für klinische Übersetzung bei Arteriosklerose und anderen Krankheiten halten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung von der University of Southern California, das National Heart, Lung, und Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli Edythe breiten Innovationspreis und l.k. Whittier Stiftung Non-Krebs zu erkennen Translational Research Award, EJC gewährt. Die Autoren danken Zentrum für Elektronenmikroskopie und Mikroanalyse, Center of Excellence in NanoBiophysics, Kompetenzzentrum für molekulare Charakterisierung und translationale Imaging Center der University of Southern California für die Unterstützung bei Instrumental-Setups.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E.
- Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M.
- Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
- Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
- Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
- Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
- Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
- Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
- Sanz, J., Fayad, Z. A.
- Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
- Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
- Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
- Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
- Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
- Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
- Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
- Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
- Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
- Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
- Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
- Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
- Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
- Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
- Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
- Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
- Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
- Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M.
- Hamley, I. W.
- Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
- Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
- Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
- Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
- Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
- Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
- Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
- Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
- Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
- Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
- Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
- Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
- Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
- Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
- Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C.
- Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
- Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).
