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Neuroscience

अलगाव और तंत्रिका Progenitors की खेती के बाद क्रोमेटिन-Immunoprecipitation के citrullinated 3 Lysine ७९ Dimethylation निशान

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

हम एक प्रभावी और प्रतिलिपि विधि को अलग और संस्कृति क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के लिए भ्रूण और प्रसव मस्तिष्क ऊतक से तंत्रिका जनक कोशिकाओं citrullinated 3 lysine ७९ dimethylation (H3K79me2)-एक citrullinated के भीतर स्थित निशान के लिए मौजूद गोलाकार डोमेन ऑफ citrullinated ३.

Abstract

मस्तिष्क विकास एक जटिल प्रक्रिया है, जो morphogens और अलग transcriptional कार्यक्रमों की ढाल द्वारा एक temporo-स्थानिक तरीके से नियंत्रित किया जाता है । इसके अतिरिक्त, epigenetic क्रोमेटिन संशोधनों, जैसे citrullinated मिथाइल, स्थापित करने और इस प्रक्रिया के भीतर विशिष्ट कोशिका भाग्य को बनाए रखने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका है । citrullinated मिथाइल का विशाल बहुमत लचीली citrullinated पूंछ पर होता है, जो citrullinated संशोधक, इरेज़र, और citrullinated रीडर प्रोटीन के लिए सुलभ होता है । इसके विपरीत, H3K79 मिथाइल citrullinated 3 के गोलाकार डोमेन में स्थित है और विभिन्न विकास कार्यों में फंसा हुआ है । H3K79 मिथाइल evolutionarily संरक्षित है और होमो sapiens से लेकर Saccharomyces cerevisiaeतक प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला में पाया जा सकता है । संशोधन जीवों के भीतर अलग सेल आबादी में होता है, तंत्रिका progenitors सहित. citrullinated 3 के गोलाकार डोमेन में H3K79 मिथाइल के स्थान का आकलन करना कठिन बना देता है । यहाँ, हम अलग और संस्कृति cortical जनक कोशिकाओं (cpc) से भ्रूण cortical मस्तिष्क ऊतक (ई 11.5-ई 14.5) या अनुमस्तिष्क दानेदार ंयूरॉन progenitors (CGNPs) से प्रसव ऊतक (P5-P7), और कुशलता से करने के लिए वर्तमान तरीकों immunoprecipitate मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) और जीनोम चौड़ा अनुक्रमण के लिए H3K79me2 ।

Introduction

संवेदी, मोटर, और मस्तिष्क के संज्ञानात्मक कार्यों अत्यधिक जटिल और शारीरिक और पर्यावरणीय परिवर्तन करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । मस्तिष्क तीन सामान्य भागों के होते हैं हिंद-, मध्य, और forebrain, जो गहराई से जुड़े हुए हैं. forebrain के भीतर, telencephalon एक पृष्ठीय telencephalon (डीटी) और एक ventral telencephalon (VT) में विभाजित किया जा सकता है । चूहों के डीटी छह cortical परतों जो e 11.5 और e 18.5 के बीच एक "अंदर-बाहर" तरीके से गठन कर रहे है1के होते हैं । वीटी विकास में ganglionic eminences है, जो बाद में बेसल गैंग्लिया2,3फार्म शामिल हैं । कई प्रकार के सेल में वर्गीकृत किया जा सकता है स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र जैसे न्यूरॉन्स, astrocytes, या oligodendrocytes4, जो एक temporo-स्थानिक तरीके से विकसित5. सबसे पहले, तंत्रिका जनक कोशिकाओं (NPCs) न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के लिए वृद्धि दे, वीटी में न्यूरॉन्स, और प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में डीटी, और बाद में glial कोशिकाओं पर (जैसे, astrocytes6). cortical विकास के दौरान, सबसे सतही परत (परत मैं), जो Cajal-Retzius कोशिकाओं में शामिल है, पहले का गठन किया है । फिर, e 12.5 और e 14.5 के बीच, NPCs गहरी न्यूरॉनिक परतों (VI, V) उत्पन्न करते हुए १४.५ और १६.५ के बीच, progenitors ऊपरी परत को जन्म दे (IV-II) न्यूरॉन्स7,8. न्यूरॉन पहचान अलग morphogen-प्रेरित temporo द्वारा निर्दिष्ट किया जाता है-स्थानिक transcriptional प्रोग्राम्स और साथ ही epigenetic प्रोग्राम्स2.

सेरिबैलम, जो मोटर समंवय में फंसा हुआ है, hindbrain में स्थित है और चूहों में E10 और मोटे तौर पर P20 के बीच में विकसित करता है9। इसमें अनुमस्तिष्क प्रांतस्था और अनुमस्तिष्क नाभिक10शामिल हैं । वयस्क अनुमस्तिष्क प्रांतस्था तीन परतों के होते हैं, बाहरी आणविक परत, Purkinje कोशिका परत, और अंतरतम दानेदार परत दानेदार ंयूरॉंस से युक्त10। अनुमस्तिष्क granules कोशिकाओं छोटी ंयूरॉंस और हड्डीवाला मस्तिष्क में सभी ंयूरॉंस के बारे में ८०%11का प्रतिनिधित्व करते हैं । वे बाहरी कीटाणु क्षेत्र में स्थित पुरोगामी से विकास करते हैं और Purkinje सेल लेयर के माध्यम से अपने गंतव्य12में माइग्रेट करते हैं । telencephalon में की तरह, सेरिबैलम के विकास के कई महत्वपूर्ण morphogens है, जो विशिष्ट समय और अंतरिक्ष पर निर्भर कार्य किया है और निर्धारित transcriptional कार्यक्रम10द्वारा विनियमित है ।

cortical और अनुमस्तिष्क परतों के विकास के विशिष्ट morphogens की transcriptional अभिव्यक्ति द्वारा नियंत्रित किया जाता है और, इस प्रकार, डीएनए की क्रोमेटिन राज्य द्वारा । एक सरलीकृत दृश्य में, क्रोमेटिन राज्यों को transcriptionally मूक क्षेत्रों के रूप में transcriptionally सक्रिय और heterochromatin के रूप में euchromatin में विभाजित किया जा सकता है । क्रोमेटिन की मूल इकाई के रूप में nucleosome में प्रत्येक कोर citrullinated H2A, H2B, H3, और H4 की दो प्रतियां हैं, जो13डीएनए के १४७ आधार जोड़े से घिरा हुआ है । Histones अत्यधिक के बाद अनुवाद कर रहे है मिथाइल, acetylation, फास्फारिलीकरण, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, अमीन, और रेखा isomerization14,15द्वारा संशोधित । citrullinated lysine मिथाइल को सबसे अधिक स्थिर citrullinated संशोधन माना जाता है जो प्रतिलेखन, प्रतिकृति, पुनर्संयोजन16, डीएनए-क्षति प्रतिक्रिया17, और जीनोमिक18का मुद्रण करता है । Lysines मोनो, di-, या त्रि-मिथाइलयुक्त19 हो सकता है और न केवल सुलभ citrullinated पूंछ पर लेकिन यह भी histones20के गोलाकार डोमेन के भीतर दिखाई देते हैं । H3K4 और H3K36 पर विशिष्ट मिथाइल मुख्य रूप से euchromatin के साथ जुड़े हुए हैं, H3K9, H3K27, या H4K20 में विशिष्ट मिथाइल heterochromatic क्षेत्रों में मुख्य रूप से पाए जाते हैं, हालांकि सभी अवशेषों citrullinated पूंछ के भीतर स्थित है14, 19,21. H3K79 मिथाइल citrullinated गोलाकार डोमेन के भीतर स्थित है और transcriptional गतिविधि के साथ संबद्ध किया गया है, लेकिन यह भी transcriptionally निष्क्रिय जीनोमिक क्षेत्रों के साथ22। संशोधन के बाद से यह खमीर, बछड़ा थाइमस, चिकन, और मानव23में मनाया गया है संरक्षण evolutionarily है । H3K79 मोनो, डि, और trimethylation (H3K79me1, me2, me3) catalyzed citrullinated methyltransferases24,25 और परमाणु सेट डोमेन युक्त प्रोटीन 2 (DOT1L)26द्वारा Nsd2 हैं । DOT1L प्रसार में फंसा हुआ है, डीएनए की मरंमत, और सेलुलर reprograming27। चूहों में Dot1l की हानि विकासात्मक चरण e 10.528,29के आसपास जंम के पूर्व की मृत्यु की ओर जाता है । हृदय विकास के दौरान और myocardiocyte विभेद में, DOT1L जीन अभिव्यक्ति विनियमन30के लिए आवश्यक है । केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, DOT1L समारोह तंत्रिका ट्यूब विकास में फंसाया जा सकता है31, यह forebrain विकास के दौरान Tbr1अभिव्यक्ति को दबाने में शामिल है३२, और एर के विनियमन में कार्य कर सकते हैं-तनाव प्रतिक्रिया३३जीन । संदर्भ-निर्भर सक्रिय या H3K79me के दमन कार्रवाई, विशेष रूप से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास की तरह vivo स्थितियों में के साथ, केवल आंशिक रूप से३२समझा तारीख है । चूंकि H3K79 मिथाइल citrullinated 3 के गोलाकार डोमेन में स्थित है, यह लचीली citrullinated पुच्छ23पर संशोधनों की तुलना में कम पहुंच योग्य है sterically है । H3K79 मिथाइल के समारोह को समझने के लिए, विश्वसनीय और प्रतिलिपि विश्लेषण तरीकों को निर्धारित करने के लिए इसके स्थान और जीनोमिक वातावरण की जरूरत है । इस तरीके कागज में, हम वर्तमान अलगाव के तरीकों के विभिंन तंत्रिका progenitors (cpc के लिए प्रांतस्था और CGNPs के लिए सेरिबैलम), प्रभावी DOT1L अवरोधक उपचार, और एक चिप विधि H3K79 के माध्यम से qPCR मिथाइल का विश्लेषण करने के लिए या अलग समय पर अनुक्रमण cortical और अनुमस्तिष्क विकास के दौरान अंक । प्रोटोकॉल और उसकी संभावनाओं के ओवरव्यू के लिए, चित्र 1देखें ।

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Protocol

फ्रीबर्ग और स्थानीय प्राधिकारियों के पशु कल्याण समितियों ने निंनलिखित प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी पशु प्रयोगों (G12 13, जी१६/11) को अनुमोदित किया ।

1. तैयारी

  1. cpc अलगाव के लिए तैयारियां
    1. सेट प्रांतस्था विकास के विभिंन चरणों में भ्रूण प्राप्त करने के लिए समय पर सहवास (e 11.5 और ई 14.5 के बीच) । तनाव NMRI (नौसेना चिकित्सा अनुसंधान संस्थान) के चूहों का प्रयोग करें जो कम से कम 8 सप्ताह पुराना है । संभोग के बाद, एक सकारात्मक योनि प्लग पर ई 0.5 पर विचार करें ।
    2. करने के लिए पर्याप्त सामग्री है, एक H3K79me2 चिप के लिए NMRI चूहों के एक कूड़े का उपयोग cortices से e 12.5 या ई 14.5 । बाद में भ्रूण चरणों के लिए, अधिक चिप विश्लेषण (औसत कूड़े का आकार NMRI: 10 भ्रूण) के लिए एक कूड़े का उपयोग करें ।
    3. शांत हांक ´ एस संतुलित नमक समाधान (HBSS) और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (आरटी पर लंबी अवधि के भंडारण) ।
    4. Equilibrate 4 ° c संग्रहीत Trypsin-EDTA (०.०५% w/v) से ३७ ° c ।
    5. तैयार cortical-सेल मीडियम (सीसीएम): न्यूरॉन्स के लिए मध्यम पूरक ( सामग्री की तालिकादेखें) 2% की अंतिम सांद्रता के साथ (v/v) बी-27 अनुपूरक, 5 µ g/एमएल एपीओ-कैल्सीटोनिन, 1 µ जी/एमएल Glutathione, ०.५ मिमी एल-glutamine, ०.८ µ जी/एमएल सुपरऑक्साइड dismutase, और 1% (v/ पेनिसिलिन-Streptomycin-निओमायसिन एंटीबायोटिक मिश्रण । यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । प्रयोग के लिए, मध्यम को ३७ डिग्री सेल्सियस तक equilibrate ।
    6. गल भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), aliquot यह (५० मिलीलीटर प्रत्येक), और equilibrate एक aliquot करने के लिए ३७ ° c (लंबी अवधि के भंडारण पर-20 ° c) ।
    7. सेल संस्कृति के लिए एच2में DNAse 1 (10 मिलीग्राम/एमएल) के स्टॉक्स तैयार करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots स्टोर ।
    8. यदि आवश्यक हो, विशिष्ट DOT1L अवरोधकों सीआईबी-५६७६ या DMSO में SGC0946 १०० mM के एक शेयर एकाग्रता को भंग । 0 दिन में कोशिकाओं को 1-5 µ एम के अंत एकाग्रता लागू करें और अवरोधक हर दो दिन फिर से लागू ।
    9. सीपीसी की खेती के लिए कोट सेल कल्चर प्लेट्स (6 अच्छी तरह से या 12 अच्छी तरह से) पाली के साथ-L-ornithine hydrobromide (1 मिलीग्राम/एमएल में १५० mM बोरिक एसिड पीएच ८.४) के लिए कम से 1 ज आरटी में और बाद में laminin के साथ (1 mg/
  2. CGNP अलगाव के लिए तैयारियां
    1. सेरिबैलम के अलगाव के लिए P5-P7 जानवरों (चिप और शर्त प्रति 3-5 पशुओं) उत्पन्न करने के लिए चूहों की एक उचित सहवास को व्यवस्थित करें ।
    2. HBSS/ग्लूकोज HBSS बफर करने के लिए 6 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज को जोड़कर तैयार करें ।
    3. 1% (v/v) N2 supplement, 1% (v/v) पेनिसिलिन-Streptomycin-निओमायसिन, 25 mM KCl और 10% FCS को DMEM-F12 जोड़कर CGNP सेल कल्चर मीडियम (CGM) तैयार करें । CGNP खेती के लिए FCS बिना CGM माध्यम तैयार लेकिन ०.६ µ जी/एमएल सोनिक हेज हॉग (श्श्श) (CGM-श्श्श) और जब जरूरत ३७ डिग्री सेल्सियस करने के लिए equilibrate ।
    4. कोट 6-well सेल कल्चर प्लेट्स विथ १०० µ g/मब पाली-डी-lysine फॉर 1-2 h फॉर आरटी at glia-सेल रिमूवल. बाद में दो बार बाँझ ddH2ओ के साथ धोने और प्लेटें सूख जाने । 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम एक सप्ताह के लिए प्लेटों की दुकान ।
    5. CGNPs कोट 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट की खेती के लिए पाली के साथ-L-ornithine (०.१ मिलीग्राम/एमएल) 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में । बाद में सेल संस्कृति के लिए एच2ओ के साथ दो बार धोने और प्लेटें सूख जाने ।
      नोट: प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम एक सप्ताह के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
    6. HBSS/ग्लूकोज में ०.०२५% trypsin (डब्ल्यू/वी) तैयार करें और जरूरत पड़ने पर इसे ३७ डिग्री सेल्सियस तक equilibrate ।
  3. H3K79me2 की चिप के लिए तैयारियां
    1. तैयार पीएफए (1% में पंजाब, पीएच 8) हौसले से पहले crosslinking क्रोमेटिन । माइक्रोवेव में पीएफए हीट ५० मिलीलीटर पंजाबियों को अधिकतम ६५ डिग्री सेल्सियस तक तैयार करना । लगातार सरगर्मी के दौरान ०.५ एमजी पीएफए के लिए पंजाबियों को जोड़ें । तब जोड़ें ५० µ l 10 M NaOH और प्रतीक्षा जब तक पीएफए भंग है । इसके बाद, 8 का pH पाने के लिए ४२.५ µ l HCl (३७% v/v) जोड़ें । पुन: जांचें पीएच और फिर 1% पीएफए समाधान तक पहुंच RT ।
    2. RNase के स्टॉक्स तैयार (1 मिलीग्राम/एमएल) और Proteinase K (20 µ g/µ l) अलग बाँझ में ddH2O. स्टोर aliquots पर-20 ° c.
    3. निंनलिखित बफ़र्स और रिएजेंट तैयार: पंजाबियों ०.०२% के बीच, Lysis बफर, Glycine, कमजोर पड़ने बफर, चिप बफर 1, चिप बफर 2, चिप बफर 3, और ते बफर युक्त और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । हर बार नए सिरे से रेफरेंस बफर तैयार करें ।
      1. ०.०२% के बीच युक्त पंजाबियों तैयार । 4 डिग्री सेल्सियस पर सबसे अधिक एक सप्ताह के लिए स्टोर ।
      2. lysis ५० पीएच ८.०, 10 मिमी EDTA, 1% (डब्ल्यू/वी) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), और 1x चिढ़ाना अवरोध करनेवाला Tris mm का उपयोग कर बफर तैयार करते हैं ।
      3. तैयार २.५ मी glycine ।
      4. पतला पीएच ८.०, १५० mm NaCl, 2 mm EDTA, 1% (v/v) ट्राइटन X-१००, ०.२५% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस, और 1x चिढ़ाने की Tris पर 20 मिमी का उपयोग कर बफर तैयार करो ।
      5. चिप बफर 1 पीएच ८.०, १५० मिमी NaCl, 2 मिमी EDTA, 1% (v/v) ट्राइटन X-१००, और ०.२% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस पर 20 मिमी Tris का उपयोग कर तैयार करें ।
      6. 20 मिमी Tris पीएच ८.०, ५०० mm NaCl, 2 mm EDTA, 1% (v/v) ट्राइटन X-१००, और ०.२% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस का उपयोग कर चिप बफर 2 तैयार करें ।
      7. चिप बफर 3 20 मिमी Tris पीएच ८.०, २५० mm LiCl, 2 mm EDTA, 1% (v/v) NP-४०, और 1% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस का उपयोग कर तैयार करें ।
      8. 20 मिमी Tris पीएच ८.० और 2 मिमी EDTA का उपयोग कर बफर तैयार करें ।
      9. 1% (w/v) एसडीएस, १०० mM NaHCO3युक्त ताजा रेफरेंस बफर तैयार करें ।

2. मस्तिष्क ऊतक के तंत्रिका जनक अलगाव

  1. अलगाव और cpc की वैकल्पिक खेती
    1. सर्वाइकल विस्थापन द्वारा गर्भवती पशुओं को Euthanize और भ्रूण को आइस-कोल्ड HBSS में ट्रांसफर करें ।
    2. खोपड़ी को कैंची से निकालें और मस्तिष्क को अलग करें, फिर मेनिन्जेस को हटा दें, यदि लागू हो, छोटे संदंश के साथ और छोटे संदंश का उपयोग करके दूरबीन कार्यक्षेत्र के अंतर्गत अन्य सभी मस्तिष्क भागों को हटाकर दोनों गोलार्द्धों के cortices (पूरे, डीटी, या VT) को अलग करें और, यदि आवश्यक, छोटी कैंची. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर अलग cortices 5 मिलीलीटर HBSS बफर में स्टोर ।
    3. १,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अलग मस्तिष्क सामग्री केंद्रापसारक ।
    4. cortices को 5 मिलीलीटर आइस-कोल्ड HBSS से धो लें और उन्हें एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप के साथ pipetting करके ऊपर और नीचे homogenize । यदि आवश्यक हो, पिपेट टिप की नोक काट ।
    5. १,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए homogenized नमूना केंद्रापसारक । HBSS निकालें ।
    6. 3 मिलीलीटर Trypsin जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूना मशीन ।
    7. 1 मिलीलीटर FCS, 5 मिलीलीटर सीसीएम, और DNase 1 के 30 µ l को नमूना में शामिल करें और homogenize से नमूने को 5 मिलीलीटर ग् पिपेट से ऊपर और नीचे pipetting ।
    8. १००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अलग कोशिकाओं केंद्रापसारक । supernatant त्यागें, 5 मिलीलीटर सीसीएम जोड़ें, और homogenize फिर से नमूना ।
    9. नमूना के एक aliquot पतला और एक Neubauer गिनती-चैंबर के साथ गिनती । भ्रूण प्रति ४.५ x 106 कोशिकाओं की एक औसत राशि की उंमीद है । अलग cpc की खेती के लिए कदम 2.1.10 के साथ आगे बढ़ना । चिप के लिए, तुरंत कदम 3 के साथ आगे बढ़ना ।
    10. खेती के लिए प्लेट cpc पर पाली-एल-ornithine (०.१ मिलीग्राम/एमएल) और laminin (1 मिलीग्राम/एमएल) 8 x 104 और २.५ x 105 कोशिकाओं के बीच एक घनत्व पर लेपित व्यंजन सीसीएम माध्यम में2 और उन्हें मशीन पर ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% कं2, और १००% सापेक्ष आर्द्रता ।
    11. के बाद से cpc कोशिका संस्कृति में न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए शुरू (लगभग 4 दिनों के बाद), इन विट्रो 0 (दिन 0) में दिन के रूप में विच्छेदन तिथि पर विचार करें. खेती की लंबी शर्तों के लिए, ताजा सीसीएम माध्यम के माध्यम से हर चौथे दिन में परिवर्तन आधा ।
    12. लागू करें 1-5 µ m SGC0946 या DMSO में भंग EPZ5676 0 दिन (4-5 ज के बाद सेल अलगाव) और यह हर दूसरे दिन ताज़ा । एक नियंत्रण उपचार के रूप में DMSO का प्रयोग करें । परीक्षण मानक immunoblot तरीकों के माध्यम से अवरोधक उपचार की दक्षता, यदि आवश्यक हो ।
  2. अलगाव और CGNPs की वैकल्पिक खेती
    1. Euthanize P5-7 decapitation द्वारा पशु कैंची का उपयोग कर । खोपड़ी त्वचा निकालें, खोपड़ी खोलने के लिए और छोटे कैंची और संदंश का उपयोग कर मस्तिष्क को हटा दें । सेरिबैलम को अलग करें और इसे आइस-कोल्ड HBSS/ग्लूकोज में ट्रांसफर करें । सभी मेनिन्जेस और रक्त वाहिकाओं निकालें और 15 मिलीलीटर ठंड HBSS/ग्लूकोज से भर ट्यूबों में cerebella हस्तांतरण ।
    2. cerebella को धो लें 10 मिलीलीटर बर्फ के साथ तीन बार-ठंडा HBSS/ग्लूकोज (उंहें ६५० x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक द्वारा इकट्ठा) और homogenize cerebella बाद धीरे से pipetting ऊपर और एक 1 मिलीलीटर पिपेट (अधिकतम 2-3 बार) के साथ 0.5-1 mm3 पाने के लिए टुकड़े.
    3. HBSS/ग्लूकोज में ०.०२५% trypsin के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 15 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में लगातार सरगर्मी के तहत ऊतक मशीन । CGM के 5 मिलीलीटर जोड़कर पाचन बंद करो और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ६५० x जी में केंद्रापसारक द्वारा ऊतक इकट्ठा ।
    4. supernatant को हटा दें और टिशू को 1 एमएल CGM में 1 मिलीलीटर प्लास्टिक टिप के साथ triturate और उसे एक नया 15 एमएल ट्यूब पर ट्रांसफर करें ।
      नोट: यह हवा के बुलबुले से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
      1. 5 मिलीलीटर CGM जोड़ें और बर्फ पर 2 मिनट के लिए मिश्रण गर्मी ऊतक अवशेष बसा । एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में supernatant स्थानांतरण । अवशिष्ट ऊतक के लिए 2 मिलीलीटर CGM जोड़ें और trituration प्रक्रिया को दोहराने ।
    5. supernatants पूल (ऊतक अवशेष के बिना, के बारे में कुल में 10 मिलीलीटर) और 5 मिनट के लिए ६५० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस में अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए केंद्रापसारक । 10 एमएल CGM में गोली स्थगित ।
    6. के बाद से astrocytes पालन तेजी से और मजबूत पाली-डी-lysine से CGNPs, प्लेट १०० µ जी पर कोशिकाओं/एमएल पाली-डी-lysine लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटें (अप करने के लिए 4 मिलीलीटर अच्छी तरह से) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन को हटाने के लिए astrocytes ।
    7. थाली हिला और supernatant इकट्ठा । फिर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६५० x g पर केंद्रापसारक । 10 मिलीलीटर CGM में गोली reसस्पेंड और एक Neubauer मतगणना कक्ष के साथ कोशिकाओं की गिनती ।
      नोट: CGNPs दौर, छोटे हैं, और एक हेलो दिखाने के चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जब imaged ।
    8. यदि आवश्यक हो तो, पाली-एल-ornithine-लेपित प्लेटों (3 x 106 कोशिकाओं प्रति 6-अच्छी तरह से) और उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 और १००% पर मशीन के सापेक्ष आर्द्रता पर ३७ ° c पूर्व गर्म CGM में कोशिकाओं बीज ।
      नोट: यदि सीडिंग नहीं किया जाता है, तो चरण ३.१ पर जारी रखें ।
      1. 6-12 ज के बाद, मध् यम को CGM-श्श्श पर एक् सचेंज करें । अलग CGNPs 6 एच समझो (या जब CGM-श्श्श बदलने के लिए) DOT1L के साथ अलगाव के बाद-अवरोध करनेवाला और DMSO नियंत्रण और यह हर दूसरे दिन नवीनीकृत (2.1.12 के साथ तुलना) । यदि आवश्यक हो तो मानक immunoblot तरीकों के माध्यम से अवरोधक उपचार की दक्षता का परीक्षण. चिप के लिए, चरण ३.३ के साथ आगे बढ़ें ।
        नोट: प्लेटों पर CGM छोड़ने (और उस FBS के साथ) अनुमस्तिष्क दानेदार न्यूरॉन्स (CGNs) में CGNPs के अंतर में परिणाम होगा.

3. कोशिकाओं का निर्धारण और क्रोमेटिन की कतरन

नोट: यदि वे चरण ३.३ के लिए आगे बढ़ना हैं, तो चरण ३.१ और ३.२ कक्ष cultureed नहीं हैं, तो निष्पादित करें ।

  1. १,००० x जी में 4 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करने और १.३ मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ें । नमूना एक १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर १,००० x g पर 4 मिनट के लिए केंद्रापसारक । नमूना १.३ मिलीलीटर पंजाबियों के साथ दो बार धो लें ।
  2. महत्वपूर्ण चरण: नमूना के लिए ३५० µ एल 1% पीएफए जोड़ें और 22 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए यह मशीन । प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, जोड़ें १८.४ µ l glycine, और 1 मिलीलीटर पंजाबियों. 4 डिग्री सेल्सियस पर १,००० x g पर 5 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक ।
    1. दो बार आइस-कोल्ड पंजाबियों से सैंपल धोएं । १,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा तय कोशिकाओं को इकट्ठा । अब से बर्फ पर नमूने रखें ।
      नोट: निर्धारण समय इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए ठीक 5 मिनट होना चाहिए । भिंन कक्ष संख्याओं में समय ढलने की आवश्यकता हो सकती है ।
  3. महत्वपूर्ण चरण: कल्चर्ड CGNPs (or cpc) के लिए, 1 mL 1% पीएफए को सीधे सेल कल्चर प्लेट वेल्स में जोड़ें । 22 डिग्री सेल्सियस पर एक 5 मिनट की मशीन के बाद, glycine और पंजाबियों की एक उचित राशि जोड़ने और एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं फसल ।
    1. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में कोशिकाओं स्थानांतरण और १,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक । दो बार आइस-कोल्ड पंजाबियों से सैंपल धोएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 minat १,००० x g के लिए केंद्रापसारक द्वारा तय कोशिकाओं को इकट्ठा । अब से बर्फ पर नमूने रखें ।
  4. महत्वपूर्ण चरण: lysis बफर के ७०० µ एल जोड़ें (+ चिढ़ाना अवरोध करनेवाला) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूना मशीन । भंवर हर 5 min. कतरनी के क्रोमेटिन लीजड कोशिकाओं के sonicator में 3 एक्स 10 मिनट (30 एस पल्स, 30 एस थामने) अधिकतम शक्ति पर.
    1. सुनिश्चित करें कि वॉल्यूम ३५० µ l प्रति ट्यूब से अधिक नहीं है । भंवर नमूने हर 10 मिनट में एक चरण के विपरीत खुर्दबीन के साथ शेष नाभिक के लिए lysate की जांच करें ।
      नोट: यह इष्टतम कतरनी परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ( चित्र 1bके साथ तुलना करें) बाद में विश्लेषण के लिए । क्रोमेटिन बाल काटना के लिए अंय तरीकों का उपयोग करने के मामले में, 200-500 बीपी के बीच आकार क्रोमेटिन टुकड़े को बाल काटना अनुकूलन ।
  5. 10 मिनट, १३,००० x g, 4 ° c के लिए गोली सेल अवशेष । स्पष्ट चरण ५.२ के लिए supernatant का उपयोग करें । यदि आवश्यक हो, तो बाद में उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज ।

4. मोतियों की तैयारी और साफ करना

  1. धो ४५ µ एल प्रोटीन एक चुंबकीय मोतियों/चिप और 20 µ l चुंबकीय मोती/०.०२% के बीच युक्त 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडे पंजाबियों के साथ नमूना एक चुंबकीय खड़े का उपयोग कर तीन बार । फिर, मोतियों की बर्फी ठंडे पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे पंजाबियों और ४५ µ एल मोती/चिप, एंटीबॉडी/चिप (H3K79me2 या खरगोश आईजीजी) के 3 µ जी जोड़ें । एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए नमूनों की मशीन मोतियों को एंटीबॉडी बांधने के लिए । एंटीबॉडी पर निर्भर करता है, का उपयोग करें ~ 3 µ g एंटीबॉडी/चिप ।
  3. ०.०२% के बीच युक्त 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडे पंजाबियों के साथ एंटीबॉडी-बंधे-मोती तीन बार धो लें । उपयुक्त मनका मात्रा जोड़ें (चुंबकीय मोतियों की मात्रा शुरू) बर्फ ठंडा पंजाब के धोया एंटीबॉडी-युग्मित-मोतियों की ।
  4. जोड़ें ६०० µ कमजोर पड़ने बफर के एल और 20 µ एल के नमूने के लिए धोया चुंबकीय मोतियों की (कुल मात्रा १,३२० µ एल) और एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मशीन । एक चुंबकीय खड़े का उपयोग कर मोती निकालें । इनपुट नमूनों के रूप में lysates के 5% (३३ µ एल) ले लो और उन पर फ्रीज-20 ° c.

5. क्रोमेटिन Immunoprecipitation

  1. दो ट्यूबों (लगभग ६४३.५ µ l) में स्पष्ट निकालने को विभाजित करें, कमजोर पड़ने वाले बफर और एंटीबॉडी-बाउंड-मोतियों की एक ही मात्रा जोड़ें (४५ µ l/ H3K79me2 या खरगोश आईजीजी). एक रोटेटर पर रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की मशीन ।
  2. बर्फ के साथ मोती धो-शीत चिप बफर 1, चिप बफर 2, और चिप बफर 3 10 मिनट के लिए प्रत्येक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर । बाद में, एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ते बफर के साथ तीन बार धो लें ।
  3. कमरे के तापमान पर एक शेखर में १,४०० rpm पर 1 एच के लिए रेफरेंस बफर के साथ मोतियों को Elute ।
  4. जोड़ें 10 µ g RNase (1 मिलीग्राम/एमएल) प्रति चिप नमूना और 5 µ g इनपुट नमूनों के लिए और ३७ ° c (१,४०० rpm) पर 30 मिनट के लिए नमूनों की मशीन ।
  5. जोड़ें १०० µ g Proteinase K (20 µ g/µ l) प्रति चिप नमूना और ५० µ g प्रति इनपुट और रात भर की गर्मी में ६५ ° c पर १,४०० rpm ।

6. चिप के नमूनों का शुद्धिकरण

  1. एक डीएनए शोधन किट के साथ चिप और इनपुट नमूनों को शुद्ध ( सामग्री की तालिकादेखें) मैनुअल के अनुसार । डीएनए के 5 µ g से अधिक होने की संभावना होने पर अधिक शुद्धि कॉलम का प्रयोग करें । Elute ने किट में दिए गए डीएनए रेफरेंस बफर के 2 x 15 µ l के साथ इसका नमूना लिया ।
  2. नमूनों की ठहराव प्रदर्शन (1 µ एल का उपयोग करें) एक visualizing fluorophore और एक fluorospectrometer का उपयोग करके (देखें सामग्री की तालिका) ।

7. qPCR के माध्यम से चिप नमूनों का विश्लेषण

  1. qPCR विश्लेषण के लिए प्राइमर डिजाइन के लिए, एकीकृत जीनोमिक्स दर्शक (IGV) ब्राउज़र३४से ब्याज की जीनोमिक अनुक्रम निकालते हैं । एक जीन के transcriptional शुरू साइट (TSS) के आसपास डिजाइन प्राइमर, के बाद से H3K79me2 वहां स्थित होने की संभावना है । नियंत्रण के रूप में, गैर कोडिंग जीनोमिक क्षेत्रों या क्षेत्रों के बारे में 10 kb TSS या transcriptional एंड साइट (द्वीतीय) के 10 kb बहाव के ऊपर पर विचार करें ।
    1. ७० और २०० बीपी और ६० डिग्री सेल्सियस के एक इष्टतम तापमान पूर्व निर्धारित के बीच एक उत्पाद के आकार का उपयोग https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/के साथ प्राइमरों उत्पन्न करते हैं । परीक्षण प्रयोजनों के लिए, जीनोमिक क्षेत्रों के लिए प्राइमरों का उपयोग करें Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, और Npm1 तालिका 1में सूचीबद्ध ।
  2. निम्नलिखित qPCR कार्यक्रम, मास्टर मिश्रण, और ५८ डिग्री सेल्सियस और ६३ डिग्री सेल्सियस के बीच एक एनीलिंग तापमान ढाल के साथ नए डिजाइन प्राइमरों का परीक्षण, और उच्चतम उत्पाद मात्रा और गुणवत्ता के साथ एनीलिंग तापमान का चयन करें ।
    1. डीएनए जेल ट्रो उत्पाद के आकार की उंमीद को नियंत्रित करने के लिए लागू होते हैं । qPCR विश्लेषण के लिए, एक रीयल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. 10 µ l डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर मिक्स, ०.५ µ एल प्राइमरी फॉरवर्ड (10 µ एम), ०.५ µ एल प्राइमरी रिवर्स (10 µ मीटर), 4 µ एल nuclease-फ्री वॉटर, और 5 µ एल डीएनए (1 एनजी/µ एल) का उपयोग कर मास्टर मिक्स तैयार करें ।
    3. इस प्रकार 2-step qPCR प्रोग्राम का उपयोग करें: 5 min at ९५ ° c, 50x (30 s at ९५ ° c, 30 s at ५८ ° c-६३ ° c), and विकार ग्रैडिएंट लगातार पर 4 ° c.
  3. जीनोमिक, कतरनी, शुद्ध डीएनए नमूनों की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाएं (2 एनजी/µ एल, 1 एनजी/µ एल, ०.५ एनजी/µ एल, ०.२५ एनजी/µ एल, और ०.१२५ एनजी/µ एल) और एक दक्षता µ का उपयोग परीक्षण के लिए 5 qPCR एल का उपयोग करें । मानक वक्र की ढलान निर्धारित करें और निम्न सूत्र द्वारा प्राइमरी दक्षता की गणना:
    दक्षता (%) = (10^ (-1/ढलान)-1) * 100.
    1. ९०% और १०५% के बीच एक आदर्श मामले में क्षमता के साथ प्राइमरों का प्रयोग करें, या कम से ८५% और ११५% के बीच क्षमता के साथ ।
  4. चिप और इनपुट नमूनों का विश्लेषण करने के लिए, 0.1-1 चिप डीएनए के एनजी लागू संबंधित आगे और रिवर्स प्राइमर के साथ मिश्रित, nuclease-मुफ्त पानी, और डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण प्रत्येक qPCR प्रतिक्रिया के लिए 20 µ एल के एक अंतिम मात्रा में ।
  5. थ्रेसहोल्ड चक्र का निर्धारण (सीटी) चिप और इनपुट के नमूनों के मूल्यों और निम्नलिखित सूत्र के साथ संवर्धन (% इनपुट) की गणना करने के लिए इनपुट के सीटी मूल्यों के लिए नमूना सीटी को सामान्य. पृष्ठभूमि स्तर निर्धारित करने के लिए आईजीजी नियंत्रण से प्राप्त सीt मानों का उपयोग करें ।
    % इनपुट = 100-2^(नॉर्म. इनपुट − नॉर्म । चिप)
    आदर्श. इनपुट = सीटी (इनपुट) − लॉग2(कमजोर पड़ने का कारक)
    आदर्श. चिप = सीटी (चिप) − लॉग2(कमजोर पड़ने कारक)
    नोट: आदर्श । = सामान्यीकृत

8. अनुक्रमण के माध्यम से चिप नमूनों का विश्लेषण

  1. एक sequencing सुविधा के लिए चिप नमूने (इनपुट और immunoprecipitated डीएनए नमूना) स्थानांतरण ।
  2. एक पुस्तकालय पहले से तैयार करने के लिए, एक उपयुक्त पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और परिवर्तित 2 इनपुट डीएनए और immunoprecipitated डीएनए के सब कुछ के एनजी पर अगली पीढ़ी के मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए अनुक्रमित पुस्तकालयों में संकेत मंच ( सामग्री की तालिकादेखें).
  3. महत्वपूर्ण चरण: किट निर्देशों के बाद, ligate अनुक्रमण एडेप्टर (15 µ मीटर की एक काम एकाग्रता के साथ) को मरंमत और दा पूंछ डीएनए टुकड़े समाप्त करने के लिए । sequencing एडेप्टर और पीसीआर प्राइमरों के लिए उपयुक्त ओलिगोस्पर्मिया ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें । इनपुट डीएनए की इस राशि के लिए, अनुकूलक ligated डीएनए अंशों को समृद्ध करने के लिए 6-9 पीसीआर चक्र का उपयोग करें ।
    नोट: सामान्य रूप से, यह एडेप्टर ligated डीएनए का एक आकार चयन करने के लिए आवश्यक नहीं है. यह संभव के रूप में कुछ पीसीआर चक्र के रूप में उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है, पीसीआर डुप्लिकेट और एक उच्च जीसी पूर्वाग्रह में कई पीसीआर प्रवर्धन चक्र परिणाम के बाद से ।
  4. एक अंतिम पुस्तकालय की जांच के लिए, एक उपयुक्त डिवाइस पर आकार वितरण कल्पना करने के लिए विश्लेषण के लिए कुल प्रतिक्रिया के ०.५ µ एल ले ( सामग्री की तालिकादेखें). ठहराव के लिए, एक fluorospectrometer या अंय तरीकों के साथ संयोजन में एक visualizing डाई का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  5. चूंकि H3K79me2 एक citrullinated संशोधन है, जो मोटे तौर पर बड़े जीनोमिक क्षेत्रों में फैला हुआ है प्रतीत होता है, अनुक्रम नमूने युग्मित ५० bp की एक पढ़ें लंबाई के साथ अंत और ७५ Mio पढ़ता की एक अनुक्रमण गहराई के साथ ।
  6. आकाशगंगा/उनी फ्रीबर्ग सर्वर (galaxy.uni-freiburg.de) के साथ चिप-seq डेटा का विश्लेषण करें ।
  7. FastQC के साथ प्राप्त ChIPseq के साथ गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन और, यदि उपयुक्त हो, उन्हें सीधे Bowtie2 संस्करण के साथ 2.2.0३५ के साथ या बिना ट्रिमिंग के साथ मैप करें । के रूप में संदर्भ जीनोम विधानसभा mm9 या नवीनतम संस्करण mm10 का उपयोग करें; और संदर्भ एनोटेशन Ensembl एफ़टीपी जारी ७९ के रूप में ।
  8. वैकल्पिक: पीक कॉलिंग से पहले Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) का उपयोग करके पठन डुप्लिकेट निकालें.
  9. MACS2 संस्करण 2.1.0३६ के साथ कॉल चोटियों H3K79me2 के लिए ' व्यापक ' विकल्प का उपयोग कर ।
  10. चिप और इनपुट नमूना के बीच एक लॉग2 अनुपात प्राप्त करने के लिए, दोनों नमूनों की पढ़ता अनुपात की संख्या के लॉग2 BamCoverage और BamCompare का उपयोग करें ।
  11. अंय सभी में गहराई चिप seq विशिष्ट विश्लेषण के लिए, deepTools2 संस्करण -6 या 2.4.1३७लागू, यानी कवरेज ट्रैक फ़ाइलें उत्पन्न करने के लिए (केवल चिप के लिए bamCoverage, इनपुट के लिए चिप की तुलना के लिए bamCompare), चिप का अनुमान लगाने के लिए प्रदर्शन का उपयोग करें plotFingerprint और एक सामान्य अवलोकन का उपयोग computeMatrix, plotHeatmap जनरेट करने के लिए । H3K79me2 वितरण के अनुसार क्लस्टर जीनोमिक क्षेत्रों के लिए computeMatrix प्रक्रिया के दौरान क्लस्टरिंग K-माध्य का चयन करें ।
  12. परीक्षण प्रयोजनों के लिए NCBI पर जमा ई 14.5 डीटी के H3K79me2 के रूप में प्रकाशित चिप-seq डेटा का उपयोग करें (प्रवेश संख्या: SRP057733) ।

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Representative Results

तंत्रिका जनक अलगाव, खेती, H3K79me2 चिप और चिप विश्लेषण विधियों की सामान्य योजना: चित्रा 1 एक फ़्लोचार्ट से पता चलता है भ्रूण मस्तिष्क के विकास के दौरान या अनुमस्तिष्क दानेदार ंयूरॉन progenitors के प्रसव चरणों में विभिंन समय बिंदुओं पर cortical जनक कोशिकाओं के H3K79me2 चिप प्रदर्शन करने के लिए । पहले कदम के रूप में मस्तिष्क को अलग-थलग करना पड़ता है और telencephalon (e 11.5 और e 14.5 के बीच) या सेरिबैलम (P5-P7) को प्राप्त करना पड़ता है । इसे डीटी और वीटी में बांटकर telencephalon के विभिन्न क्षेत्रों का विश्लेषण संभव है । बाद में ऊतक homogenized और तंत्रिका progenitors अलग हो जाएगा । अब, यह जनक कोशिकाओं संस्कृति के लिए संभव है और DOT1L अवरोधकों के साथ उन्हें इलाज. एक और संभावना को progenitors सीधे तय है और उंहें चिप प्रक्रिया के अधीन है । चिप के लिए, क्रोमेटिन 200-500 बीपी के टुकड़ों में कतरनी जाएगा और चुंबकीय-मोतियों के साथ बाद में H3K79me2 के खिलाफ एंटीबॉडी युग्मित । मोतियों को धोने और डीएनए वापस लाने के बाद, उपजी डीएनए sequencing द्वारा या qPCR (चित्र 1a) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. यह बाल काटना के बाद क्रोमेटिन टुकड़े का एक अच्छा आकार वितरण करने के लिए आवश्यक है, तो यह डीएनए जेल ट्रो के साथ या अन्य तरीकों के साथ टुकड़ा आकार की जाँच करने के लिए सलाह दी जाती है ( चित्र 1bमें उदाहरण). H3K79me2 अधिभोग के लिए जीनोम चौड़ा अनुक्रमण, चिप seq-पढ़ता का चयन करते समय आगे विश्लेषण के लिए एक fastq फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाएगा (चित्रा 1C). sequencing पढ़ता की गुणवत्ता FastQC के अनुप्रयोग द्वारा मूल्यांकन किया जा करने के लिए की आवश्यकता है, और यदि आवश्यक हो, तो fastq-फ़ाइलें TrimGalore का उपयोग कर ट्रिम किया जा सकता है । मस musculus जीनोम mm9 या mm10 के लिए मानचित्रण Bowtie2 के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है और PlotFingerprint के माध्यम से नियंत्रित । यह MarkDuplicates के साथ डुप्लिकेट को दूर करने के लिए और BamCoverage द्वारा पढ़ता सामान्य और BamCompare के साथ इनपुट नमूनों के लिए चिप की तुलना करने के लिए सलाह दी जाती है. चिप-seq पढ़ता बाद में heatmaps या एकीकृत जीनोमिक्स दर्शक (IGV) ब्राउज़र सत्र में जीन वार में व्यापक जीनोम की कल्पना की जा सकती है ।

सीपीसी संस्कृति और DOT1L अवरोध: cpc अलग और 5 µ एम DOT1L अवरोध करनेवाला SGC0946 के साथ 0 दिन और दिन 2 में इलाज किया गया । विलायक DMSO एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । 3 दिन में, cpc काटा गया, प्रोटीन अलग थे, मात्रा, और immunoblot (चित्रा 2a) के माध्यम से विश्लेषण किया । चित्र 2a से पता चलता है कि H3K79me2 स्तर प्रभावी ढंग से सीपीसी संवर्धन और DOT1L एक प्रभावी अवरोधक उपचार योजना को सुनिश्चित करने के निषेध के तीन दिनों के बाद कम कर रहे हैं । H3, GAPDH, या Tubulin-अल्फा लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में सेवारत की प्रोटीन राशि जिससे बिगड़ा नहीं था । Immunostaining के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ फिक्स्ड cpc के सक्रिय caspase 3 (CASP3 +) का पता लगाने के लिए apoptosis और HuC/डी की खोज के लिए न्यूरॉन्स कोशिकाओं को संकेत दिया कि cpc अवरोधक के साथ DOT1L के उपचार संस्कृति में तीन दिनों के बाद वृद्धि की कोशिका मौत के लिए नेतृत्व किया, के रूप में दिखाया चित्रा बीमें । ठहराव कोशिकाओं है जो CASP3 +/DAPI + या HuC/D +/DAPI + है सीपीसी संस्कृति के भीतर CASP3 की एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला + कोशिकाओं DOT1L निषेध पर क्रमादेशित सेल मौत खुलासा । HuC/डी पॉजिटिव न्यूरॉन्स की संख्या हालांकि, अपरिवर्तित बनी रही (चित्र 2c).

H3K79me2 चिप-qPCR के Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, और Npm1 के साथ इलाज cpc से DOT1L : परीक्षण के लिए यदि SGC0946 के DOT1L अवरोधक उपचार कुशल और H3K79me2 की कमी के लिए नेतृत्व में विशिष्ट था जीन, हम सीपीसी के qPCR द्वारा 3 दिनों के लिए इलाज के बाद एक चिप विश्लेषण प्रदर्शन किया । खरगोश आईजीजी चिप नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । चूंकि यह ज्ञात है कि H3K79me2 endoplasmatic तनाव उत्तरदायी जीन पर स्थित है Aft4, Ddit3, Scd1, और Aft3 के रूप में अच्छी तरह से परमाणु परिवहन जीन Npm1३३,३८, हम इस्तेमाल किया qPCR TSS, द्वीतीय को कवर प्राइमरों, और जीन निकायों के भीतर जीनोमिक क्षेत्रों H3K79me2 निषेध के बाद DOT1L वितरण में अंतर निर्धारित करने के लिए (चित्रा 3) । इस तरह के Atf4, Ddit3, और Npm1 के रूप में पहली जगह में उच्च H3K79me2 स्तर के साथ जीन सबसे अवरोधक उपचार के लिए उत्तरदायी थे ताकि DOT1L के निषेध के तीन दिनों H3K79me2 की एक महत्वपूर्ण कमी के लिए नेतृत्व किया. इस तरह के Atf3 और Scd1 के रूप में एक कम H3K79me2 कवरेज के साथ जीन , H3K79me2 के स्तर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया ।

H3K79me2 चिप-seq विश्लेषण का अवलोकन: cpc में H3K79me2 स्तर के जीनोम व्यापक विश्लेषण से ई 14.5, प्रदर्शन किया और प्रस्तुत योजनाओं और प्रोटोकॉल के अनुसार विश्लेषण (चित्रा 1), एक बहुत ही उच्च गुणवत्ता चिप का पता चला । जबकि बिन्नी गिनती, उनके इनपुट की आवृत्ति के अनुसार क्रमबद्ध फिंगरप्रिंट ब्लाट (चित्र 4a) में पढ़ता है), समान रूप से वितरित किया गया, H3K79me2 गिनती विशिष्ट क्षेत्रों में संवर्धन दिखाया (डिब्बे 1 के साथ क्रमित), जो सफल प्रदर्शित करता है H3K79 में संशोधित क्रोमेटिन अंशों का संचय । उनके TSS और उनके द्वीतीय के बीच जीन के साथ H3K79me2 के एक heatmap और +/-10Kb नदी के ऊपर या बहाव से पता चलता है (चित्रा 4B) कि H3K79me2 के आसपास चोटियों और TSS सामांय में द्वीतीय की ओर कम । वहां जीन है, जो पूरी तरह से H3K79me2 के साथ कवर कर रहे हैं, और जीन है, जो केवल TSS क्षेत्र के भीतर एक चोटी है । Endoplasmatic-तनाव संबंधित जीन जैसे Atf4, Ddit3, और nucleophosmin Npm1 बंदरगाह, उदाहरण के लिए, H3K79me2 में एक उच्च TSS स्तर, जो केवल थोड़ा पूरे जीन शरीर (आंकड़ा 4c) के साथ कम है । इसके विपरीत, Scd1 TSS में एक कम H3K79me2 अधिभोग और जीन शरीर के भीतर कोई H3K79me2 है । एक अंतिम उदाहरण के रूप में Atf3 जीन शरीर के साथ विभिंन तेज और निंन स्तर H3K79me2 चोटियों है ।

Figure 1
चित्रा 1: पृथक cpc या CGNPs और अनुक्रमण विश्लेषण के फ़्लोचार्ट से H3K79me2 चिप प्रोटोकॉल की योजना. (क) प्रस्तुत प्रोटोकॉल का अवलोकन । सीपीसी अलगाव के लिए, पहले ई 14.5 दिमाग अलग हो जाएगा और cortices डीटी और VT में विभाजित किया जा सकता है, अगर जरूरत है । CGNPs के लिए, cerebelli P5-P7 चूहों से प्राप्त किया जाना है । ऊतक homogenized, progenitors अलग हो जाएगा, और फिर कोशिकाओं और प्रसंस्कृत किया जा सकता है एक उचित अवरोध करनेवाला या सीधे चिप के लिए इस्तेमाल के साथ इलाज किया । चिप के लिए, क्रोमेटिन के निर्धारण के बाद बाल काटना और नियंत्रण के रूप में एक विरोधी H3K79me2 एंटीबॉडी और खरगोश आईजीजी के साथ immunoprecipitation है । डीएनए शुद्धि के बाद, चिप नमूने पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है या qPCR के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है । (ख) उपयुक्त और अनुपयुक्त गुणवत्ता क्रोमेटिन के उदाहरण । डीएनए टुकड़ा वितरण में बीपी दिखाया गया है। (ग) चिप-seq परिणाम फ्रीबर्ग/आकाशगंगा सर्वर पर एक विश्लेषण पाइपलाइन के अधीन किया जा सकता है । एक गुणवत्ता नियंत्रण (FastQC) के बाद, पढ़ता TrimGalore के साथ छंटनी की जा सकती है और फिर माउस जीनोम के लिए Bowtie2 के माध्यम से मैप (प्रस्तुत मामलों में mm9). PlotFingerprint चिप की गुणवत्ता का मूल्यांकन करता है । H3K79me2 के लिए चोटियों को परिभाषित करने के लिए, MACSpeaks लागू किया जा सकता है । सामांयीकरण BamCoverage के लिए और इनपुट BamCompare करने के लिए तुलना के लिए प्रयोग करने योग्य हैं । परिणाम IGV ब्राउज़र और heatmaps कल्पना करने के लिए उपयुक्त हैं । अपेक्षित फ़ाइल-स्वरूप इटैलिक किए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Cortical जनक संस्कृति और DOT1L निषेध । (क) Immunoblots DMSO नियंत्रण की तुलना में 3 दिनों (3 दिन, n = 3-11) के लिए DOT1L निषेध के बाद 14.5 ई पर सीपीसी में H3K79me2 स्तर दिखा रहा है । H3, GAPDH, और Tubulin अल्फा लोड नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । (ख) Immunocytological दिनों में एक सीपीसी संस्कृति के दाग 2 और 3 । आपन Caspase 3 (CASP3 green)-सकारात्मक कोशिकाओं और न्यूरॉन्स (HuC/डी: लाल) दाग थे. DAPI (नीला) सेल नाभिक की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । स्केल बार: १०० µm. (C) (B) में प्रस्तुत immunostainings का ठहराव । CASP3 +/DAPI + या HuC/D +/DAPI + में प्रतिशत के लिए धनात्मक कोशिकाओं का अनुपात दिया गया है. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, ख़राब छात्र टी परीक्षण प्रदर्शन किया गया । p < 0.01 * * । यह आंकड़ा Roidl एट अल से संशोधित किया गया था । ३३ , ३८ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: H3K79me2 चिप-qPCR के Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1, और Npm1 cpc अवरोध करनेवाला के साथ इलाज किया । (क) ई 14.5-व्युत्पंन cpc 5 µ एम DOT1L अवरोध करनेवाला 4-5 ज के साथ अलगाव के बाद इलाज किया गया और संस्कृति में 2 दिन में एक दूसरी बार के लिए । cpc 3 दिन है, जो क्रोमेटिन निष्कर्षण, चिप प्रयोग, और qPCR द्वारा पीछा किया गया था पर तय किया गया । परिणाम माध्य (+/-SEM)% इनपुट (n = 3) के रूप में दर्शाए जाते हैं । आईजीजी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । आईजीजी स्तर के माध्य को डैश्ड रेखा के रूप में दर्शाया गया है । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, दो-तरफ़ा ANOVA लागू किया गया था । पी < 005 *; p < 0.01 * *, p < 0.001 * * *; TSS transcriptional सुरु स्थल, द्वीतीय transcriptional समाप्ति स्थल । यह आंकड़ा Roidl एट अल से संशोधित किया गया था । ३३ , ३८ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: H3K79me2 चिप-seq विश्लेषण का अवलोकन. (क) H3K79me2 चिप के फिंगरप्रिंट-seq ई से 14.5-व्युत्पंन cpc इनपुट की तुलना में एक उच्च चिप seq गुणवत्ता सुनिश्चित करने के H3K79me2 के लिए डीएनए टुकड़े के एक संवर्धन से पता चलता है । (ख) H3K79me2 चिप-seq परिणाम एक heatmap में साजिश रची । दृढ़ता से समृद्ध जीनोमिक क्षेत्रों नीले रंग में प्रस्तुत कर रहे हैं । स्केलिंग 0 (डार्क रेड)-४५ (डार्क ब्लू) । TSS के पास H3K79me2 चोटियों और द्वीतीय को 3 ´ दिशा में गिरावट आती है । (ग) H3K79me2 चिप-seq पढ़ता mm9 जीनोम के लिए मैप और एकीकृत जीनोम दर्शक (IGV) के साथ visualized थे । एक जीन के H3K79me2 अधिभोग के रूप में प्रदर्शित किया जाता है की संख्या के log2 चिप और इनपुट के बीच अनुपात kilobase प्रति मिलियन (स्केलिंग:-10 से 10) पढ़ता है । Refseq जीन संरचना का प्रतिनिधित्व किया है, जबकि एक लाल बॉक्स TSS सहित पहले एक्सॉन को इंगित करता है । जीन Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, और Npm1 हैं । तुलना के लिए, एक ही जीनोमिक क्षेत्र के एक H3K4me3 संकेत प्रदर्शित किया जाता है । TSS transcriptional सुरु स्थल, द्वीतीय transcriptional समाप्ति स्थल । यह आंकड़ा Roidl३८से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जीन क्षेत्र प्राइमरी फॉरवर्ड 5 '-3 ' प्राइमरी रिवर्स 5 '-3 '
Aft4 tss GGACGATCTCTAACGCCACA GCCCTAAACCCGCCCTTTAT
Aft4 TSS + 1500 CTCCCGAATATGACATGAACCG TCCATTCGAAACAGAGCATCG
Aft4 द्वीतीय CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC AAAGAATGACACTGAAAACCCACA
Ddit3 tss GTACTGGCTCCGTCTAACCC CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA
Ddit3 TSS + 2500 TCAAGCAGCCGGTCTCATAG CTCAGATCCCCCAATGGCTT
Ddit3 TSS + 4500 GAGCTGGAAGCCTGGTATGA TCACCTCTTCGTTTCCTGGG
Ddit3 द्वीतीय CACCAAGCATGAACAGTGGG GTACCGTCTATGTGCAAGCC
Aft3 tss AACTGAGAGCGCAACTCCTC GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA
Aft3 द्वीतीय CTGTTGGCACAAAGTGGCTC GGGATCTGCCATGGTGGAAA
Scd1 tss TAGTGACCACACACAAAAGCTC CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC
Npm1 tss TCCCCCTCCAGTCAGTTACC CGTCCTTTCCTTGGCGTGA
Npm1 द्वीतीय AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT
TSS: Transcriptional प्रारंभ साइट
द्वीतीय: Transcriptional समाप्ति स्थल

तालिका 1: चिप के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों की सूची-qPCR ।

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Discussion

वहां दो प्रमुख तरीके क्रोमेटिन immunoprecipitation प्रदर्शन करने के लिए citrullinated संशोधनों के जीनोमिक अधिभोग का पता लगाने, प्रतिलेखन कारकों, citrullinated कोड पाठकों, लेखकों, या रबड़ हैं । एक देशी चिप विधि का उपयोग कर nuclease पचता है, immunoprecipitation के लिए देशी क्रोमेटिन, और दूसरे पीएफए का उपयोग कर प्रस्तुत विधि है-फिक्स्ड, कतरनी क्रोमेटिन, जिसमें nucleosomes और अन्य डीएनए संलग्न प्रोटीन डीएनए के लिए बाध्य covalently हैं ३९. अपने उच्च एंटीबॉडी पता लगाने की दर के साथ देशी चिप citrullinated मिथाइल के लिए लागू किया जाना चाहिए क्योंकि क्रोमेटिन और citrullinated मिथाइल चिप भर में अपेक्षाकृत स्थिर हैं । लेकिन जब से शुरू सामग्री की एक बड़ी राशि की जरूरत है, यह cortical या अनुमस्तिष्क विकास, जहां माउस दिमाग से कोशिकाओं की संख्या आमतौर पर सीमित है अध्ययन के लिए लागू नहीं है । हालांकि एंटीबॉडी आम तौर पर गैर के खिलाफ उठाया-निश्चित सामग्री रहे हैं, हम साबित कर सकते है कि एंटीबॉडी विशेष रूप से H3K79me2 का पता लगाता है DOT1L के विशिष्ट अवरोध के बाद से चिप में एक कम H3K79me2 संकेत की ओर जाता है-qPCR विश्लेषण और immunoblots में (चित्रा 2a और चित्र 3ए) । पार से जुड़े सामग्री का उपयोग कर चिप अक्षम हो सकता है, लेकिन प्रस्तुत प्रोटोकॉल qPCR और अनुक्रमण विश्लेषण के लिए पर्याप्त विशेष रूप से समृद्ध सामग्री सुनिश्चित करता है ।

एक प्रभावी चिप के लिए, lysis बफर के एसडीएस एकाग्रता महत्वपूर्ण हो सकता है, के बाद से एसडीएस स्वभाव प्रोटीन और उंहें एंटीबॉडी बाध्यकारी के लिए सुलभ बनाता है । यह सुविधा H3K79me2 के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो citrullinated 3 के गोलाकार डोमेन के भीतर और nucleosome की सबसे छोटी इकाई22के क्रोमेटिन कोर के भीतर स्थित एक citrullinated संशोधन है । इस प्रकार, H3K79me2 के लिए, एक उच्च एसडीएस एकाग्रता (लगभग ०.३% डब्ल्यू/वी) परख के दौरान इष्टतम एंटीजन पहुंच सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । इस एसडीएस एकाग्रता के साथ, हम अत्यधिक आईजीजी नियंत्रण पर H3K79me2 को समृद्ध (चित्रा 3) और इनपुट पर (चित्रा 4) सकता है । इस प्रकार, अनुक्रमण के लिए चिप सामग्री की गुणवत्ता उपयुक्त था और H3K4me3 के लिए तुलनीय इनपुट पर संवर्धन (चित्रा 4) । हम उम्मीद करते हैं कि H3K79 मोनो या trimethylation मार्क की चिप के लिए एक ही एसडीएस एकाग्रता की जरूरत होगी । सामांय में, और अधिक कठोर चिप बफर है, कम झूठी सकारात्मक क्रोमेटिन टुकड़े immunoprecipitated हैं, अगर एंटीबॉडी की गुणवत्ता का इस्तेमाल किया डिटर्जेंट से प्रभावित नहीं है । भविष्य के लिए, यह histones के गोलाकार डोमेन के भीतर अन्य citrullinated संशोधनों के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल लागू करने के लिए संभव हो सकता है.

यदि एंटीबॉडी चिप के लिए उपयुक्त हैं और उच्च डिटर्जेंट सांद्रता पर स्थिर हैं, प्रोटोकॉल मुख्य रूप से दो महत्वपूर्ण कदम होते हैं । पहले, कोशिकाओं और क्रोमेटिन के बाद के कतरनी के निर्धारण प्रत्येक कोशिका प्रकार और प्रत्येक ultrasonicator के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । लंबे समय तक पार से जोड़ने के लिए निर्धारण कलाकृतियों की ओर जाता है और एंटीबॉडी पता लगाने की दर को कम कर सकते है के बाद से एंटीजन नकाबपोश हो सकता है । क्रोमेटिन बाल काटना २०० और ५०० बीपी (आंकड़ा 1b) के बीच डीएनए के आकार वितरण का नेतृत्व करने की जरूरत है । Nucleosomes में डीएनए की १४७ बीपी होते हैं । क्रोमेटिन टुकड़े कि बहुत लंबा है qPCRs में झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे । जीनोम-वाइड अनुक्रमण के दौरान, एक गलत आकार वितरण झूठी नकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे, क्योंकि अक्सर केवल छोटे टुकड़े माना जाता है । दूसरा महत्वपूर्ण कदम जीनोम चौड़ा अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी है । एक डीएनए प्रवर्धन कदम के लिए 6-9 पीसीआर-चक्र का उपयोग किया जाना चाहिए । कई पीसीआर चक्र से बचना आवश्यक है क्योंकि वे एक उच्च जीसी पूर्वाग्रह और बहुत से पीसीआर डुप्लिकेट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ, पर्याप्त डीएनए आवश्यक पीसीआर चक्र की संख्या कम रखने के लिए प्राप्त किया जा सकता है ।

मस्तिष्क ऊतक इस तरह के न्यूरॉन्स, oligodendrocytes, और glia कोशिकाओं4के रूप में सेल प्रकार की एक बहुत ही विविध राशि के होते हैं । विकास के दौरान इन कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त है और एक समय में मस्तिष्क में विशिष्ट क्षेत्रों का निर्माण और स्थान पर निर्भर तरीके से3. सेरेब्रल प्रांतस्था के Neurogenesis, उदाहरण के लिए, चूहों में ई 11.5 और ई 18.5 के बीच जगह लेता है. ऐसे ई 11.5 और ई 12.5 लगभग सभी कोशिकाओं के रूप में पहले के चरणों में जनक पहचान1है, लेकिन बाद में सेलुलर विविधता पर ध्यान में रखा जाना चाहिए । इसलिए, ई 14.5 पर cortical ऊतक के एक चिप H3K79me2 या उस विशिष्ट समय बिंदु पर किसी भी अंय citrullinated संशोधन प्रकट कर सकते हैं, लेकिन सेल प्रकार विशिष्ट क्रोमेटिन सुविधाओं को प्रदर्शित नहीं कर सकता । इस मुद्दे को प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) या चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस-छंटाई)४०, जो मस्तिष्क homogenization के बाद संभव है के साथ विशिष्ट कोशिकाओं के संवर्धन द्वारा हल किया जा सकता है । एमएसीएस-छंटाई तंत्रिका जनक कोशिकाओं विशिष्ट सेल सतह मार्करों के साथ चुंबकीय मोतियों के साथ लेबल किया जा सकता है और फिर अलग एक चुंबकीय खड़े४०का उपयोग कर । बाद में कोशिकाओं या कल्चरित किया जा सकता है सीधे चिप के लिए इस्तेमाल किया । प्रस्तुत प्रोटोकॉल न केवल तंत्रिका जनक कोशिकाओं के लिए लेकिन यह भी अंय सजातीय कोशिका आबादी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । FACS या एमएसीएस के अलावा, प्रोटोकॉल एक जीव के भीतर सभी अलग कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है ।

एक साथ लिया, प्रस्तुत प्रोटोकॉल यह एक कुशल और प्रतिलिपि तरीके से cortical और अनुमस्तिष्क विकास के विभिंन समय बिंदुओं पर citrullinated संशोधन H3K79me2 की जांच संभव बनाता है । यह अंय citrullinated citrullinated कोर के भीतर स्थित संशोधनों के लिए लागू हो सकता है और जीव के भीतर अंय सजातीय कोशिका प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है । चूंकि H3K79me2 एक संरक्षित citrullinated संशोधन23है, प्रोटोकॉल भी चूहों में नहीं बल्कि विभिन्न प्रजातियों के पार H3K79me2 का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है

Acknowledgments

हम लैब के भीतर CGN खेती प्रोटोकॉल स्थापित करने में मदद करने के लिए Henriette Bertemes धंयवाद । इस विधि कागज टीवी के लिए धन द्वारा DFG वित्त पोषित CRC992 चिकित्सा Epigenetics द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक फ्रीबर्ग आकाशगंगा टीम के समर्थन: पवनकुमार Videm, Björn Grüning और प्रो रॉल्फ Backofen, Bioinformatics, फ्रीबर्ग, जर्मनी सहयोगी अनुसंधान केंद्र द्वारा वित्त पोषित ९९२ चिकित्सा Epigenetics (DFG अनुदान SFB 992/1 2012) स्वीकार करते हैं और जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ एजुकेशन ऐंड रिसर्च (BMBF ग्रांट 031 A538A आरबीसी (डे. NBI)) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३१ अनुमस्तिष्क सेल संस्कृति cortical सेल संस्कृति प्रांतस्था विकास अनुमस्तिष्क विकास H3K79 मिथाइल DOT1L चिप DOT1L अवरोध
अलगाव और तंत्रिका Progenitors की खेती के बाद क्रोमेटिन-Immunoprecipitation के citrullinated 3 Lysine ७९ Dimethylation निशान
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Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

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