Summary
合成やペプチド両親媒性分子ミセルの単球ターゲットの評価手法を提案し、生体適合性および単球にバインドするミセルの機能をテストするための試金の対応します。
Abstract
動脈硬化は 1730 万生活を毎年要求する心血管疾患死、世界中の主要な原因への主要コントリビューターです。動脈硬化も突然死や心筋梗塞、不安定プラークは破裂し、警告することがなく血管を閉塞、によって扇動されるの主要な原因です。現在の画像診断法は、安定・不安定プラーク破裂を区別できません。病気の組織に結合する部分をターゲットのさまざまな変更できます、ペプチド両親媒性ミセル (PAMs) はこの欠点を克服することができます。単球は、球の大きい蓄積が破裂しやすいプラークを関連付けながら、動脈硬化の初期マーカーのように示されています。したがって、単球を対象とするナノ粒子は、アテローム性動脈硬化のさまざまな段階を識別する使用できます。ここでは、その終わりには PAMs の単球ターゲットの準備のためのプロトコル記述 (単球走化性因子蛋白質 1 (MCP 1) PAMs)。MCP 1 PAMs が 15 のフォームのナノ粒子に温和な条件下での合成を通じて組み立てられ自己と表面電荷は中性付近の径 nm。体外、 PAMs 生体適合性であると見つけられたおよび単球に高い結合親和性を持っていた。記載法は、動脈硬化だけでなく、その他の炎症性疾患のアプリケーションの広い範囲のための約束を示す.
Introduction
心血管疾患は、グローバル、約 1730 万死亡世界中1死の主要な原因に残る。心血管疾患は、アテローム性動脈硬化プラークは動脈、それにより阻害血ボディ2,3のセルに酸素の流れ構築する条件で貢献しています。動脈硬化の進行には、炎症反応、不規則な脂質代謝、プラーク形成、プラーク破裂、心筋梗塞4,5につながる、肥厚、動脈硬化が含まれます。血管内皮細胞は、MCP 1 球6,7,8の表面に C C ケモカイン受容体 (CCR2) にバインドするは、サイトカイン、および接着分子を表現します。酸化コレステロール地域で炎症反応を増幅し、組織の損傷や不安定や脆弱なプラーク9,の形成につながるプラーク形成の初期の段階に単球をマクロファージに変換します10。
伝統的に、アテローム性動脈硬化は、血管造影または超音波11,12を使用して解剖学的イメージングによる内腔の狭窄を評価することによって評価されます。ただし、これらのメソッドは高度の狭窄動脈壁の動脈硬化の初期段階を判断できますのみ初期プラークの成長を引き起こす動脈動脈のサイズを維持し、血の流れ率12,13、改造、 14。したがって、血管造影は動脈硬化症の有病率を初期します。また、単一光子放出など非侵襲的イメージング技術計算トモグラフィー、陽電子放射断層撮影、磁気共鳴イメージング最近最初の詳細を提供できるようプラーク形態の特性に使用されているとプラークの評価ただし、これらの様式の感度、空間分解能の不足によって限られているまたははるか挑戦15,16、さまざまな段階でのイメージングのプラーク進行を作って、電離放射線を使用する必要 17。具体的には動脈硬化のさまざまな段階でプラクを識別する画像配信システム開発するままになります。
ナノ粒子は、生体内でプラークをターゲットと診断18,19,20,21新たなプラットフォームであること示されています。特に、PAMs が彼らの化学的多様性と様々 な鎖、組成物、サイズ、形状、および表面機能化22に対応する能力のため有利であります。両親媒性ペプチド (PAs) から成っている、親水性ペプチド"headgroup"通常脂質である疎水性尾に接続されています。この両親媒性構造は、自己組織化機能を付与でき、多価ペプチド粒子22,23,24の表面に表示するため。ペプチド headgroups は折りたたみとペプチド25との水素結合を介して粒子形状に影響を与えます。Β シートの相互作用を介してフォールド ペプチド α ヘリカル確認両方球形と細長いミセル22,23,24,を形作ることができる間、細長いミセルを形成する示されている25,,2627。親水性ペプチドおよび PAMs、全身循環28,ナノ粒子の可用性が強化の疎水性尾間ペプチドの表面電荷をシールド ポリエチレング リコール (PEG) リンカーを配置できます。29,30,31. PAMs は、生体適合性、アプリケーションの32,33の広範な範囲を持っているが示されているためにも有利。ミセルの水容解性は、水溶性ではなく、注射34solubilizers で中断する必要がある特定の高分子ナノ粒子など他のナノ粒子ベースのシステム上の優位性を提供しています。また、特定の刺激に対する反応で分解 PAMs を作成する機能は制御された細胞内薬剤配達35の魅力的な候補 PAMs になります。
CCR2 受容体に結合し、大動脈弓に蓄積、PAMs 以前単球9大動脈の動脈硬化病変のさまざまな段階を監視するターゲットのため開発されました。アポ-/-マウスの単球の蓄積はプラーク進行36に比例して増加します。さらに、破断が発生しやすい、後期の斑の患者が単球37の多量を含むことがわかった。したがって、MCP 1 を組み込むに PAMs の変更は大きいターゲット特異性と初期と後期段階のアテローム性動脈硬化病変の区別できるため便利です。また、これらの概念実証研究確認 PAMs は pre-clinically を使用するのに十分な安全する renally の38がクリアされます。MCP 1 PAMs 動脈硬化症8,,3940を超えてその他の疾患の治療および診断アプリケーションで使用する可能性のある単球や炎症は他の病気の特徴なので,41。
ここで、粒子の最適なサイズ、表面電荷、およびアテローム性動脈硬化で強化されたイメージング用単球を選択的ターゲティングを示した拡張性と自己組織化の MCP 1 PAMs の作製を報告する.
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Protocol
注: 試薬の MSDS を読むし、地方機関に必要なすべての化学安全対策に従ってください。
1. MCP 1 PAMs の準備
-
MCP 1 ペプチドの作製
- Fmoc 保護-L-Lys (Boc) の 0.25 モル重量を量り-反応容器 (RV) の王。化学の発煙のフード 5 mL dimethylforamide (DMF) と RV の側をすすいでください。
- 卓上型自動ペプチド合成装置に RV をロードします。あらかじめパッケージ化されたアミノ酸バイアル、N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', C から N 末端をロードします。最終的な脱保護手順の終わりに空のバイアルが含まれます。
注: シーケンス、N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C'、スクランブル ペプチドも合成できる同じプロトコルを使用しています。 - 合成が完了すると、ペプチド樹脂から転送 RV 2 〜 3 mL のメタノールを用いたシンチレーション バイアルに樹脂のすべてが転送されるまで。樹脂は、底に沈んでいる後、培養上清中のメタノールを削除し、乾燥するまで残りを蒸発します。真空乾燥室温でさらに 2 時間または一晩。
- 12 mL 胸の谷間溶液化学の発煙のフード 94:2.5:2.5:1 vol %trifluoracetic 酸 (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane を確認します。それは均等に混合されていることを確認して胸の谷間ソリューションを旋回します。
注意: triisopropylsilane とエタンジチある空気に敏感なため、アルゴンは triisopropylsilane と再びそれらを置く前に 1 分間エタンジチ株式バイアルをパージします。 - SV の半分下部クランプ アーム シェーカーに合成容器 (SV) を配置します。ペプチド樹脂のすべてが転送されるまでは、胸の谷間溶液 2 mL と SV にペプチド樹脂を転送します。
- 3 mL 胸の谷間ソリューションと SV の側面を洗います。SV のキャップを閉じて、300 振動/分 4 h に振る。
- 空 50 mL 遠心管を重量を量る。質量を記録します。
- 4 h 後に、50 mL の遠心管に SV から裂かれたペプチド ソリューションを抜きます。残りの胸の谷間ソリューションで何回か SV をすすいでください。
- 未満 4 mL 遠心管の残りがあるまでは、劈開ペプチドにより、窒素を蒸発させます。
- ペプチド切断ソリューションに冷たいエーテルの 36 mL を追加します。
- 渦までソリューションは完全に白または黄色です。4 ° C で 5 分間 3,000 × g で遠心し、上清をデカントします。
- 40 mL 冷たいエーテルをチューブに追加します。渦と再び超音波。遠心分離プロセスを繰り返します。上清をデカントします。
- 窒素ガスパージ エーテルが蒸発して目に見えないまでに原油の PA ペレットを乾燥させます。
- 二重蒸留水 20 mL を加えて水、渦、および超音波溶液中ペプチドを完全に溶解するまで。
- 解決をフリーズ ・ ドライまで凍乾します。
- 一度、ペプチドを乾燥すると、原油のペプチドを含む遠心分離機管の質量を重量を量る。5 mg/mL の水で粗ペプチドを溶解します。
- 25 mg を 5 mg/mL の濃度を作るためには、ダブル蒸留水を 5 mL の原油の MCP 1 ペプチドを溶解します。0.1% 水 (溶媒) で TFA と 0.1% を用いた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による原油 MCP 1 ペプチドを浄化 C8 逆相カラムに移動相としてアセトニ トリル (溶剤 B) で TFA。ペプチドの 5 mL を HPLC に注入します。
注: 初期の移動相から成っていた 100% 溶剤溶剤 A ゆっくりと 27 分の 30% の減少し、この組成 3 分リターン 100% 溶媒へのグラデーションで 9.0 mL/分の流量で以上 3 分と 1 分を与えるためのこの構成で開催34 分の合計実行時間は、55 ° C でカラム温度を保つ分析のための肯定的なイオン ソース モードを使用します。ギ酸は、TFA がも HPLC カラムの酸性の場合、TFA の代わりに使用できます。有機溶媒組成傾斜速度がよりよい分離の 2%/min を超えないことをお勧めします。 - マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) 質量分析法を用いた 2,890 で予想される製品 m/z 各分画を分析します。
注: は、マトリックス ソリューションとして 1 mg/mL にアセトニ トリル/水 (50: 50 vol %) で α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を溶解します。各分画の 0.75 μ L に続いて MALDI プレート ・ マトリクス ・ ソリューションの 0.75 μ L をスポットします。500 5,000 Da の質量範囲で正反射イオン モードを使用して解析を実行します。 - 製品分数を組み合わせる、アセトニ トリル、吹き飛ばすフリーズして乾燥するまで浄化されたペプチッドを凍結乾燥します。
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MCP 1 PA の準備
- 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-のN-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE ・ ペッグ (2000)-独立したシンチレーション バイアルにペプチドのマレイミド 1.1 モル超過分を準備します。ように二重蒸留水の両方の化合物を溶解 〜 15 mg/mL。超音波照射 15 分または両方のソリューションが完全に明確になるまで
注: DSPE ・ ペッグ (2000)-cy5 の組合せは、8.5 に、溶液の pH を調整する、DSPE ・ ペッグ (2000)-アミンと N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステル官能基化 Cy5 のステップ 1.2.3 を除いて、同じプロトコルを使用して合成されます。 - DSPE PEG (2000)-マレイミド ソリューションをペプチドのソリューションに追加します。渦と超音波。
- 追加 1 M 水酸化ナトリウム滴 (1 μ L)、溶液の pH が 7 になるまでの時間で。
- 5 分の窒素パージ ソリューションはソリューションを一晩撹拌します。
- 解決をフリーズ ・ ドライまで凍乾します。
- 粗生成物を乾燥すると、一度は、5 mg/mL の水に固体を溶解します。
- 前述のように、高速液体クロマトグラフィーと浄化します。
注: 非ペプチド、DSPE-PEG(2000) 必要があります溶出 15-30% 有機濃度 (vol %)、間 DSPE PEG 中 (2000)-MCP 1 共役有機濃度が 40-50% の間溶出する必要があります。 - MALDI 質量分析法を使用して、対応する m/z. DSPE ペグ (2000)-MCP 1 は 5,760 m/z 幅広いピークを有するべきである各分画を分析します。
注: 2, 5-ジヒドロキシ安息香酸に適しています行列として DSPE ペグ (2000)-MCP-1 MALDI と。
- 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-のN-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE ・ ペッグ (2000)-独立したシンチレーション バイアルにペプチドのマレイミド 1.1 モル超過分を準備します。ように二重蒸留水の両方の化合物を溶解 〜 15 mg/mL。超音波照射 15 分または両方のソリューションが完全に明確になるまで
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MCP 1 PAMs のアセンブリ
- 1.75 mg を溶解 1 dram 瓶で 3 mL のメタノールに MCP 1 PAs。超音波 MCP 1 PA を完全に溶解するまで。
注: Cy5 両親媒性物質は、イメージング用 MCP 1 PA 10: 90 のモル比で組み込むことができます。 - バイアルの下部に均一な膜が形成されるまで、バイアルの側面を離れて残りのメタノールをすすぎながら円を描くように窒素下でメタノールを蒸発させます。真空ドライ フィルムを一晩。
- 3 mL の水またはリン酸バッファーが付いているフィルムを水和物生理食塩水 (PBS) MCP 1 PAMs の 100 μ M 溶液を作成します。優しく渦クリアまでソリューションを超音波と。80 の ° c で 30 分間インキュベートします。
注: 高温自己組織化プロセスを加速するために示されている、ペプチド コンポーネントで臨界ミセル濃度 (CMC)42,43を下げながら、最も安定した二次構造を形成できます。 - 部屋の温度に結果の分散をクールします。
- 1.75 mg を溶解 1 dram 瓶で 3 mL のメタノールに MCP 1 PAs。超音波 MCP 1 PA を完全に溶解するまで。
2. MCP 1 PAMs のキャラクタリゼーション
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動的光散乱法 (DL) とゼータ電位
- MCP 1 PAM または DLS またはゼータ電位器の指示に従ってキュベットでスクランブル PAM の場所 100 μ M。
注: DL とゼータの潜在的なキュベット異なることがあります機器の指示に基づいています。 - 部屋の温度に楽器を平衡します。サイズと PAM の表面電荷を測定します。
- MCP 1 PAM または DLS またはゼータ電位器の指示に従ってキュベットでスクランブル PAM の場所 100 μ M。
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透過型電子顕微鏡 (TEM)
- 7 μ L を追加 50 μ M の MCP 1 PAM またはスクランブル PAM TEM グリッド上に内で中断 5 分芯先の自己終了ピンセット繊細な作業で拭きます液滴。
- グリッドを洗浄する水の 7 μ L を追加します。液滴を離れて放出します。
- 液滴 1 wt % リンタングステン酸 2 分芯先の 7 μ L を追加します。2.2.2 手順を繰り返します。
- TEM 分析の前に TEM グリッドを乾燥させます。
-
円二色性 (CD) による
- 楽器の使用前に 5-10 分の窒素をオンにします。
- キュベットに空白 (水または PBS) の 300 μ L を配置します。
- 190 265 nm、1 s 積分時間と室温で 1 nm の帯域パス長さが 0.2 mm でスペクトルを測定します。3 複製を収集します。
- メジャー 100 μ M MCP 1 ペプチド、MCP 1 PAM、ペプチド、スクランブル、PAM をスクランブル手順 2.3.3 で説明した同じ条件の下で。空白から減算します。
- ポリリジン的スペクトルの線形補間を使用して、データに合います。
- 機器の電源を切ります。窒素をオフにする前に 10 分を待ちます。
3 MCP 1 PAMs のin Vitro解析。
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In vitro生体適合性
- 文化、WEHI 274.1 ダルベッコ変更イーグル培 10% 牛胎児血清 (FBS)、マウス単球を展開 1% ペニシリン-ストレプトマイシンと 0.05 mM 2-メルカプトエタノール 37 ° c 未満 5% CO2通路 5 に。
注: WEHI 274.1、懸濁細胞です。養殖するときメディアは 2-3 日毎を補充する必要があります。 - ピペット滅菌 50 mL の遠心管にメディアに単球。300 x g で 4 ° C で 5 分間遠心
- 古いメディアを吸引し、遠心管に 10 mL の新鮮なメディアで再懸濁します。メディアで均等な細胞までゆっくりと混ぜます。トリパン ブルー染色、診断を使用してセルをカウントします。
- 90 μ L/ウェル メディアのあたり 4,000 球されるようセルを希釈します。96 ウェル プレートのウェルの細胞の 90 μ L を追加します。24 時間インキュベートします。
注: は、蒸発の違いとプレートの温度変化を避けるためにプレートの外側の端に井戸を使用しないでください。100 μ L の PBS で外装の井戸を埋めます。 - MCP 1 ペプチド、MCP 1 PAM、スクランブルをかけられたペプチッド、または独立した滅菌マイクロ遠心チューブ用の 150 μ L の PBS でスクランブル PAM の 0.15 µmol を溶解します。1、10、および 100 μ M の各サンプルの 65 μ L にするシリアル希釈を実行します。
- 井戸 WEHI 274.1 を含む各濃度の 10 μ L の PBS を追加 (合計ボリューム: まあ、6 行、合計 96 ウェルあたり 100 μ L)。72 時間インキュベートします。
- 10 μ l 添加 (各ウェル内 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS)。1 時間インキュベートします。
- 490 プレート リーダーを使用して吸光度を分析 nm または製造元の指示に基づいて。
- 文化、WEHI 274.1 ダルベッコ変更イーグル培 10% 牛胎児血清 (FBS)、マウス単球を展開 1% ペニシリン-ストレプトマイシンと 0.05 mM 2-メルカプトエタノール 37 ° c 未満 5% CO2通路 5 に。
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ミセル バインディング体外
- 100 μ M Cy5 標識 MCP 1 PAM (DSPE PEG (2000)-Cy5 と MCP 1 PA の 10: 90 モル比) を含むメディアの 2 mL で 6 ウェル プレートの各ウェル内シード 500,000 単球。1 時間インキュベートします。
- 4 ° C で 5 分間 300 × g で遠心分離によって WEHI 274.1 を収集します。メディアを吸い出しなさい。
- 再懸濁します、2 mL の PBS のセルを洗浄します。300 x g で 4 ° C で 5 分間遠心PBS を吸い出しなさい。2 mL の PBS で洗浄工程を繰り返します。PBS を吸い出しなさい。
- セルを修正する冷たい 4% パラホルムアルデヒドの 2 mL を追加します。10 分間室温でインキュベートします。
- ピペット 6 ウェル プレートのウエル内で滅菌ガラス基板上に固定のセル。5 分間 400 × g で遠心分離機します。
- パラホルムアルデヒドを削除します。洗って、2 mL の PBS で 1 回洗浄します。1 ml の PB 再懸濁します
注: ときにすすぎ、上、セルを中断しません。 - スライドに PBS で 90% のグリセロールの 10 μ L を入れてください。針とピンセットを使って、coverslip を拾います。ドライエッジ、カバーガラスの。ゆっくりとスライドに coverslip を置きます下向き。
- 軽くクリアのマニキュアとカバーガラスの端を密封します。画像の準備ができるまで、冷蔵庫に置きます。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) Cy5 用レーザーでインストールされている λ励起を使用 = 650 nm。
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Representative Results
MCP 1 PAM の準備
MCP 1 蛋白質 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] または [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] スクランブル ペプチドの CCR2 結合モチーフ (残 13 35 基) は、N 末端のシステイン残基を追加することによって変更されました。自動ペプチド合成を用いた fmoc 保護を介した固相法による MCP 1 ペプチドが合成されました。粗ペプチドは 0.1% を使用して 50 ° C にある C8 カラムを逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製したアセトニ トリル/水混合媒体の TFA と MALDI 質量分析法 (図 1) によって特徴付けられます。システインを含むペプチドは、DSPE-PEG2000-マレイミド チオエーテル結合を介して DSPE ペグ (2000)-ペプチド複合体をもたらすために共役しました。室温で 24 時間後粗生成物は高速液体クロマトグラフィー (図 2) により精製しました。DSPE (2000)-Cy5 合成した NHS エステル反応を利用します。(2000)-MCP-1 DSPE ペグで組み立て PAMs の単球を対象とした共同と N2、蒸発し、メタノールに溶解することにより作製した DSPE ・ ペッグ (2000)-Cy5 と得られたフィルムだった真空下で一夜干しし、自己水で組み立てや「尾グループ」フォーム MCP 1 PAMs の疎水性相互作用を介して PBS。
MCP 1 PAM のキャラクタリゼーション
DLS データおよび PAMs の単球ターゲットの TEM 画像 (図 3および表 1) 直径 15.3 ± 2.0 nm の分散である、球状ナノ粒子を示した。MCP 1 PAMs とスクランブル PAMs を示したわずかなプラスのゼータ ポテンシャル 12.1 ± 3.1 mV と 13.7 ± 1.9 mV (表 1)。CD は、ミセル内 MCP 1 ペプチド定款が二次構造を強化することを示した (表 2、MCP 1 PAMs: 46.2 β シート ± 0.9%、53.1 の ± 1.4% のランダム コイルおよび無料 MCP1: 34.2 ± 3.5% β シート、65.8 ± 3.5% ランダム コイル)。
体外MCP 1 PAM の解析
In vitro生体適合性や単球のバインディング MCP 1 PAMs は、共焦点顕微鏡で観察した.マウス単球培養 72 時間スクランブル PAM スクランブル ペプチド、MCP 1 PAM MCP 1 濃度の増加と、実行可能な 100 μ M (図 4) まで生体細胞が見つかった。さらに、共焦点顕微鏡は、MCP 1 PAMs スクランブル PAMs (図 5) と比較した場合に単球の特定の結合を示した。
図 1:220 の HPLC クロマト グラム nm (ペプチッド結束の波長) および 254 nm (波長チロシン) MCP 1 ペプチド (A) およびスクランブル ペプチド (7.4 分でピーク箱入り) (B) の。MALDI-TOF 質量スペクトルの MCP 1 ペプチド (C) およびスクランブル ペプチド (D) のピーク [M + H]+ m/z 2,888 (予想される 2,890) を示す 500 5,000 Da の範囲で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:220 の HPLC クロマト グラム nm (ペプチッド結束の波長) および 254 nm (波長チロシン) DSPE ペグ (2000)-MCP-1 (A) および DSPE PEG (2000 年)-(B) をスクランブルします。(16.9 分でボックス化されたピーク)。(C) MALDI-TOF 質量スペクトル DSPE peg (2000)-MCP-1 (2000)-MCP-1 DSPE ペグの MCP 1 と m/z 5,758 (予想される 5,760) でのピーク [M + H]+の m/z 2,888 (予想される 2,890) を示す 1,000-10,000 Da の範囲で。(D) MALDI-TOF 質量 DSPE ・ ペッグ (2000) のスペクトル-でのピーク [M + H]+の m/z 2,887 スクランブル ペプチド (予想される 2,890) と m/z 5,761 (予想される 5,760) を示す 1,000-10,000 Da の範囲でスクランブル DSPE ペグ スクランブルします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:MCP 1 PAM (A) の TEM 画像スクランブル PAM (B)。スケールバー = 100 nm。MCP 1 PAM (C) の数平均サイズ分布、DL (D) を介して PAM をスクランブルします。データは、平均 ± 標準偏差 (n = 3)。(E) MCP 1 とスクランブル ペプチドおよび PAMs の CD 解析 (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:WEHI 274.1 MCP 1 スクランブル PAM. スクランブル ペプチド ペプチド、MCP 1 PAM に 72 時間曝露後マウス単球の生体外での生存率データは、平均 ± 標準偏差 (n = 6)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:MCP 1 PAM (A) の共焦点レーザー顕微鏡画像スクランブル PAM (B) 10 mol % Cy5 PA (赤) を組み込んだ孵化 1 h. スケール バーの WEHI 274.1 と = 20 μ m ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
| PAMs | 直径数アベニュー (nm) | PDI | ゼータ電位 (mV) |
| MCP 1 | 15.3 ± 2.0 | 0.119 ± 0.006 | 12.1 ± 3.1 |
| スクランブル | 16.9 ± 1.4 | 0.232 ± 0.019 | 13.7 ± 1.9 |
| PBS バッファーで測定されます。データは ± SD. を意味として表されます。 | |||
表 1:サイズ、分散、および PAMs のゼータ電位。
| α ヘリックス (%) | b シート (%) | ランダム コイル (%) | |
| MCP 1 ペプチド | 0.0 ± 0.0 | 36.2 ± 2.2 | 63.8 ± 1.8 |
| MCP 1 PAM | 0.7 ± 0.6 | 46.2 ± 0.9 | 53.1 ± 1.4 |
| スクランブル ペプチド | 0.0 ± 0.0 | 43.7 ± 2.1 | 56.3 ± 3.5 |
| スクランブル PAM | 0.0 ± 0.0 | 60.7 ± 0.2 | 39.3 ± 0.2 |
表 2:ペプチドおよび PAMs の二次構造の構成。
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Discussion
MCP 1 PAMs が有望な分子イメージング プラットフォーム ターゲットの親水性ペプチドとナノ粒子の自己組織化の性質をドライブ疎水性の尾部から成る。この単球を対象としたミセルは、単純な合成と精製ステップ MCP 1 ペプチドおよび DSPE PEG (2000)-MCP 1 で用意できます。Pam がある生体内で分子イメージングなどの多くの有益な特性の自己集合構造と化学的多様性の他のイメージングの鎖の結合を可能にする、本質的な生分解性、温和な条件下または興味の特定のサイトを選択的に配信するペプチドをターゲットします。粒子サイズ、形状、および構成は、ペプチド、疎水性尾またはアプリケーション22,33のさまざまな最適な化学および物理的特性を許可するミセル濃度を変更することによって調整できます。
このプロトコルのいくつかの制限を記載する必要があります。まず、Pam は、疎水性相互作用によって駆動される、ので、親水性、ターゲット部位のミセル表面に提示することにより、ターゲットのペプチドを構築する必要です。ペプチッド シーケンスは疎水性、1 つまたは 2 つの記事を C 末端には、親水性アミノ酸添加を収容することができますが、ミセル内でペプチドの二次構造に影響を与える可能性アミノ酸を添加場合、によりプロパティを変更する、ペプチドはタンパク質44,45で本来の状態に。第二に、低濃度で PAMs 安定性の悪い環境である水溶液、CMC、PAs46ミセル構造を形成するために必要な最小濃度に大きく依存しています。CMC、下ミセルは、単量体 PA 個々 に逆アセンブル、キャリアとして機能する特定のサイト47で薬をアンロードしてミセルを制限します。この欠点を軽減するために、CMC は疎水性尾48,49のチェーンの長さを増やすことによって減らすことができます。最後に、PA の二次構造はリガンド26の効率と同様、ミセルの構造と安定性に影響すること時間が、変更することがソリューションに PAMs の長期保存はお勧めできません。
合計では、このプロトコルは、アテローム性動脈硬化のイメージングのための堅牢な自己組織化ペプチド ミセルを用いたナノ医療戦略を示します。MCP 1 PAMs は、体に内因性の要素からインスピレーションを得たが、ミセルのコンポーネントと生体適合性、生分解性、無毒。もっと重大に、MCP 1 PAMs は動脈硬化性プラークの段階を区別する非侵襲的アプローチを促進する単球は、プラークの進展に比例して増加する優遇バインドを持ちます。このプラットフォームのモジュール性、により PAMs は治療、ペプチド、イメージングの部分、および核酸ターゲット追加を組み込むことができます。したがって、これらの多機能のミセルのような動的な機能を考えると、これらの粒子が動脈硬化やその他の疾患で臨床的翻訳の偉大な約束を保持することと考えます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、南カリフォルニア大学、国立心臓、肺と血の協会 (NHLBI)、R00HL124279、エリとエディス幅広いイノベーション賞、および L.K. ホイッティア財団の非癌から助成を受けたいと思いますトランスレーショナル研究賞は、EJC に与えられました。著者の電子顕微鏡と微量分析、NanoBiophysics の卓越性のセンター、分子特性の卓越性のセンター、臨床画像センターの支援のための南カリフォルニアの大学でセンターに感謝します。機器のセットアップ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
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