Dette dokumentet presenterer en metode som involverer syntese og karakterisering av monocyte målretting peptid amphiphile micelles og tilhørende søk for å teste for biocompatibility og evne til micelle å binde til monocytter.
Atherosclerosis er en stor bidragsyter til hjerte-og karsykdommer, den ledende dødsårsaken som er over hele verden, som hevder 17,3 millioner liv årlig. Atherosclerosis er også den ledende årsaken til plutselig død og hjerteinfarkt, konstruert av ustabilt plakk som brudd og occlude blodkaret uten advarsel. Gjeldende imaging modaliteter ikke kan skille mellom stabil og ustabil plaketter som brudd. Peptid amphiphiles micelles (PAMs) kan overvinne denne ulempen som de kan endres med en rekke målretting moieties som binder seg spesifikt til syke vev. Monocytter har vist seg å være tidlig markører for aterosklerose, mens stor ansamling av monocytter er forbundet med plaketter utsatt for brudd. Derfor kan nanopartikler som kan målrette monocytter brukes å diskriminere ulike stadier av aterosklerose. Derfor, her, beskriver vi en protokoll for utarbeidelse av monocyte målretting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs er selv samlet gjennom syntese under mild forhold til skjemaet nanopartikler 15 nm i diameter med nær nøytrale overflaten kostnad. In vitro, PAMs ble funnet for å være biokompatible og hadde en høy forpliktende tilhørighet for monocytter. Metodene som er beskrevet her viser løftet for en rekke programmer i aterosklerose samt andre inflammatoriske sykdommer.
Karsykdommer gjenstår for å være de viktigste årsakene til død globalt med ca 17,3 millioner dødsfall verden1. Kardiovaskulære sykdommer er bidratt av aterosklerose, en tilstand der Plaketter bygge opp i den arteriene, og dermed hemme blod og oksygen til cellene i kroppen2,3. Progresjon av aterosklerose innebærer jevning og herding av arteries ved en inflammatorisk respons, uregelmessig lipid metabolisme og plakk oppbygging, fører til plakk brudd og hjerteinfarkt4,5. Endotelceller uttrykke cytokiner og vedheft molekyler, som inkluderer MCP-1 som binder til C-C chemokine reseptoren (CCR2) på overflaten av monocytter6,7,8. Oksidert kolesterol konverterer monocytter til makrofager under den tidlige fasen av plakk formasjon, som forsterker inflammatorisk respons i regionen og fører til vev skade og dannelsen av ustabil eller sårbare plaketter9, 10.
Tradisjonelt evalueres aterosklerose ved å vurdere luminal stenose av anatomiske bildevisning angiography eller ultralyd11,12. Men disse metodene kan bare bestemme alvorlig innsnevring av arterieveggen og ikke tidlig stadium av aterosklerose, som første plakk veksten får arteriell ombygging å opprettholde arterien størrelse og blood flow rate12,13, 14. Derfor underrepresent angiograms aterosklerose utbredelse. I tillegg noninvasive Bildeteknikker som enkelt Foton utslipp beregnet tomografi, fantes et positron utslipp tomografi og magnetisk resonans imaging har nylig blitt brukt å karakterisere plakk morfologi som de kan gi første detaljene og karakterisering av plaketter. Men disse modaliteter er ofte begrenset av mangel på sensitivitet, romlig oppløsning, eller krever bruk av ioniserende stråling, gjør tenkelig plakk progresjon på ulike stadier mye mer utfordrende15,16, 17. En tenkelig levering system som vil spesielt identifisere plaketter på ulike stadier av aterosklerose gjenstår å bli utviklet.
Nanopartikler har vist seg for å være en ny plattform for i vivo plakk målretting og diagnostikk18,19,20,21. PAMs er spesielt fordelaktige deres kjemiske mangfold og muligheten til å huse en rekke moieties, komposisjoner, størrelsene, former og overflate functionalization22. Peptid amphiphiles (PAs) består av en hydrofile, peptid “headgroup” festet til en hydrofobe hale, som typisk lipider; Denne amphiphilic struktur gir selv montering evner og muliggjør en multivalent visning av peptider på overflaten av partikkel22,23,24. Peptid-headgroups kan påvirke partikkel formen gjennom folding og hydrogen bånd mellom peptider25. Peptider som brett gjennom β arks samhandling har vist seg å danne langstrakt micelles, mens α-spiralformede bekreftelse kan danne både avlang og sfærisk micelles22,23,24, 25,26,27. Polyetylenglykol (PEG) linkers som skjerme overflaten ansvaret for peptid kan plasseres mellom den hydrofile peptid og hydrofobe halen av PAMs, forbedre tilgjengeligheten av hydrogenion i systemisk sirkulasjon28, 29 , 30 , 31. PAMs er også en fordel fordi de er biokompatible og har vist seg å ha en rekke programmer32,33. VANNLØSELIGHET av micelles tilbyr en fordel over andre hydrogenion-baserte systemer som enkelte polymere nanopartikler som er ikke løselig i vann og måtte bli suspendert i solubilizers for injeksjoner34. I tillegg gjør muligheten til å lage PAMs som Demonter som svar på en bestemt stimuli PAMs en attraktiv kandidat for kontrollert intracellulær stoffet levering35.
Binding til CCR2 reseptoren og samler i aortabuen, var PAMs tidligere utviklet for monocytt målretting for å overvåke ulike stadier av aterosklerotisk lesjoner i aorta9. I ApoE– / – mus, monocyte akkumulering øker proporsjonalt plakk progresjon36. Videre ble det funnet at pasienter med utsatt for brudd, sent plaketter inneholder større mengder monocytter37. Endring av PAMs å innlemme MCP-1 er derfor nyttig fordi det gir større målretting spesifisitet og differensiering mellom tidlig og sen-stadium aterosklerotisk lesjoner. Disse proof-of-concept studier også bekreftet at PAMs er trygt nok til å brukes pre-clinically og fjernes renally38. Siden monocytter og betennelse er karakteristisk for andre sykdommer, har MCP-1 PAMs potensial til å bli brukt for terapeutisk og diagnostiske programmer i andre sykdommer utover aterosklerose8,39,40 , 41.
Her rapporterer vi fabrikasjon av svært skalerbar og selv montert MCP-1 PAMs som vist partikkels optimal størrelse, overflate kostnad og selektiv målretting til monocytter for forbedret tenkelig søknadene i åreforkalkning.
MCP-1 PAMs er en lovende molekylær tenkelig plattform, består av en hydrofile rettet mot peptid og hydrofobe hale som driver selv sammensatte typen hydrogenion. Denne monocytt målretting micelle kan tilberedes ved enkel syntese og rensing trinnene i MCP-1 peptid og DSPE-pinne (2000)-MCP-1. PAMs har mange fordelaktige egenskaper for i vivo molekylær imaging som deres selvtillit forsamlingen under mild forhold, iboende biodegradability og strukturelle og kjemiske mangfoldsdirektoratet tillater for inkorporerin…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne økonomisk støtte fra University of Southern California, nasjonale hjertet, lunge, og blod Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli Edythe bred Innovation Award og L.K. Whittier Foundation ikke-kreft Translasjonsforskning forskning prisen gitt til EJC. Forfatterne takker sentrum for elektronmikroskop og Microanalysis, Center of Excellence på NanoBiophysics, Center of Excellence for molekylær karakterisering og Translational Imaging Center ved University of Southern California om hjelp instrumental oppsett.
1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |