合成やペプチド両親媒性分子ミセルの単球ターゲットの評価手法を提案し、生体適合性および単球にバインドするミセルの機能をテストするための試金の対応します。
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この記事について
サマリー
要約
動脈硬化は 1730 万生活を毎年要求する心血管疾患死、世界中の主要な原因への主要コントリビューターです。動脈硬化も突然死や心筋梗塞、不安定プラークは破裂し、警告することがなく血管を閉塞、によって扇動されるの主要な原因です。現在の画像診断法は、安定・不安定プラーク破裂を区別できません。病気の組織に結合する部分をターゲットのさまざまな変更できます、ペプチド両親媒性ミセル (PAMs) はこの欠点を克服することができます。単球は、球の大きい蓄積が破裂しやすいプラークを関連付けながら、動脈硬化の初期マーカーのように示されています。したがって、単球を対象とするナノ粒子は、アテローム性動脈硬化のさまざまな段階を識別する使用できます。ここでは、その終わりには PAMs の単球ターゲットの準備のためのプロトコル記述 (単球走化性因子蛋白質 1 (MCP 1) PAMs)。MCP 1 PAMs が 15 のフォームのナノ粒子に温和な条件下での合成を通じて組み立てられ自己と表面電荷は中性付近の径 nm。体外、 PAMs 生体適合性であると見つけられたおよび単球に高い結合親和性を持っていた。記載法は、動脈硬化だけでなく、その他の炎症性疾患のアプリケーションの広い範囲のための約束を示す.
概要
心血管疾患は、グローバル、約 1730 万死亡世界中1死の主要な原因に残る。心血管疾患は、アテローム性動脈硬化プラークは動脈、それにより阻害血ボディ2,3のセルに酸素の流れ構築する条件で貢献しています。動脈硬化の進行には、炎症反応、不規則な脂質代謝、プラーク形成、プラーク破裂、心筋梗塞4,5につながる、肥厚、動脈硬化が含まれます。血管内皮細胞は、MCP 1 球6,7,8の表面に C C ケモカイン受容体 (CCR2) にバインドするは、サイトカイン、および接着分子を表現します。酸化コレステロール地域で炎症反応を増幅し、組織の損傷や不安定や脆弱なプラーク9,の形成につながるプラーク形成の初期の段階に単球をマクロファージに変換します10。
伝統的に、アテローム性動脈硬化は、血管造影または超音波
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プロトコル
注: 試薬の MSDS を読むし、地方機関に必要なすべての化学安全対策に従ってください。
1. MCP 1 PAMs の準備
-
MCP 1 ペプチドの作製
- Fmoc 保護-L-Lys (Boc) の 0.25 モル重量を量り-反応容器 (RV) の王。化学の発煙のフード 5 mL dimethylforamide (DMF) と RV の側をすすいでください。
- 卓上型自動ペプチド合成装置に RV をロードします。あらかじめパッケージ化されたアミノ酸バイアル、N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', C から N 末端をロードします。最終的な脱保護手順の終わりに空のバイアルが含まれます。
注: シーケンス、N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C'、スクランブル ペプチドも合成できる同じプロトコルを使用しています。 - 合成が完了すると、ペプチド樹脂から転送 RV 2 〜 3 mL のメタノールを用いたシンチレーション バイアルに樹脂のすべてが転送されるまで。樹脂は、底に沈んでいる後、培養上清中のメタノールを削除し、乾燥するまで残りを蒸発します。真空乾燥室温でさらに 2 時間または一晩。
- 12 mL 胸の谷間溶液化学の発煙のフード 94:2.5:2.5:1 vol %trifluor....
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結果
MCP 1 PAM の準備
MCP 1 蛋白質 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] または [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] スクランブル ペプチドの CCR2 結合モチーフ (残 13 35 基) は、N 末端のシステイン残基を追加することによって変更されました。自動ペプチド合成を用いた fmoc 保護を介した固相法による MCP 1 ペプチドが合成されました。粗ペプチドは 0.1% を使用して 50 ° C にある C8 カラムを逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製したアセトニ トリル/水混合媒体の TFA と MALDI 質量分析法 (図 1) によって特徴付けられます。システインを含むペプチドは、DSPE-PEG2000-マレイミド チオエーテル結合を介して DSPE ペグ (2000)-ペプチド複合体をもたらすために共役しました。室温で 24 時間後粗生成物は高速液体クロマトグラフィー (
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ディスカッション
MCP 1 PAMs が有望な分子イメージング プラットフォーム ターゲットの親水性ペプチドとナノ粒子の自己組織化の性質をドライブ疎水性の尾部から成る。この単球を対象としたミセルは、単純な合成と精製ステップ MCP 1 ペプチドおよび DSPE PEG (2000)-MCP 1 で用意できます。Pam がある生体内で分子イメージングなどの多くの有益な特性の自己集合構造と化学的多様性の他のイメージングの鎖の結合を可能にする、本質的な生分解性、温和な条件下または興味の特定のサイトを選択的に配信するペプチドをターゲットします。粒子サイズ、形状、および構成は、ペプチド、疎水性尾またはアプリケーション22,33のさまざまな最適な化学および物理的特性を許可するミセル濃度を変更することによって調整できます。
このプロトコルのいくつかの制限を記載する必要があります。まず、Pam は、疎水性相互作用によって駆動される、ので、親水性、ターゲット部位のミセル表面に提示す.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者は、南カリフォルニア大学、国立心臓、肺と血の協会 (NHLBI)、R00HL124279、エリとエディス幅広いイノベーション賞、および L.K. ホイッティア財団の非癌から助成を受けたいと思いますトランスレーショナル研究賞は、EJC に与えられました。著者の電子顕微鏡と微量分析、NanoBiophysics の卓越性のセンター、分子特性の卓越性のセンター、臨床画像センターの支援のための南カリフォルニアの大学でセンターに感謝します。機器のセットアップ。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ペプチド合成用 | 1,2-エタンジチオール | VWR | E0032 |
| 培養用 | 10mL使い捨て血清ピペット | VWR | 89130-898 |
| 15mL遠心分離管、ポリプロピレン | VWR | 89401-566 | さまざまな用途向け |
| 2,5-ジヒドロキシ安息香酸、99% | MALDI 25 | ッシャーサイエンティフィック | |
| 細胞培養用血清ピペット | VWR | 89130-900 | |
| 2-メルカプトエタノール、50 mM | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 31350010 | 培養用 |
| 5 mL ディスポーザブル血清ピペット | VWR | 89130-896 | 細胞培養 |
| 50 mL 遠心分離チューブ | VWR | 89039-658 | さまざまな用途用 |
| 75 cm2 培養フラスコ | フィッシャーサイエンティフィック | 13-680-65 | 細胞培養用 |
| 75 mL 反応容器 | Protein Technologies | 3000005 | ペプチド合成用 |
| 96 ウェル細胞培養プレート | VWR | 40101-346 | MTS アッセイ |
| アセトニトリル、HPLC グレード | Fisher Scientific | A998SK-4 | HPLC 精製 |
| ホウケイ酸ガラス、1 ドラム | VWR | 66011-041 | PAM 合成用 |
| ホウ珪酸ガラスピペット、ロングチップ | VWR | 14673-043 | 様々な用途に対応 |
| カバースリップ、0.16-0.19 mm、22 x 22 mm | フィッシャーサイエンティフィ | 12-542B | 共焦点顕微鏡用 |
| Cy5 アミン | Abcam | ab146463 | ペプチド抱合用 |
| ジエチルエーテル、ACSグレード | フィッシャーサイエンティフィック | E138-1 | ペプチド沈殿用 |
| 使い捨てシリンジ、20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | HPLC精製用 |
| ダブルノイバウアールール血球計算計 | VWR | 63510-13 | 細胞計数用 |
| DSPE-PEG(2000) アミン | Avanti | 880128P | ペプチド抱合 |
| DSPE-PEG(2000) マレイ | Avanti | 880126P | ペプチド抱合用 |
| DSPE-PEG(2000)-NHSエステル | Cy5 | Nanocs | PG2-DSNS-10K |
| 細胞培養のための | Sigma Aldrich | D5796-500ML | |
| ウシ胎児血清、修飾された、熱不活性化 | 細胞培養のための | ThermoFisher Scientific | 10438026 |
| 合成 | |||
| ペプチド合成のためのFmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | タンパク質技術 | PS3-H5-RBF | 合成 |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | タンパク質技術 | PS3-H5-NT | ペプチド合成のための |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | タンパク質技術 | 合成のための | PS3-H5-CT |
| 合成のための | Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | タンパク質技術 | PS3-H5-I |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | タンパク質技術 | PS3-H5-L | ペプチド合成のための |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | タンパク質技術PS3-H5-KBC | ペプチド合成のための | |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | タンパク質技術 | PS3-H5-F | 合成のために |
| 合成のための | Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | タンパク質技術 | PS3-H5-SB |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | タンパク質技術 | PS3-H5-TB | ペプチド合成のための |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | タンパク質技術 | PS3-H5-YB | ペプチド合成のための |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | タンパク質技術 | PS3-H5-V | 合成のために |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang樹脂、ペプチド合成用100-200メッシュ | Novabiochem | 856013 | |
| ギ酸、オプティマLC / MSグレード | HPLC精製用 | フィッシャーサイエンティフィック | A117-50 |
| 焦点顕微鏡用 | グリセロール | VWR | M152-1L |
| 計数用 | ハンドタリーカウンター | ッシャーサイエンティフィック | S90189 |
| マグネティックスターバー、卵形 | VWR | 58949-006 | ペプチド結合 |
| 用 メタノール、ACS認定 | フィッシャーサイエンティフィック | A412-4 | PAM合成用 |
| MTS細胞増殖比色アッセイキット | VWR | 10191-104 | MTSアッセイ |
| 用 N,N-ジメチルホルムアミド、シーケンシンググレード | フィッシャーサイエンティフィック | BP1160-4 | 合成 |
| N-メチルモルホリン | タンパク質技術 | S-1L-NMM | ペプチド合成 |
| パラホルムアルデヒド | フィッシャー 細胞 | 固定用 | AC416780250 |
| PBS、pH 7.4 | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 10010049 | さまざまなアプリケーション用 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン、10,000 U/mL | モフィッシャー サイエンティ | 15140122 | 培養用 |
| ペプチド合成容器、25 mL | ペプチド合成 | フィッシャーサイエンティフィック | CG186011 |
| タングステン酸 | Fisher Scientific | A248-25 | TEM |
| ピペリジン | スペクトル | 用 P1146-2.5LTGL | ペプチド合成用 |
| プレーンガラス顕微鏡スライド 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | 共焦点顕微鏡用 |
| 試薬リザーバー、滅菌 | 細胞培養用 | VWR | 95128093 |
| TEM用自己閉鎖ピン | TedPella | 515 | |
| TEMサポートフィルム TEM用 | TedPella | 01814F | |
| トリフルオロ酢酸 | ペプチド切断およびHPLC精製用 | フィッシャーサイエンティフィック | BP618-500 |
| 切断 | トリイソプロピルシラン | VWR | TCT1533-5ml |
| トリパンブルー溶液、 | 細胞計数用 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15250061 |
| 共焦点顕微鏡用 | 汎用鋸歯状 | VWR | 231-SA-SE |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | マウス単球 |
| 自動ベンチトップペプチドシンセサイザー | プロテインテクノロジーPS3 | ベンチトップペプチドシンセサイザー | |
| &α;-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、99% | シグマアルドリッチ | 476870-2G | マルディ用 |
参考文献
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12....
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