Summary
我们提出一种有效和可重复的方法, 分离和培养胚胎和产后脑组织中的神经祖细胞染色质沉淀 (芯片) 的组蛋白3赖氨酸 79 dimethylation (H3K79me2)-一个组蛋白标记位于组蛋白3的球状域。
Abstract
大脑发育是一个复杂的过程, 它是由来说的梯度和不同的转录程序控制在颞空间的方式。此外, 后生染色质修饰, 如组蛋白甲基化, 有一个重要的作用, 建立和维护特定的细胞命运在这个过程中。大多数组蛋白甲基化发生在灵活的组蛋白尾部, 这是组蛋白修饰剂、橡皮擦和组蛋白的阅读蛋白。相比之下, H3K79 甲基化位于组蛋白3的球状领域, 并与不同的发育功能有牵连。H3K79 甲基化是进化保守的, 可以从智人到酿酒酵母的种类繁多的物种中发现。改变发生在不同的细胞数量的生物体内, 包括神经祖。H3K79 甲基化在组蛋白3的球状域中的位置使得难以评估。在这里, 我们提出的方法分离和培养皮层祖细胞 (党) 从胚胎皮质脑组织 (E11.5-E14.5) 或小脑颗粒神经元祖 (CGNPs) 从产后组织 (P5-P7), 并有效 immunoprecipitateH3K79me2 定量 PCR (qPCR) 和全基因组测序。
Introduction
大脑的感官、运动和认知功能非常复杂, 容易受到物理和环境变化的影响。大脑由后、中、前脑的三一般部分组成, 它们是紧密相连的。前脑内, 端可分为背部端 (DT) 和腹端 (VT)。小鼠的 DT 由六皮质层组成, 它们是在 E11.5 和 E18.5 之间形成的, 以 "内而外" 的方式1。VT 包括节主教在发育中, 后来形成基底节2,3。几种细胞类型可以归类在哺乳动物中枢神经系统, 如神经元, 星形胶质细胞, 或突4, 在颞空间的方式5发展。首先, 神经祖细胞 (npc) 产生不同类型的神经元, 神经元在 VT, 和投射神经元在 DT, 后来到神经胶质细胞 (例如, 星形细胞6)。在皮质发育过程中, 首先形成了含有卡哈尔 Retzius 细胞的最浅层 (I 层)。然后, 在 E12.5 和 E14.5 之间, npc 产生更深的神经元层 (VI, V), 而在14.5 和16.5 之间, 祖细胞引起上层 (IV-II) 神经元7,8。神经元的身份是由不同的形态诱导的颞空间转录程序和另外的后生程序2指定的。
小脑, 这是牵连在运动协调, 位于后脑和发展之间的 E10 和粗略 P20 在小鼠9。它包含小脑皮质和小脑核10。成人小脑皮质包括三层, 最外层的分子层, 浦肯野细胞层, 和包含颗粒状神经元的最里层的颗粒层10。小脑颗粒细胞是最小的神经元, 代表了脊椎动物大脑中大约80% 的神经元11。它们从位于外部生发区的前驱体发展而来, 并通过浦肯野细胞层迁移到它们的目标12。象在端, 小脑的发展由几个重要来说调控, 有具体时间和空间相关的作用和创始被定义的转录节目10。
皮质和小脑层的发育由特定来说的转录表达控制, 因此, 由 DNA 的染色质状态。在一个简化的观点, 染色质状态可以被划分成染色质作为转录活跃和异作为转录沈默区域。核作为染色质的基本单位, 包含了每个核心组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4 的两个拷贝, 周围有147碱基对 DNA13。组蛋白是高度后翻译修饰的甲基化, 乙酰化, 磷酸, 泛, sumo, ADP adp-, 脱, 和脯氨酸异构化反应14,15。组蛋白赖氨酸甲基化被认为是最稳定的蛋白修饰, 控制转录, 复制, 重组16, DNA 损伤的反应,17, 和基因印记18。Lysines 可以是单、di 或三甲基化的19 , 并且不仅出现在可访问的组蛋白尾部, 而且还显示在组组的球状域中20。具体的 h3k4 在 H3K4 和 H3K36 主要与染色质, 具体 h3k4 在 H3K9, H3K27, 或 H4K20 主要在异地区发现, 虽然所有残留物位于组蛋白尾部14, 19,21。H3K79 甲基化位于组蛋白球状域内, 并与转录活性有关, 但也与转录惰性基因的区域22有关。由于在酵母、小牛胸腺、鸡肉和人类23中观察到了这种改变, 因此在进化上是保守的。H3K79 单, di, 和 trimethylation (H3K79me1, me2, me3) 是由组蛋白甲基 DOT1L24,25和核集合域含蛋白质 2 (Nsd2)26。DOT1L 与增殖、DNA 修复和细胞 reprograming27有牵连。Dot1l在小鼠中的丢失导致在发育阶段 E10.528,29周围的产前死亡。在心脏发育和 myocardiocyte 分化期间, DOT1L 是基因表达调控的关键30。在中枢神经系统中, DOT1L 功能可能牵连神经管发育31, 它涉及在前脑发育32期间抑制Tbr1表达, 并可在 ER 应力调节中起作用响应基因33。H3K79me 的上下文相关激活或镇压行动, 特别是与在体内情况象中央神经系统的发展, 是到目前为止仅部份地被了解的32。由于 H3K79 甲基化位于组蛋白3的球状域中, 因此与灵活的组蛋白尾23的修饰相比, 阻的可访问性较差。为了了解 H3K79 甲基化的作用, 需要可靠和可重复的分析方法来确定其位置和基因组环境。在本方法中, 我们提出了不同的神经祖细胞的分离方法 (党用于小脑的皮质和 CGNPs), 有效的 DOT1L 抑制剂治疗, 以及在不同时间通过 qPCR 或测序来分析 H3K79 甲基化的芯片方法在皮质和小脑发育过程中的点。有关协议及其可能性的概述, 请参见图 1。
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Protocol
弗莱堡大学的动物福利委员会和地方当局批准了以下协议中提到的所有动物实验 (G12/13, G16/11)。
1. 准备工作
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党分离制剂
- 建立定时交配, 以获得胚胎在不同阶段的皮层发育 (E11.5 和 E14.5)。使用小鼠的应变 NMRI (海军医学研究所), 这是至少8周的老。交配后, 考虑一个积极的阴道堵塞在 E0.5。
- 要有足够的材料, 在 E12.5 或 E14.5 的皮质上用一小块 NMRI 鼠 H3K79me2 芯片。对于以后的胚胎阶段, 用一小块做更多的芯片分析 (平均 NMRI:10 胚胎)。
- 冷 Hank´s 平衡盐溶液 (HBSS) 和磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 到4° c (长期存贮在 RT)。
- 平衡4° c 储存的胰蛋白酶-EDTA (0.05% w/v) 到37° c。
- 准备皮质细胞培养基 (CCM):补充培养基的神经元 (见材料表) 的最终浓度为 2% (v/v) B-27 补充, 5 µg/毫升的脂蛋白-转铁蛋白, 1 µg/毫升谷胱甘肽, 0.5 毫米 l-谷氨酰胺, 0.8 µg/毫升超氧化物歧化酶, 1% (v/v)青霉素-链霉素-霉素抗生素混合物。储存在4° c。为实验, 平衡介质到37° c。
- 解冻胎儿小牛血清 (FCS), 分它 (50 毫升每) 和平衡一分到37° c (长期存贮在-20 ° c)。
- 在 H2O 中为单元格区域性准备 dnasei 1 (10 毫克/毫升) 的库存。商店等分在-20 ° c。
- 如果需要, 溶解特定的 DOT1L 抑制剂 EPZ-5676 或 SGC0946 在亚甲基亚砜的股票浓度为100毫米。将1-5 µM 的末端浓度应用于0天的细胞, 每两天重新涂抹一次抑制剂。
- 为 CPC 培养, 涂层细胞培养板材 (6 井或12井) 与聚 l-鸟氨酸氢溴酸盐 (1 毫克/毫升在150毫米硼酸酸碱度 8.4) 为至少 1 h 在 RT 和之后与层粘连蛋白 (1 毫克/毫升) 在 CCM 媒介在37° c 隔夜。
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CGNP 分离制剂
- 组织适当的小鼠交配, 以产生 P5-P7 的动物来隔离小脑 (每个芯片和条件3-5 动物)。
- 在 HBSS 缓冲液中加入6毫克/毫升葡萄糖, 准备 HBSS/葡萄糖。
- 制备 CGNP 细胞培养基 (CGM), 加入 1% (v/v) N2 补充剂, 1% (v/v) 青霉素-链霉素-霉素, 25 毫米氯化钾和 10% FCS 到 DMEM-F12。为 CGNP 耕种准备 CGM 媒介, 不用 FCS, 但包括0.6 µg/毫升声波刺猬 (嘘) (cgm-嘘) 和平衡它到37° c, 当需要时。
- 6层细胞培养板, 100 µg/毫升的聚-d-赖氨酸1-2 小时用于胶质细胞去除。事后冲洗两次, 无菌 ddH2O, 让盘子晾干。在4° c 的最大一周贮存板材。
- 为培养 CGNPs 外套 6-好细胞培养板材与聚 l-鸟氨酸 (0.1 毫克/毫升) 在4° c 隔夜。之后洗涤两次与 H2O 为细胞文化并且让板材烘干。
注: 板材可在4° c 下贮存最多一周。 - 准备0.025% 胰蛋白酶 (w/v) 在 HBSS/葡萄糖和平衡它到37° c, 当需要时。
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H3K79me2 片的制备
- 在交联染色质前, 准备好粉煤灰 (PBS 1%, pH 8)。在微波中制备50毫升 PBS, 最大65° c。在不断搅拌期间添加0.5 毫克粉煤灰到 PBS。然后加入50µL 10 M 氢氧化钠, 等到粉煤灰溶解。之后, 添加42.5 µL HCl (37% v/v) 以获得 pH 值8。再次验证 pH 值, 然后让1% 的粉煤灰溶液到达 RT。
- 在无菌 ddH 中分别制备核糖核酸 (1 毫克/毫升) 和蛋白酶 K (20 µg/µL), 在-20 ° c 下储存等分.
- 准备以下缓冲器和试剂: PBS 含有0.02% 吐温, 裂解缓冲, 甘氨酸, 稀释缓冲, 芯片缓冲器 1, 芯片缓冲器 2, 芯片缓冲器 3, 和 TE 缓冲器, 并存储在4° c。每次准备洗脱缓冲器。
- 准备包含0.02% 补间的 PBS。最多一周在4° c 存储。
- 在 pH 8.0、10毫米 EDTA、1% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS) 和1x 蛋白酶抑制剂上制备裂解缓冲液。
- 准备2.5 米甘氨酸。
- 用20毫米的 pH 值 8.0, 150 毫米氯化钠, 2 毫米 EDTA, 1% (v/v) 海卫 X-100, 0.25% (w/v) SDS, 和1x 蛋白酶抑制剂准备稀释缓冲液。
- 在 pH 8.0、150毫米氯化钠、2毫米 EDTA、1% (v/v) 海卫 X-100 和 0.2% (w/v) SDS 上使用 20 mm 的三毫米制备芯片缓冲器1。
- 准备芯片缓冲器2使用20毫米的 pH 8.0, 500 毫米氯化钠, 2 毫米 EDTA, 1% (v/v) 海卫 X-100 和 0.2% (w/v) SDS。
- 准备芯片缓冲器3使用20毫米的 pH 8.0, 250 毫米氯化, 2 毫米 EDTA, 1% (v/v) NP-40 和 1% (w/v) SDS。
- 使用20毫米的三 pH 8.0 和2毫米 EDTA 制备 TE 缓冲器。
- 准备新的洗脱缓冲液, 含 1% (w/v) SDS, 100 mM NaHCO3。
2. 神经祖脑组织的分离
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党的分离与可选栽培
- 通过宫颈脱位安乐妊娠动物, 将胚胎移植到冰冷的 HBSS。
- 用剪刀将颅骨取出, 然后将大脑隔离, 然后用小镊子将所有其他脑部部分移除, 如果适用, 用小镊子将皮质 (整个、DT 或 VT) 移除, 如果必要的小剪刀在4° c 的15毫升管中, 将孤立的皮层储存在5毫升的 HBSS 缓冲液中。
- 离心分离的脑材料为5分钟在 1000 x g 和4° c。
- 用5毫升冰冷的 HBSS 和质用1毫升的吸管尖移向上和向下清洗皮质。如有必要, 切下吸管尖端。
- 离心均匀的样品为5分钟在 1000 x g 和4° c。删除 HBSS。
- 添加3毫升胰蛋白酶和孵化样品5分钟在37° c。
- 添加1毫升 FCS, 5 毫升 CCM, 30 µL dnasei 1 的样品和质的样品与5毫升玻璃吸管移小心上下。
- 离心分离的细胞5分钟在 1000 x g 和4° c。丢弃上清, 添加5毫升 CCM, 并再次质样品。
- 稀释样品的分, 并与 Neubauer 计数室计数。每个胚胎的平均数量为 4.5 x 106细胞。为被隔绝的党的耕种继续步2.1.10。对于芯片, 立即进行步骤3。
- 为耕种, 党在聚 l-鸟氨酸 (0.1 毫克/毫升) 和层粘连蛋白 (1 毫克/毫升) 涂覆的盘子在密度在 8 x 104和 2.5 x 105细胞/cm2在 CCM 培养基和孵育他们在37° c, 5% CO2, 和100% 相对湿度。
- 由于党开始分化成神经细胞在细胞培养 (在大约4天以后), 考虑解剖日期作为天在体外0 (天 0)。为了更长的耕种期限, 每第四天改变一半媒介以新鲜的 CCM 媒介。
- 应用1-5 µM SGC0946 或 EPZ5676 溶解在二甲基亚砜在0天 (4-5 小时后细胞隔离) 和刷新它每第二天。使用亚甲基亚砜作为对照治疗。如果需要, 通过标准免疫方法测试抑制剂处理的效率。
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CGNPs 的分离与可选栽培
- 用剪刀安乐 P5-7 动物。取出头皮皮肤, 打开头骨, 用小剪刀和镊子把大脑移走。分离小脑并将其转移到冰冷的 HBSS/葡萄糖。取出所有的脑膜和血管, 并将小脑转化为15毫升的 HBSS/葡萄糖的管子。
- 洗涤小脑三次与10毫升冰冷 HBSS/葡萄糖 (收集他们的离心在 650 x g 为5分钟, 在4° c) 和质小脑随后轻轻移向上和向下与1毫升吸管 (最大2-3 倍) 得到 0.5-1 mm3碎片.
- 在 HBSS/葡萄糖中加入5毫升的0.025% 胰蛋白酶, 并在37° c 水浴下恒温孵育15分钟. 通过加入5毫升 CGM 来停止消化, 并在650° c 以下5分钟的离心法中收集组织。
- 去除上清和研制的组织与1毫升吸管尖端在1毫升 CGM 和转移到一个新的15毫升管。
注意: 避免气泡是很重要的。- 加入5毫升 CGM 和孵化混合物2分钟的冰, 以解决组织残余物。将上清液转化为新的15毫升管。添加2毫升 CGM 到剩余的组织和重复研磨程序。
- 池清 (没有组织残余, 大约10毫升) 和离心机在 650 x g 5 分钟在4° c 收集小脑细胞。重10毫升 CGM 中的颗粒。
- 由于星形胶质细胞坚持更快, 更强的多聚-d-赖氨酸比 CGNPs, 板在100µg/毫升的聚-d-赖氨酸涂层 6-井板 (高达4毫升每井) 和孵化20分钟在37° c, 以消除星形胶质。
- 摇动盘子, 收集上清液。然后离心在 650 x g 为5分钟在4° c 在15毫升管。重10毫升 CGM 中的颗粒, 计数的细胞与 Neubauer 计数室。
注: CGNPs 是圆形, 小, 并显示一个光晕时, 使用相衬显微镜成像。 - 如果需要, 种子的细胞在37° c 前预热 CGM 上的聚 l-鸟氨酸涂层板 (3 x 106细胞每 6-井) 和孵化他们在37° c, 5% CO2和100% 相对湿度。
注意: 如果未执行播种, 请继续步骤3.1。- 6-12 小时后, 将介质转换为 CGM-嘘。治疗隔离 CGNPs 6 小时 (或当改变为 CGM 嘘) 后, 与 DOT1L-inhibitor 和二甲基亚砜控制和更新它每第二天 (比较 2.1.12)。如果需要, 通过标准免疫方法测试抑制剂处理的效率。对于芯片, 继续步骤3.3。
注意: 在盘子上留下 CGM (与 FBS) 将导致 CGNPs 分化为小脑颗粒神经元 (CGNs)。
- 6-12 小时后, 将介质转换为 CGM-嘘。治疗隔离 CGNPs 6 小时 (或当改变为 CGM 嘘) 后, 与 DOT1L-inhibitor 和二甲基亚砜控制和更新它每第二天 (比较 2.1.12)。如果需要, 通过标准免疫方法测试抑制剂处理的效率。对于芯片, 继续步骤3.3。
3. 细胞固定和染色质剪切
注意: 如果单元格未被培养, 则执行步骤3.1 和 3.2, 如果它们正在进入步骤3.3。
- 通过离心收集细胞4分钟 1000 x g, 并添加1.3 毫升 PBS。将样品转移到1.5 毫升的管子。离心机为4分钟在 1000 x g 在4° c。用1.3 毫升 PBS 清洗样品两次。
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关键步骤:添加350µL 1% 粉煤灰的样品和孵化5分钟, 在22° c。为了停止反应, 添加18.4 µL 甘氨酸和1毫升 PBS。离心样品5分钟在 1000 x g 在4° c。
- 用冰冷 PBS 洗两次样品。用离心法收集固定细胞5分钟, 在 1000 x g 和4° c。从现在起把样品放在冰上。
注意: 固定时间必须精确5分钟才能获得最佳效果。不同的细胞数可能需要时间适应。
- 用冰冷 PBS 洗两次样品。用离心法收集固定细胞5分钟, 在 1000 x g 和4° c。从现在起把样品放在冰上。
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关键步骤:对培养的 CGNPs (或党), 添加多达1毫升1% 的粉煤灰直接到细胞培养板井。在22° c 的5分钟孵育后, 加入适量的甘氨酸和 PBS, 用刮板机收割细胞。
- 将细胞转化为1.5 毫升的管子, 并将样品离心5分钟, 在 1000 x g 和4° c。用冰冷 PBS 洗两次样品。在4° c 的 5 minat 1000 x g 的离心收集固定细胞。从现在起把样品放在冰上。
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关键步骤:加入700µL 的裂解缓冲液 (+ 蛋白酶抑制剂), 在4° c 下孵育样品15分钟。涡流样品每5分钟切变裂解细胞的染色质 3 x 10 min 在 sonicator (三十年代脉冲, 三十年代暂停) 在最大力量。
- 确保每根管子的体积不超过350µL。每10分钟将样品涡旋, 用相衬显微镜检查残余核的裂解液。
注意: 获得最佳剪切效果 (与图 1B比较) 以便以后进行分析是很重要的。在使用其他方法来剪切染色质的情况下, 优化剪切到染色质碎片大小之间的 200-500 bp。
- 确保每根管子的体积不超过350µL。每10分钟将样品涡旋, 用相衬显微镜检查残余核的裂解液。
- 颗粒细胞残余物为 10 min, 1.3万 x g, 4 ° c。使用上清 preclearing 步骤5.2。如有需要, 在-20 ° c 冻结样品以备日后使用。
4. 珠子和 Preclearing 的制备
- 洗涤45µL 蛋白质磁珠/芯片和20µL 磁珠/样品与1毫升冰冷 PBS 含有0.02% 吐温三次使用磁性立场。然后, 加入1毫升的冰冷 PBS 的珠子。
- 1毫升冰冷 PBS 和45µL 珠/芯片, 添加3µg 抗体/芯片 (H3K79me2 或兔 IgG)。在4° c 的转子上孵育样品以将抗体与念珠结合。根据抗体, 使用〜3µg 抗体/芯片。
- 用1毫升冰冷 PBS (含0.02% 吐温) 清洗抗体结合珠三次。添加适当的珠体积 (开始体积的磁珠使用) 冰冷 PBS 的洗涤抗体耦合珠。
- 添加600µL 稀释缓冲器和20µL 的洗涤磁珠的样品 preclearing (总体积1320µL) 和孵化2小时在4° c 的转子。使用磁性支架取出珠子。采取 5% (33 µL) 的裂解作为输入样本, 并冻结他们在-20 ° c。
5. 染色质沉淀
- 将 precleared 提取物分成两个管子 (大约643.5 µL), 加入相同体积的稀释缓冲液和抗体结合珠 (45 µL/样品;H3K79me2 或兔 IgG)。将样品在4° c 的一夜之间孵化。
- 用冰冷的芯片缓冲1、芯片缓冲器2和芯片缓冲器 3, 在一个旋转器的4° c 上分别洗涤10分钟的珠子。之后, 用 TE 缓冲器洗涤三次, 在4° c 的旋转器上5分钟。
- 洗在室温下, 用洗脱缓冲液在1小时内以 1400 rpm 在振动筛上。
- 添加10µg 核糖核酸 (1 毫克/毫升) 每片样品和5µg 到输入样品和孵化样品为30分钟在37° c (1400 rpm)。
- 添加100µg 蛋白酶 K (20 µg/µL) 每片样品和50µg 每输入和孵化过夜在65° c 在 1400 rpm。
6. 芯片样品的提纯
- 用 DNA 纯化试剂盒净化芯片和输入样品 (参见材料表)。当超过5µg 的 DNA 被期望时, 使用更多的纯化柱。洗样品与 2 x 15 µL 的 DNA 洗脱缓冲器提供的试剂盒。
- 通过使用可视化的荧光和 fluorospectrometer (请参见材料表) 对样本进行量化 (使用1µL)。
7. 通过 qPCR 分析芯片样品
- 对于 qPCR 分析的入门设计, 从集成基因组查看器 (IGV) 浏览器34中检索感兴趣的基因组序列。在一个基因的转录起始点周围设计底漆, 因为 H3K79me2 很可能位于那里。作为一个控制, 考虑非编码的基因组区域或区域大约 10 kb 上游的技术支助或 10 kb 下游的转录终端网站 (附加费)。
- 使用 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/70 和 200 bp 的产品尺寸和60° c 的最佳温度预设生成底漆。为试验目的, 使用在表 1中列出的基因组区域Aft4、Ddit3、 Scd1、 Aft3、和Npm1的引物。
- 测试新设计的底漆与以下 qPCR 程序, 主混合, 和退火温度梯度在58° c 和63° c 之间, 并且选择退火温度以最高的产品数量和质量。
- 应用 DNA 凝胶电泳控制预期的产品尺寸。对于 qPCR 分析, 请使用实时 PCR 检测系统 (请参阅材料表)。
- 准备主混合使用10µL dna 聚合酶主混合, 0.5 µL 底漆向前 (10 µM), 0.5 µL 底漆反向 (10 µM), 4 µL 核酸无水, 和5µL dna (1 ng/µL)。
- 使用2步 qPCR 程序如下: 5 分钟在95° c, 50x (三十年代在95° c, 三十年代在58° c-63 ° c) 和变性梯度经常在4° c。
- 创建一个稀释系列的基因组, 剪切, 纯化 DNA 样本 (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0.5 ng/µL, 0.25 ng/µL, 和 0.125 ng/µL) 和使用5µL 的效率测试使用 qPCR。确定标准曲线的斜率, 并通过以下公式计算底漆的效率:
效率 (%) = (10^ (-1/倾斜)-1) * 100。- 使用底漆与效率在90% 和105% 之间在一个理想的事例, 或者至少以效率在85% 和115% 之间。
- 为了分析芯片和输入样品, 应用 0.1-1 ng 芯片 dna 混合与分别向前和反向底漆, 核酸无水, 和 DNA 聚合酶主混合在20µL 的最终体积为每 qPCR 反应。
- 确定芯片和输入样本的阈值周期 (ct), 并将样本 c 的t规范化为 ct输入的值以计算浓缩量 (% 输入), 并使用以下公式。使用从 IgG 控制中获得的 Ct值来确定背景级别。
% 输入 = 100-2^(范数. 输入−范数。芯片)
规范.输入 = Ct (输入) −日志2(稀释因子)
规范.芯片 = Ct (芯片) −日志2(稀释因子)
注意: 规范。= 规范化
8. 通过测序分析芯片样品
- 将芯片样本 (输入和 immunoprecipitated DNA 样本) 转移到测序设施。
- 要预先准备库, 请使用适当的库准备工具包 (请参阅材料表), 并将输入 dna 的 2 ng 和所有的 immunoprecipitated dna 转换为索引库, 用于下一代复合序列指定的平台 (请参见材料表)。
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关键步骤:按照试剂盒的指示, 结扎测序适配器 (工作浓度为15µM), 以结束修复和 dA 尾 DNA 片段。对于测序适配器和 PCR 引物使用适当的寡 (参见材料表)。对于这一数量的输入 dna, 使用 6-9 PCR 周期来丰富适配器结扎的 dna 片段。
注: 通常情况下, 不需要对适配器的 DNA 进行大小选择。最好使用尽可能少的 pcr 周期, 因为许多 pcr 扩增周期导致 pcr 重复和高 GC 偏倚。 - 对于一个最终的库检查, 采取0.5 µL 的总反应分析, 以可视化大小分布在一个适当的设备 (请参见材料表)。对于量化, 使用可视化染料结合 fluorospectrometer 或其他方法 (请参见材料表)。
- 因为 H3K79me2 似乎是一个组蛋白修饰, 这是广泛分布在更大的染色体区域, 序列样品配对结束以读的长度 50 bp 并且以测序深度75宇达读。
- 分析与 galaxy/单向弗赖堡服务器 (galaxy..。
- 执行质量控制与获得的 ChIPseq 与 FastQC, 如果合适, 直接映射他们与 Bowtie2 版本 2.2.035有或不修剪。作为参考基因组组装使用 mm9 或最新版本的 mm10;作为参考注释 Ensembl FTP 版本79。
- 可选: 在峰值呼叫前使用皮卡德 MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) 删除读取重复项。
- 用 MACS2 版本 2.1.036调用峰值, 使用 H3K79me2 的 "宽" 选项。
- 若要获取芯片和输入示例之间的日志2比率, 则两个示例的读取比率读取次数的日志2都使用 BamCoverage 和 BamCompare。
- 对于所有其他深入的芯片-seq 特定分析, 应用 deepTools2 版本2.3.5 或 2.4.137,即生成覆盖跟踪文件 (仅用于芯片的 bamCoverage, bamCompare 用于芯片的比较), 估计芯片性能使用 plotFingerprint 和生成一般概述使用 computeMatrix, plotHeatmap。根据 H3K79me2 分布, 在 computeMatrix 过程中选择 k-均值聚类来聚类基因组区域。
- 使用已发布的芯片 seq 数据作为 H3K79me2 的 E14.5 DT, 用于试验目的 (加入号码: SRP057733) NCBI。
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Representative Results
神经祖分离、培养、H3K79me2 芯片和芯片分析方法的一般方案:图 1显示了一个流程图, 用于在胚胎发育期或产后阶段的小脑颗粒神经元祖细胞的不同时间点执行 H3K79me2 芯片。作为第一步, 大脑必须被孤立, 端 (在 E11.5 和 E14.5 之间) 或小脑 (P5-P7) 必须被检索。通过将端划分为 DT 和 VT, 可以分析不同区域。随后组织将匀浆和神经祖细胞分离。现在, 有可能培养祖细胞和治疗他们与 DOT1L 抑制剂。另一种可能性是直接修复祖细胞, 并将其置于晶片程序中。对于芯片, 染色质将被剪切成 200-500 bp 的片段, 随后用磁珠耦合抗体对 H3K79me2 进行孵育。在洗涤珠子和检索 dna 后, 沉淀的 dna 可以通过测序或 qPCR (图 1A) 进行分析。这是必要的, 有一个良好的大小分布的染色质片段后剪切, 所以最好检查的片段大小与 DNA 凝胶电泳或其他方法 (例子在图 1B)。在选择全基因组测序时, H3K79me2 的芯片序列读取将作为 fastq 文件提供, 供进一步分析 (图 1C)。顺序读取的质量需要通过应用 FastQC 进行评估, 如有必要, 可以使用 TrimGalore 对 fastq 文件进行裁剪。映射到小家鼠基因组 mm9 或 mm10 可以执行与 Bowtie2 和控制通过 PlotFingerprint。可取的做法是删除重复的 MarkDuplicates 和正常化的读取 BamCoverage 和比较的芯片与输入样品与 BamCompare。在集成基因组观察器 (IGV) 的浏览器会话中, 芯片序列读取随后可以在 heatmaps 或基因智能中可视化。
中共文化与 DOT1L 抑制:党被隔绝了和对待与5µM DOT1L 抑制剂 SGC0946 在天0和天2。溶剂型亚甲基亚砜被用作一种控制。在3天, 党被收获, 蛋白质被分离, 定量和分析通过免疫 (图 2A)。图 2A显示, 经过三天的 CPC 培养和 DOT1L 抑制, H3K79me2 水平有效降低, 确保了有效的抑制剂治疗方案。H3, GAPDH, 或蛋白α的蛋白质数量作为装货控制是从而不被削弱的。免疫的固定党与抗体活性酶 3 (CASP3+) 检测细胞凋亡和 HuC/D 用于可视化神经元细胞显示, 治疗党与 DOT1L 抑制剂导致增加细胞死亡后三天的文化, 如图所示在图 2B中。在 CPC 培养基中, CASP3+/DAPI+ 或 HuC/d-/DAPI + 的细胞的定量显示, CASP3+ 细胞在 DOT1L 抑制时显露出细胞程序性死亡的显著升高。然而, HuC/d-阳性神经元的数量保持不变 (图 2C)。
H3K79me2 芯片-qPCR Aft4、 Ddit3、 Scd1、 Aft3、和Npm1从党处理 DOT1L 抑制剂: 以测试 SGC0946 抑制剂治疗 DOT1L 是否有效, 并导致减少 H3K79me2 在特定基因, 我们进行了芯片分析后, qPCR 的 CPC 治疗3天。兔 IgG 被用作芯片控制。由于众所周知, H3K79me2 位于 endoplasmatic 应力响应基因Aft4, Ddit3, Scd1,和Aft3以及在核传输基因Npm133,38, 我们使用qPCR 的引物覆盖了在基因体内的支助、附加费和染色体组区, 以确定 DOT1L 抑制后 H3K79me2 分布的差异 (图 3A)。具有高 H3K79me2 水平的基因如Atf4、 Ddit3、和Npm1对抑制剂的治疗反应最灵敏, 因此三天的 DOT1L 抑制导致 H3K79me2 的显著减少。H3K79me2 覆盖率较低的基因, 如Atf3和Scd1 , 在 H3K79me2 水平上没有明显的变化。
H3K79me2 芯片-seq 分析概述:全基因组分析的 H3K79me2 水平在党从 E14.5, 执行和分析根据所提出的方案和协议 (图 1), 揭示了一个非常高品质的芯片。而搁置计数, 根据他们输入读的频率在指纹印迹 (图 4A), 均匀地分布, H3K79me2 计数显示了充实在具体区域 (垃圾箱排列与 1), 显示成功在 H3K79 中修饰的染色质碎片的堆积。图的 H3K79me2 沿着他们的科技和工商业污水附加费的基因和 +/-10 kb 上游或下游显示 (图 4B), H3K79me2 峰值周围的支助和下降, 以一般的附加费。有基因, 完全地被覆盖与 H3K79me2, 并且基因, 有一个峰顶仅在处理的区域之内。Endoplasmatic-应力相关基因, 如Atf4, Ddit3,和 nucleophosmin Npm1港, 例如, 高 H3K79me2 水平在支助处, 这只是略有下降沿整个基因体 (图 4C)。相比之下, Scd1在 H3K79me2 中的占地率较低, 在基因体内没有 H3K79me2。Atf3作为最后一个示例, 在基因体上具有不同的尖锐和低级别 H3K79me2 峰。
图 1: 从孤立的党或 CGNPs 的 H3K79me2 芯片协议的方案和序列分析的流程图.(A)介绍的协议概述。对于 CPC 的隔离, 第一 E14.5 的大脑将被孤立, 如果需要, 皮质可以分为 DT 和 VT。对于 CGNPs, 小脑必须从 P5-P7 鼠身上提取。该组织将均匀化, 祖细胞分离, 然后可以培养和处理适当的抑制剂或直接用于芯片。对于芯片, 染色质的固定, 其次是剪切和沉淀与 anti-H3K79me2 抗体和兔 IgG 作为控制。DNA 纯化后, 可以通过库的制备和测序分析芯片样品, 也可以通过 qPCR 进行分析。(B)质量染色质的适当和不适当的示例。DNA 片段分布显示在 bp 中。(C)芯片 seq 结果可以在弗赖堡/Galaxy 服务器上受到分析管道的影响。在质量控制 (FastQC) 之后, 读取可以用 TrimGalore 修剪, 然后通过 Bowtie2 映射到鼠标基因组 (在所提供的情况下 mm9)。PlotFingerprint 评估芯片的质量。要定义 H3K79me2 的峰值, 可以应用 MACSpeaks。为规范化 BamCoverage 和为比较对输入 BamCompare 是有用的。为了形象化结果 IGV 浏览器和 heatmaps 是适当的。预期的文件格式是斜体。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 皮层祖培养和 DOT1L 抑制.(A) Immunoblots 在 DOT1L 抑制3天 (3 天, n=3-11) 后, 在 CPC 中显示 H3K79me2 的水平, 与亚甲基亚砜的对照相比。H3、GAPDH 和蛋白α被用作加载控制。(B)免疫2和3天的 CPC 文化染色。活化酶 3 (CASP3 绿色)-阳性细胞和神经元 (HuC/D: 红色) 染色。DAPI (蓝色) 被用来可视化细胞核。缩放栏: 100 µm. (C)在 (B) 中提出的 immunostainings 的量化。给出了 CASP3+/DAPI+ 或 HuC/D +/DAPI + 百分比的阳性细胞比例。进行统计学分析, 对未配对学生进行 t 检验。p < 0.01 **。此图是从 Roidl et al.中修改的33,38请单击此处查看此图的较大版本.
图 3 : H3K79me2 芯片-qPCR Aft4、 Ddit3、 Aft3、 Scd1、和 Npm1 从党处理 DOT1L 抑制剂。 (A) E14.5 党在隔离后以5µM DOT1L 抑制剂治疗4-5 小时, 并在2天的培养基中进行第二次处理。党在3天固定, 其次是染色质提取, 芯片实验, 和 qPCR。结果表示为平均值 (+/-SEM)% 输入 (n=3)。IgG 被用作阴性对照。IgG 水平的平均值被描述作为虚线。对于统计学分析, 采用了双向方差统计。p < 005 *;p < 0.01 **, < 0.001 **;转录起始点, 附加的转录终点。此图是从 Roidl et al.中修改的33,38请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: H3K79me2 芯片-seq 分析概述.(A)从 E14.5 导出的党 H3K79me2 芯片序列的指纹与输入相比, 显示了 H3K79me2 的 DNA 片段的丰富性, 从而确保了高的芯片序列号质量。(B) H3K79me2 在图中绘制的芯片 seq 结果。强烈丰富的基因组区域以蓝色呈现。缩放 0 (暗红色)-45 (深蓝色)。H3K79me2 峰附近的峰值和下降的3´方向的工商业污水附加费。(C) H3K79me2 芯片序列读取被映射到 mm9 基因组, 并与集成的基因组查看器 (IGV) 进行可视化。一个基因的 H3K79me2 占有是显示为 log2 的数量读取比芯片和输入读取每 kilobase 每百万 (缩放:-10 到 10)。Refseq 基因结构代表, 而一个红色框表示第一外显子包括的支助。显示基因Aft4、 Ddit3、 Scd1、 Aft3、和Npm1 。为了比较, 将显示同一基因组区域的 H3K4me3 信号。转录起始点, 附加的转录终点。此图是从 Roidl38中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.
| 基因 | 区域 | 引物向前 5 "-3" | 底漆反向 5 "-3" | ||
| Aft4 | tss | GGACGATCTCTAACGCCACA | GCCCTAAACCCGCCCTTTAT | ||
| Aft4 | TSS+1500 | CTCCCGAATATGACATGAACCG | TCCATTCGAAACAGAGCATCG | ||
| Aft4 | 附加 | CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC | AAAGAATGACACTGAAAACCCACA | ||
| Ddit3 | tss | GTACTGGCTCCGTCTAACCC | CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA | ||
| Ddit3 | TSS+2500 | TCAAGCAGCCGGTCTCATAG | CTCAGATCCCCCAATGGCTT | ||
| Ddit3 | TSS+4500 | GAGCTGGAAGCCTGGTATGA | TCACCTCTTCGTTTCCTGGG | ||
| Ddit3 | 附加 | CACCAAGCATGAACAGTGGG | GTACCGTCTATGTGCAAGCC | ||
| Aft3 | tss | AACTGAGAGCGCAACTCCTC | GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA | ||
| Aft3 | 附加 | CTGTTGGCACAAAGTGGCTC | GGGATCTGCCATGGTGGAAA | ||
| Scd1 | tss | TAGTGACCACACACAAAAGCTC | CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC | ||
| Npm1 | tss | TCCCCCTCCAGTCAGTTACC | CGTCCTTTCCTTGGCGTGA | ||
| Npm1 | 附加 | AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG | AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT | ||
| 转录起始点 | |||||
| 转录终站 | |||||
表 1: 用于芯片 qPCR 的引物清单。
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Discussion
有两种主要的方法来执行染色质沉淀, 以检测组蛋白的修饰, 转录因子的染色体的占有率, 蛋白的读者, 作家, 或橡皮擦。一种是用核酸消化的原生芯片法, 沉淀的原染色质, 另一种是采用粉煤灰固定的, 被剪切的染色质, 其中核和其他 dna 附着的蛋白质与 dna 共价键结合的方法。39. 本机芯片具有较高的抗体检测率, 应适用于组蛋白甲基化, 因为染色质和组蛋白 h3k4 在整个芯片中相对稳定。但是由于大量的起始材料是需要的, 它不适用于研究皮质或小脑发育, 那里的细胞数量从老鼠大脑通常是有限的。虽然抗体一般是针对非固定的材料, 我们可以证明, 抗体明确检测 H3K79me2, 因为特定的抑制 DOT1L 导致 H3K79me2 信号减少芯片 qPCR 分析和 immunoblots (图2A和图 3A)。使用交联材料的芯片可能效率低下, 但所提出的协议确保了足够的 qPCR 和测序分析的特别丰富的材料。
对于一个有效的芯片, sds 浓度的裂解缓冲可能是至关重要的, 因为 sds 使蛋白, 并使它们可以获得抗体结合。这一特性对于 H3K79me2 是特别重要的, 它是位于组蛋白3的球状域内并在染色质最小单位22的核核心内的蛋白修饰。因此, 对于 H3K79me2, 在分析过程中需要较高的 SDS 浓度 (大约0.3% 瓦特/v), 以确保最佳基因的可达性。有了这种 SDS 浓度, 我们可以高度丰富 H3K79me2 的 IgG 控制 (图 3) 和输入 (图 4)。因此, 用于测序的芯片材料的质量是适当的, 对输入的富集比 H3K4me3 (图 4)。我们预计, H3K79 单或 trimethylation 标记的芯片需要同样的 SDS 浓度。一般而言, 越严格的芯片缓冲, 较少假阳性染色质片段是 immunoprecipitated, 如果抗体的质量不受使用的洗涤剂的影响。对于未来, 它可能是可行的, 将所提出的协议应用于组蛋白的球状领域中的其他组组修饰。
如果抗体适合于芯片, 并在较高的洗涤剂浓度稳定, 该协议主要包含两个关键步骤。首先, 细胞的固定和随后的染色质应优化每一个细胞类型和每 ultrasonicator。延长交叉连接导致固定工件, 并可能降低抗体检测率, 因为抗原可能被掩盖。染色质切变需要带领脱氧核糖核酸的一个大小发行在200和 500 bp 之间 (图 1B)。核包含 147 bp 的 DNA。染色质碎片太长会导致假阳性结果 qPCRs。在全基因组测序期间, 不正确的大小发行将导致错误阴性结果, 因为经常仅小片段被考虑。第二个关键步骤是为全基因组测序准备图书馆。DNA 扩增步骤需要使用 6-9 PCR 周期进行。避免许多 pcr 周期是必要的, 因为它们可能导致高 GC 偏倚和许多 pcr 重复。通过所提出的协议, 可以检索足够的 DNA, 以保持必要的 PCR 循环数量的低。
脑组织由不同数量的细胞类型组成, 如神经元、突和胶质细胞4。在开发过程中, 这些细胞来源于神经干细胞, 并在时间和位置相关的方式3中构建特定区域。例如, 大脑皮层的神经再生发生在小鼠 E11.5 和 E18.5 之间。在早期的阶段, 如 E11.5 和 E12.5 几乎所有的细胞都有祖识别1, 但后来的细胞多样性需要被考虑在内。因此, 在 E14.5 的皮质组织芯片可以揭示 H3K79me2 或任何其他组蛋白修饰在该特定时间点, 但不能显示细胞类型的特定染色质特征。这一问题可以通过丰富的特定细胞的荧光活化细胞分类 (磁场) 或磁活化细胞分类 (mac 分类)40, 这是可行的后, 大脑均匀化。用 mac 分选的神经祖细胞携带特定的细胞表面标记可以用磁珠标记, 然后用磁性支架40隔离。之后细胞可以被培养或直接地使用为芯片。所提出的协议不仅可以用于神经祖细胞, 也可用于其他同类细胞的群体。通过增加外地资产管制或 mac, 该协议可适用于生物体内的所有 isolatable 细胞。
同时, 所提出的协议, 使得有可能研究组蛋白修饰 H3K79me2 在不同时间点的皮质和小脑发育的有效和重现的方式。它可能适用于组蛋白核内的其他组蛋白修饰, 并可应用于生物体内的其他同类细胞类型。由于 H3K79me2 是一个保守的组蛋白修饰23, 因此该协议也适用于分析 H3K79me2 不仅在小鼠中, 而且在不同物种之间。
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Disclosures
作者宣布, 他们没有竞争的金融利益
Acknowledgments
我们感谢亨利埃特 Bertemes 在实验室中帮助建立 CGN 种植协议。本方法通过对电视的资助, 由 DFG 资助的 CRC992 医学遗传学研究支持。作者承认弗莱堡星系小组的支持: Pavankumar Videm, bj Grüning 和 Prof., 生物信息学, 德国弗赖堡大学, 由合作研究中心资助的992医学遗传学 (Backofen 补助金 DFG 992/1 2012)并且德国联邦教育和研究部 (BMBF 授予 031 A538A RBC (de。NBI))。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium |
References
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