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Neuroscience

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Abstract

Die Entwicklung des Gehirns ist ein komplexer Prozess, der in gewissem Sinne Temporo-räumliche von Steigungen von Morphogens und verschiedene transkriptionelle Programme gesteuert wird. Darüber hinaus haben die epigenetische Chromatin Modifikationen, wie Histon-Methylierung, für Aufbau und Pflege von bestimmten Zelle Schicksale in diesem Prozess eine wichtige Rolle. Die überwiegende Mehrheit der Histon-Methylierung tritt auf die flexible Histon-Schweif, die Histon-Modifikatoren, Radiergummis und Histonproteine Leser zugänglich ist. Im Gegensatz dazu H3K79 Methylierung befindet sich in der globulären Domäne von Histon 3 und ist in verschiedenen Entwicklungsstörungen Funktionen beteiligt. H3K79-Methylierung ist evolutionär konserviert und finden in den unterschiedlichsten Arten von Homo Sapiens zu Saccharomyces Cerevisiae. Die Änderung tritt in unterschiedlichen Zellpopulationen innerhalb von Organismen, einschließlich des neuronalen Vorläuferzellen. Die Lage der H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 macht es schwierig zu beurteilen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden, zu isolieren und Kultur kortikalen Progenitor Zellen (CPCs) aus embryonalen kortikalen Hirngewebe (E11.5-E14.5) oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter (CGNPs) vom postnatalen Gewebe (P5-P7) und effizient immunoprecipitate H3K79me2 für quantitative PCR (qPCR) und genomweite Sequenzierung.

Introduction

Die sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen des Gehirns sind hoch komplex und anfällig für körperliche und ökologischen Veränderungen. Das Gehirn besteht aus drei allgemeine Teile der Hind-, Mittel-, und Vorderhirn, die zutiefst verbunden sind. Im Vorderhirn kann das Telencephalon in einer dorsalen Telenzephalon (DT) und einer ventralen Telencephalon (VT) unterteilt werden. Die DT von Mäusen besteht aus sechs kortikalen Schichten, die zwischen E11.5 und E18.5 in einer Art und Weise der "Inside-Out"1gebildet werden. Der VT umfasst die ganglionic Eminenzen in Entwicklung, die später die Basalganglien2,3bilden. Verschiedene Zelltypen lassen sich einteilen in den Säugetier-Zentralnervensystem wie Neuronen, Astrozyten oder Oligodendrozyten4, die in einem Temporo-räumliche Weise5zu entwickeln. Zunächst entstehen die neurale Vorläuferzellen (NPCs) verschiedene Arten von Neuronen, Interneuronen in der VT und Projektion Neuronen in der DT und später nach Gliazellen (z.B. Astrozyten6). Während der kortikalen Entwicklung, die oberflächlichste Schicht (Schicht I), Cajal-Retzius-Zellen enthält zuerst gebildet ist. Anschließend generieren NPCs zwischen E12.5 und E14.5, neuronale Tiefenschichten (VI, V) beim zwischen 14,5 und 16,5, Stammväter Anlass zu Oberschicht (IV-II) Neuronen7,8. Neuronale Identität wird von verschiedenen Morphogen-induzierte Temporo-räumliche transkriptionelle Programmen und zusätzlich durch epigenetische Programme2angegeben.

Das Kleinhirn, die motorische Koordination beteiligt ist, befindet sich in dem Hinterhirn und zwischen E10 und grob P20 in Mäusen9entwickelt. Es enthält die zerebelläre Kortex und zerebelläre Kerne10. Die Erwachsenen zerebelläre Kortex besteht aus drei Schichten, die äußerste molekulare Schicht, die Purkinje-Zellschicht und der innersten Körnerschicht enthält körnige Neuronen10. Die zerebelläre Granulat-Zellen sind die kleinsten Neuronen und repräsentieren rund 80 % aller Neuronen in der vertebrate Gehirn-11. Sie entwickeln aus Vorstufen in der externen germinal Zone gelegen und durchwandern der Purkinje Zelle Schicht auf ihre Ziel-12. Wie die Entwicklung des Kleinhirns im Telencephalon, durch mehrere wichtige Morphogens reguliert wird, definiert die bestimmte Zeit und Raum-abhängige Funktionen und initiieren transkriptionelle Programme10.

Die Entwicklung der kortikalen und zerebelläre Schichten wird durch transkriptionelle Ausdruck der spezifischen Morphogens und damit der Chromatin-Staat der DNA gesteuert. In einer vereinfachten Ansicht können Euchromatin als transcriptionally aktiv und Heterochromatin als transcriptionally leisen Regionen Chromatin Staaten aufgeteilt werden. Das Nukleosom als die grundlegende Maßeinheit des Chromatins enthält zwei Kopien von jedem Core-Histone H2A, H2B, H3 und H4, umgeben von 147 Basenpaare der DNA-13. Histone werden durch Methylierung, Acetylierung Phosphorylierung, Ubiquitination, Sumoylierung, ADP-Ribosylation, Deamination und Prolin Isomerisierung14,15hoch posttranslational modifiziert. Histon-Lysin-Methylierung gilt als die stabilste Histon-Modifikation, die Transkription, Replikation, Rekombination16, DNA-Schäden Antwort17und genomische Prägung18steuert. Lysines können Mono-, di- oder Tri-methylierte19 und erscheinen nicht nur auf den zugänglichen Histon-Schwänzen, sondern auch innerhalb der globulären Domäne der Histone20. Spezifische Methylations H3K4 und H3K36 vor allem mit Euchromatin verbunden sind, spezifische Methylations bei H3K9, H3K27 oder H4K20 sind vor allem in heterochromatischen Regionen gefunden, obwohl alle Rückstände der Histon Schweif14, liegen 19,21. H3K79-Methylierung befindet sich innerhalb der Histon globulären Domäne und transkriptionelle Aktivität, sondern auch mit transcriptionally inert genomische Regionen22zugeordnet wurde. Die Änderung ist evolutionär konserviert, da es in Hefe, Thymus Kalb, Huhn und menschlichen23beobachtet hat. H3K79 Mono, di und Trimethylation (H3K79me1, me2, me3) sind durch die Histon-Methyltransferasen DOT1L24,25 und die nukleare SET Domain-haltige Protein 2 (Nsd2)26katalysiert. DOT1L ist in Proliferation, DNA-Reparatur und Mobilfunk umprogrammieren27verwickelt. Verlust von Dot1l bei Mäusen führt zu einer pränatalen Tod um die Entwicklungsphase E10.528,29. Während der Entwicklung von Herz und Myocardiocyte Differenzierung unbedingt DOT1L gen Ausdruck Verordnung30. In das zentrale Nervensystem, DOT1L Funktion im Neuralrohr Entwicklung31einbezogen werden könnte, sie engagiert sich bei der Unterdrückung der Tbr1-Ausdruck im Vorderhirn Entwicklung32, und funktionieren in der Verordnung von ER-Stress Antwort Gene33. Die Kontext-abhängige Aktivierung oder unterdrücken Einwirkung von H3K79me, vor allem mit in Vivo Situationen wie die Entwicklung des zentralen Nervensystems, ist bis heute nur teilweise verstanden32. Da H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 befindet, ist es im Vergleich zu Änderungen auf die flexible Histone Tails23sterisch weniger zugänglich. Um die Funktion der H3K79-Methylierung zu verstehen, brauchen wir zuverlässige und reproduzierbare Analyse-Methoden, seine Lage und genomische Umwelt bestimmen. In diesem Methoden-Papier präsentieren wir Ihnen Isolationsmethoden von verschiedenen neuronalen Vorläuferzellen (CPC-Gebote für den Kortex) und CGNPs für das Kleinhirn, wirksame DOT1L Inhibitor Behandlung und eine ChIP-Methode H3K79 Methylierung mittels qPCR oder Sequenzierung zu verschiedener Zeit analysieren Punkte während der kortikalen und zerebelläre Entwicklung. Für einen Überblick über das Protokoll und seine Möglichkeiten siehe Abbildung 1.

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Protocol

Tierschutz Ausschüsse der Universität Freiburg und lokalen Behörden genehmigt alle Tierversuche (G12/13, G16/11) in das folgende Protokoll erwähnt.

1. Vorbereitungen

  1. Vorbereitungen für die CPCs Isolierung
    1. Richten Sie zeitgesteuerte Paarung um Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien Kortex (zwischen E11.5 und E14.5) zu erhalten. Verwenden Sie Mäuse des Stammes NMRI (Naval Medical Research Institute), die mindestens 8 Wochen alt sind. Betrachten Sie nach der Paarung einen positiven vaginalen Stecker am E0.5.
    2. Um genügend Material haben, verwenden Sie einen Wurf NMRI Mäuse für ein H3K79me2 ChIP von Cortex von E12.5 oder E14.5. Verwenden Sie für später embryonalen Phase einen Wurf für weitere ChIP-Analysen (durchschnittliche Wurfgröße NMRI: 10 Embryonen).
    3. PreCool Hank´s ausgewogen Salz-Lösung (HBSS) und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 4 ° C (langfristige Lagerung bei RT).
    4. Equilibrate 4 ° C gelagert Trypsin-EDTA (0,05 % w/V) auf 37 ° C.
    5. Vorbereiten kortikalen Zelle Medium (CCM): Ergänzen Sie das Medium für Neuronen (siehe Tabelle der Materialien) mit Endkonzentrationen Zuschlag von 2 % (V/V) B-27, 5 µg/mL Apo-Transferrin, 1 µg/mL Glutathion, 0,5 mM L-Glutamin, Superoxid-Dismutase 0,8 µg/mL und 1 % (V/V) Antibiotikum Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mischung. Bei 4 ° c lagern Für das Experiment equilibrate Mittel-bis 37 ° C.
    6. Auftauen von fetalen Kälberserum (FCS), aliquoten es (50 mL), und equilibrate eine aliquote auf 37 ° C (langfristige Lagerung bei-20 ° C).
    7. Zellkultur Bestände der DNAse-1 (10 mg/mL) in H2O vorbereiten. Speichern Sie Aliquote bei-20 ° C.
    8. Bei Bedarf lösen sich die spezifischen DOT1L Inhibitoren Fez-5676 oder SGC0946 in DMSO Lager Konzentration von 100 mM. Anwenden einer Ende-Konzentration von 1 bis 5 µM auf die Zellen am Tag 0 und erneut der Inhibitors alle zwei Tage.
    9. Für den CPC Anbau Mantel Kultur Zellplatten (6 Brunnen oder 12 gut) mit Poly-L-Ornithin Hydrobromide (1 mg/mL 150 mM Borsäure pH 8,4) für mindestens 1 h bei RT und danach mit Laminin (1 mg/mL) in CCM-Medium bei 37 ° C über Nacht.
  2. Vorbereitungen für CGNP Isolierung
    1. Organisieren Sie eine geeignete Paarung von Mäusen, P5-P7 Tiere für die Isolierung des Kleinhirns (3-5 Tiere pro ChIP und Zustand) zu generieren.
    2. Bereiten Sie HBSS/Glucose durch Zugabe von 6 mg/mL Glukose in HBSS Puffer.
    3. Vorbereiten der CGNP Zellkulturmedium (CGM) durch Zugabe von N2 Zuschlag von 1 % (V/V), 1 % (V/V) Penicillin-Streptomycin-Neomycin, 25 mM KCl und 10 % FCS, DMEM-F12. Für den CGNP Anbau bereiten CGM Medium ohne FCS inklusive 0,6 µg/mL sonic Hedgehog (SHH) (CGM-SHH) und auf 37 ° C bei Bedarf equilibrate.
    4. 6-Well Zellplatten Kultur mit 100 µg/mL Poly-D-Lysin für 1-2 h bei RT Glia-Zellen entfernen zu beschichten. Danach waschen Sie zweimal mit sterilen DdH2O und lassen Sie die Platten trocknen. Speichern Sie die Platten für maximal eine Woche bei 4 ° C.
    5. Für den Anbau von CGNPs Mantel 6-Well Kultur Zellplatten mit Poly-L-Ornithin (0,1 mg/mL) bei 4 ° C über Nacht. Danach waschen Sie zweimal mit H2O für die Zellkultur und lassen Sie die Platten trocken.
      Hinweis: Die Platten können für maximal eine Woche bei 4 ° c gelagert werden
    6. 0,025 % Trypsin (w/V) in HBSS/Glukose vorbereiten und auf 37 ° C bei Bedarf equilibrate.
  3. Vorbereitungen für ChIP von H3K79me2
    1. Bereiten Sie PFA (1 % mit PBS-Puffer, pH 8) frisch vor Vernetzung Chromatin. Zur Vorbereitung PFA 50 mL PBS in der Mikrowelle bis max. 65 ° c erhitzen Fügen Sie bei ständigem Rühren 0,5 mg PFA PBS hinzu. Fügen Sie dann 50 µL 10 M NaOH und warten Sie, bis PFA aufgelöst wird. Danach fügen Sie 42,5 µL HCl (37 % V/V) zu einem pH-Wert von 8. Überprüfen Sie den pH-Wert wieder und lassen Sie dann die 1 % PFA Lösung erreichen RT
    2. Bereiten Sie Bestände der RNase (1 mg/mL) und Proteinase K (20 µg/µL) separat in sterilen DdH2O. speichern die Aliquote bei-20 ° C.
    3. Bereiten Sie die folgenden Puffer und Reagenzien: PBS mit 0,02 % Tween, Lysis Puffer, Glycin, Verdünnungspuffer, ChIP-TE-Puffer, Puffer 1, ChIP Puffer 2 und ChIP Puffer 3 und bei 4 ° c lagern Vorbereiten der Elution Buffer frisch jedes Mal.
      1. Bereiten Sie PBS mit 0,02 % Tween. Bei den meisten eine Woche bei 4 ° C.
      2. Bereiten Sie Lyse-Puffer mit 50 mM Tris, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) und 1 x Protease-Inhibitor vor.
      3. 2,5 M Glycin vorzubereiten.
      4. Bereiten Sie Verdünnungspuffer mit 20 mM Tris bei pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (V/V) Triton x-100, 0,25 % (w/V) SDS und 1 x Protease-Inhibitor.
      5. ChIP-Puffer 1 mit 20 mM Tris bei pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (V/V) Triton x-100 und 0,2 % (w/V) SDS vorbereiten.
      6. ChIP-Puffer 2 mit 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (V/V) Triton x-100 und 0,2 % (w/V) SDS vorbereiten.
      7. ChIP-Puffer 3 mit 20 mM Tris pH 8.0, 250 mM LiCI, 2 mM EDTA, 1 % (V/V) NP-40 und 1 % (w/V) SDS vorbereiten.
      8. Bereiten Sie TE-Puffer mit 20 mM Tris pH 8.0 und 2 mM EDTA vor.
      9. Bereiten Sie frische Elution Puffer mit 1 % (w/V) SDS, 100 mM Nahco33.

(2) neurale Vorläuferzellen Isolation von Hirngewebe

  1. Isolation und optionalen Anbau des CPCs
    1. Einschläfern trächtige Tiere durch zervikale Dislokation und transfer der Embryonen zum eiskalten HBSS.
    2. Den Schädel mit einer Schere und isolieren Sie das Gehirn zu, dann entfernen Sie der Hirnhäute, ggf. mit kleinen Zangen und isolieren Cortex (ganz, DT oder VT) beider Gehirnhälften durch alle anderen Gehirn-Teile im binokularen Rahmen mit kleinen Pinzette entfernen und, wenn notwendig, kleine Schere. Speichern Sie die isolierten Cortex in 5 mL HBSS Puffer bei 4 ° C in einer 15 mL Tube.
    3. Zentrifugieren Sie das isolierte Gehirn Material für 5 min bei 1000 x g und 4 ° C.
    4. Waschen Sie die Rinde mit 5 mL eiskaltes HBSS und homogenisieren sie mit einer Pipettenspitze 1 mL durch Pipettieren rauf und runter. Falls nötig, schneiden Sie die Spitze der Pipettenspitze.
    5. Zentrifugieren der homogenisierten Probe für 5 min bei 1000 x g und 4 ° C. Entfernen Sie die HBSS.
    6. 3 mL Trypsin und inkubieren die Probe für 5 min bei 37 ° c
    7. Fügen Sie 1 mL FCS, 5 mL CCM und 30 µL DNase 1 zur Probe und homogenisieren der Probe mit einer 5-mL-Glas-Pipette durch Pipettieren vorsichtig rauf und runter.
    8. Zentrifugieren Sie die isolierten Zellen für 5 min bei 1000 x g und 4 ° C. Verwerfen Sie überstand, geben Sie 5 mL CCM und homogenisieren Sie die Probe wieder zu.
    9. Ein Aliquot der Probe verdünnen und mit einem Neubauer zählen-Kammer zählen. Eine durchschnittliche Höhe von 4.5 x 106 Zellen pro Embryo wird erwartet. Anbau von isolierten CPCs fahren Sie fort mit Schritt 2.1.10. Für ChIP sofort mit Schritt 3 fortfahren.
    10. Für den Anbau Platte die CPCs auf Poly-L-Ornithin (0,1 mg/mL) und Laminin (1 mg/mL) beschichtet Gerichte bei einer Dichte von 8 x 104 und 2,5 x 105 Zellen/cm2 CCM Mittel- und inkubieren sie bei 37 ° C, 5 % CO2und 100 % Relative Luftfeuchtigkeit.
    11. Da die CPCs beginnen, in Neuronen in der Zellkultur (nach ca. 4 Tagen) zu unterscheiden, betrachten Sie die Dissektion Datum als Tag in-vitro- 0 (Tag 0). Für längere Laufzeiten des Anbaus ändern Sie die Hälfte des Mediums jeden vierten Tag mit frischen CCM Medium.
    12. Anwenden von 1-5 µM SGC0946 oder EPZ5676 am Tag 0 (4-5 h nach Zelle isoliert) in DMSO gelöst und aktualisieren es jeden zweiten Tag. Verwenden Sie DMSO als eine Kontrolle der Behandlung. Testen Sie die Effizienz der Inhibitor Behandlung per standard Immunoblot Methoden, falls erforderlich.
  2. Isolation und optionalen Anbau von CGNPs
    1. Einschläfern Sie P5-7 Tiere durch Enthauptung mit einer Schere. Die Kopfhaut, öffnen Sie den Schädel zu und entfernen Sie das Gehirn mit kleiner Schere und Zange. Das Kleinhirn zu isolieren und überträgt es auf eiskalte HBSS/Glukose. Entfernen Sie alle Hirnhäute und Blutgefäße und übertragen Sie die Cerebella in 15 mL Röhrchen gefüllt mit kaltem HBSS/Glucose zu.
    2. Waschen der Cerebella dreimal mit 10 mL eiskalte HBSS/Glucose (sammeln sie durch Zentrifugation bei 650 X g für 5 min bei 4 ° C) und homogenisieren Cerebella anschließend durch sanft nach oben und unten mit einer 1-mL-Pipette Pipettieren (maximal 2-3 Mal) zu 0,5-1 mm3 Fragmente.
    3. Fügen Sie 5 mL von 0,025 % Trypsin in HBSS/Glucose und inkubieren Sie das Gewebe unter ständigem Rühren im Wasserbad 37 ° C für 15 min. Stop die Verdauung durch Zugabe von 5 mL CGM und sammeln Sie das Gewebe durch Zentrifugation bei 650 X g für 5 min bei 4 ° C.
    4. Den Überstand zu entfernen und das Gewebe mit einer 1 mL Pipettieren Spitze in 1 mL CGM genannte und überträgt es auf eine neue 15 mL Tube.
      Hinweis: Es ist wichtig, um Luftblasen zu vermeiden.
      1. Geben Sie 5 mL CGM und inkubieren Sie die Mischung für 2 min auf Eis Gewebe Reste zu begleichen. Übertragen Sie den Überstand in eine neue 15 mL Tube. Das verbleibende Gewebe 2 mL CGM hinzu, und wiederholen Sie den Vorgang der Verreibung.
    5. Die Überstände (ohne Gewebe Reste, insgesamt ca. 10 mL) zu bündeln und Zentrifugieren bei 650 X g für 5 min bei 4 ° C, die zerebelläre Zellen zu sammeln. Das Pellet in 10 mL CGM aufzuwirbeln.
    6. Da Astrozyten schneller und stärker Poly-D-Lysin als CGNPs anhaften, Platte die Zellen auf 100 µg/mL Poly-D-Lysin beschichteten 6-Well-Platten (bis zu 4 mL pro Well) und inkubieren Sie für 20 min bei 37 ° C, die Astrozyten zu entfernen.
    7. Schütteln Sie die Platte und sammeln Sie den Überstand zu. Dann bei 650 X g für 5 min bei 4 ° C in einem 15 mL Röhrchen zentrifugieren. Aufschwemmen Sie das Pellet in 10 mL CGM und zählen Sie die Zellen mit einem Neubauer Kammer zählen.
      Hinweis: CGNPs sind rund, klein und zeigen einen Heiligenschein wenn mit Phasenkontrastmikroskopie.
    8. Wenn erforderlich, Samen der Zellen bei 37 ° C vorgewärmt CGM auf Poly-L-Ornithin-beschichtete Platten (3 x 106 Zellen pro 6-Well) und inkubieren sie bei 37 ° C, 5 % CO2 und 100 % relativer Luftfeuchte.
      Hinweis: Erfolgt die Aussaat nicht, weiter Schritt 3.1.
      1. Tauschen Sie nach 6 bis 12 h Mittel-und CGM-SHH. Die isolierte CGNPs 6 h zu behandeln (oder beim Wechsel auf CGM-SHH) nach Isolierung mit DOT1L-Inhibitor und DMSO kontrollieren und erneuern sie jeden zweiten Tag (Vergleiche mit 2.1.12). Die Effizienz der Inhibitor Behandlung per standard Immunoblot Methoden zu testen, falls erforderlich. ChIP fahren Sie fort mit Schritt 3.3.
        Hinweis: CGM verlassen, auf den Platten (und mit diesem FBS) Differenzierung von der CGNPs in zerebelläre granulare Neuronen (CGNs) führt.

(3) Fixierung der Zellen und Scheren von Chromatin

Hinweis: Führen Sie Schritte 3.1 und 3.2, wenn Zellen nicht kultiviert werden, wenn sie sind, fahren Sie mit Schritt 3.3.

  1. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation für 4 min bei 1.000 x g und 1,3 mL PBS. Übertragen Sie die Probe auf eine 1,5 mL-Tube. Zentrifuge für 4 min bei 1.000 x g bei 4° C. Waschen Sie die Stichprobe zweimal mit 1,3 mL PBS.
  2. Entscheidender Schritt: Fügen Sie 350 µL 1 % PFA zur Probe und 5 min bei 22 ° c inkubieren Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 18,4 µL Glycin und 1 mL PBS hinzu. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 1000 X g bei 4 ° C.
    1. Waschen Sie die Stichprobe zweimal mit eiskaltem PBS. Sammeln Sie die festen Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1000 X g und 4 ° C. Von nun an halten Sie die Proben auf Eis.
      Hinweis: Die Fixierzeit muss genau 5 min optimale Ergebnisse zu erzielen. Andere Zelle Zahlen können Zeit Anpassungen erfordern.
  3. Entscheidender Schritt: Kultivierten CGNPs (oder CPCs), fügen Sie bis zu 1 mL 1 % PFA direkt in die Zelle Kultur Platte Vertiefungen. Fügen Sie nach einer 5 min Inkubation bei 22 ° C einen entsprechenden Betrag von Glycin und PBS und ernten Sie die Zellen mit einer Zelle-Spachtel.
    1. Übertragen Sie die Zellen in 1,5 mL Tuben und Zentrifugieren der Probe für 5 min bei 1000 x g und 4 ° C. Waschen Sie die Stichprobe zweimal mit eiskaltem PBS. Sammeln Sie die festen Zellen durch Zentrifugation für 5 Minat 1.000 x g bei 4 ° c Von nun an halten Sie die Proben auf Eis.
  4. Entscheidender Schritt: Fügen Sie 700 µL Lyse Puffer (+ Protease-Hemmer) und inkubieren die Probe für 15 min bei 4 ° c Wirbel der Probe alle 5 min. Scheren das Chromatin der lysierten Zellen 3 x 10 min in der Sonikator (30 s-Pulse, 30 s Pause) bei maximaler Leistung.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Lautstärke nicht mehr 350 µL pro Röhre als. Wirbel die Proben alle 10 min. überprüfen lysate verbleibenden Kerne mit dem Phasenkontrast-Mikroskop.
      Hinweis: Es ist wichtig, um optimale Schur Ergebnisse (Vergleiche Abbildung 1 b) für die spätere Analyse. Optimieren Sie bei der Verwendung von anderen Methods für das Chromatin Scheren die Scheren, Chromatin Fragmente Größen zwischen 200-500 bp.
  5. Pellet-Zelle Reste für 13.000 x g, 10 min, 4 ° C. Den Überstand für den preclearing Schritt 5.2 zu verwenden. Eingefroren Sie die Probe bei-20 ° C für eine spätere Verwendung.

4. Vorbereitung der Perlen und Preclearing

  1. Waschen Sie 45 µL Protein A magnetische Beads/ChIP und 20 µL magnetischen Perlen/Probe mit 1 mL eiskaltem PBS mit 0,02 % Tween dreimal mit einem Magnetstativ. Fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS zu den Perlen.
  2. Fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS 45 µL Perlen/ChIP hinzu, und 3 µg Antikörper/ChIP (H3K79me2 oder Kaninchen IgG). Inkubieren Sie die Proben für 2 h bei 4 ° C auf ein Rotator die Antikörper binden an die Perlen. Verwenden Sie abhängig von der Antikörper ~ 3 µg Antikörper/ChIP.
  3. Die Antikörper-Bindung-Perlen dreimal waschen, mit 1 mL eiskaltem PBS mit 0,02 % Tween. Die gewaschenen Antikörper-gekoppelt-Perlen fügen Sie der entsprechenden Perle Band (ab Volumen der magnetischen Beads verwendet hinzu) von eiskaltem PBS.
  4. Die Probe für die preclearing (Gesamtvolumen 1.320 µL) 600 µL Verdünnungspuffer und 20 µL der gewaschenen magnetische Beads hinzu und 2 h bei 4 ° C auf ein Rotator inkubieren. Entfernen Sie die Perlen mit einem Magnetstativ. Nehmen Sie 5 % (33 µL) von Lysaten als Eingabe Proben und frieren sie bei-20 ° C.

(5) Chromatin Immunopräzipitation

  1. Teilen Sie den precleared Extrakt in zwei Röhren (ca. 643.5 µL), fügen Sie die gleiche Menge an Verdünnungspuffer und Antikörper-Bindung-Perlen (45 µL/Probe; H3K79me2 oder Kaninchen IgG). Inkubieren Sie die Proben bei 4 ° C über Nacht auf ein Rotator.
  2. Waschen Sie die Perlen mit eiskalten ChIP Puffer 1 ChIP Puffer 2 und ChIP Puffer 3 für 10 min bei 4 ° C auf ein Rotator. Waschen Sie danach dreimal mit TE-Puffer für 5 min bei 4 ° C auf ein Rotator.
  3. Eluieren Sie die Perlen mit Elution Puffer für 1 h bei 1.400 u/min in einem Shaker bei Raumtemperatur.
  4. Den Eingang Proben 10 µg RNase (1 mg/mL) pro ChIP Probe und 5 µg hinzugefügt und inkubieren Sie die Proben für 30 min bei 37 ° C (1.400 u/min).
  5. Hinzufügen von 100 µg Proteinase K (20 µg/µL) pro ChIP Probe und 50 µg pro Eingang und über Nacht bei 65 ° C bei 1.400 u/min inkubieren.

6. Reinigung der ChIP Proben

  1. Der ChIP und Eingabesamples mit einem DNA-Reinigung reinigen kit (siehe Tabelle der Materialien) entsprechend der Bedienungsanleitung. Mehr Reinigung Spalten zu verwenden, wenn mehr als 5 µg DNA erwartet wird. Eluieren Sie Probe mit 2 x 15 µL des Puffers DNA Elution im Kit enthalten.
  2. Quantifizierung der Proben (mit 1 µL) mithilfe einer Visualisierung Fluorophor und eine Fluorospectrometer ausführen (siehe Tabelle der Materialien).

7. Analyse der ChIP Proben über qPCR

  1. Rufen Sie für besser gekleideteres Design für qPCR Analyse Genomsequenzen von Interesse aus der Integrative Genomics Viewer (IGV) Browser34 ab. Primer auf die transkriptionelle Startsite (TSS) eines Gens zu entwerfen, da H3K79me2 angesiedelt werden dürfte. Als Kontrolle, betrachten nicht-kodierenden genomische Regionen oder Regionen etwa 10 Kb stromaufwärts der TSS oder 10 Kb flussabwärts vom transkriptionelle Ende Website (TES).
    1. Die Primer mit https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ mit einer Größe zwischen 70 und 200 bp zu generieren und eine optimale Temperatur von 60 ° c voreingestellt Verwenden Sie für Testzwecke Primer für die genomischen Regionen Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, und Npm1 in Tabelle 1aufgeführten.
  2. Testen Sie neu gestaltete Primer mit dem folgenden qPCR-Programm, master-Mix und ein Glühen Temperaturgefälle zwischen 58 ° C und 63 ° C zu, und wählen Sie die Anlasstemperatur mit dem höchsten Produkt Quantität und Qualität.
    1. Gelten Sie DNA-Gelelektrophorese die erwartete Produkt Größe. Für qPCR Analyse verwenden ein System zur Erkennung von Real-Time PCR (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Bereiten Sie den master-Mix mit 10 µL DNA-Polymerase-master-Mix, 0,5 µL Grundierung nach vorne (10 µM), 0,5 µL Grundierung reverse (10 µM), 4 µL Nuklease-freies Wasser und 5 µL DNA (1 ng/µL).
    3. Verwenden Sie eine 2-stufige qPCR-Programm wie folgt: 5 min bei 95 ° C, 50 X (30 s bei 95 ° C, 30 s bei 58 ° C - 63 ° C), und Denaturierung Gefälle ständig bei 4 ° C.
  3. Erstellen Sie einer Verdünnungsreihe von genomischen, geschoren, gereinigte DNA-Proben (2 ng/µL, 1 ng/µL 0,5 ng/µL, 0.25 ng/µL und 0,125 ng/µL) und 5 µL für eine Effizienz-Test mit qPCR. Die Neigung der Standardkurve bestimmen und die Grundierung Effizienz nach folgender Formel zu berechnen:
    Wirkungsgrad (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Primer mit Wirkungsgraden zwischen 90 % und 105 % im Idealfall oder verwenden zumindest mit einem Wirkungsgrad von 85 bis 115 %.
  4. Um den ChIP und Eingabesamples zu analysieren, gelten 0,1-1 ng DNA-ChIP-gemischt mit jeweiligen vorwärts- und rückwärts-Primer, Nuklease-freies Wasser und DNA-Polymerase Master mix in einem Endvolumen von 20 µL für jede qPCR-Reaktion.
  5. Bestimmen Sie die Schwellenwerte Zyklus (C-t) von ChIP und Eingabesamples und normalisieren Sie die Probe Ct Ct -Werte der Eingabe an Enrichment (% Eingang) mit folgender Formel berechnen. Verwendung Ct Werte aus IgG-Steuerelements, um die Hintergrund-Ebene zu bestimmen.
    % Eingabe = 100-2^(Norm. Eingabe − Norm. -ChIP)
    Norm. Eingabe = Ct (Eingang) − Log2(Verdünnungsfaktor)
    Norm. ChIP = Ct (ChIP) − Log2(Verdünnungsfaktor)
    Hinweis: Norm. = normalisierte

8. Analyse der ChIP Proben durch Sequenzierung

  1. Übertragen Sie die ChIP-Proben (ein- und Immunoprecipitated DNA-Probe) auf eine Sequenzierung-Anlage.
  2. Zur Vorbereitung einer Bibliothek im Voraus Nutzung eine entsprechende Bibliothek Vorbereitung kit (siehe Tabelle der Materialien) und konvertieren 2 ng der Eingabe DNA und alles, was der Immunoprecipitated DNA in indizierten Bibliotheken für nächste Generation multiplex-Sequenzierung auf der angegebenen Plattform (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Entscheidender Schritt: Folgen Sie den Anweisungen Kit verbinden Sie Sequenzierung Adapter (mit einer Arbeit Konzentration von 15 µM) repariert und dA-angebundene DNA-Fragmente zu beenden. Für Sequenzierung Adapter und PCR verwenden Primer geeignete Oligos (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie für diese Menge an Eingaben DNA 6-9 PCR-Zyklen, um Adapter ligiert DNA-Fragmente zu bereichern.
    Hinweis: Normalerweise ist es nicht notwendig, eine Größenauswahl der Adapter ligiert DNA durchzuführen. Es empfiehlt sich, möglichst wenige PCR-Zyklen wie möglich, da viele PCR Duplikate PCR Verstärkung Zyklen führen und einen hohen GC-Bias zu verwenden.
  4. Für eine endgültige Bibliothek überprüfen, nehmen Sie 0,5 µL der gesamten Reaktion für Analyse, Größenverteilung auf ein entsprechendes Gerät zu visualisieren (siehe Tabelle der Materialien). Zur Quantifizierung verwenden Sie einen Visualisierung Farbstoff in Kombination mit einem Fluorospectrometer oder anderen Methoden (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Da H3K79me2 eine Histon-Modifikation, die im großen und ganzen über größere genomische Regionen verteilt ist scheint, Reihenfolge der Proben gepaart-Ende mit einer lesen Sie Länge von 50 bp und Sequenzierung Bautiefe 75 Mio mal gelesen.
  6. Die ChIP-Seq-Daten mit dem Galaxy/Uni Freiburg Server (galaxy.uni-freiburg.de) analysieren.
  7. Durchführen Sie Qualitätskontrolle mit erhaltenen ChIPseq mit FastQC und gegebenenfalls ordnen Sie diese direkt mit Bowtie2 Version 2.2.035 mit oder ohne trimmen. Als Referenz Genom Assembly verwenden mm9 oder die neueste Version mm10; und als Referenz Annotation Ensembl FTP veröffentlichen 79.
  8. Optional: Entfernen Sie lesen Duplikaten mit Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) vor dem Gipfel-Aufruf.
  9. Rufen Sie Gipfeln mit MACS2 Version 2.1.036 mit der 'Breite' Option für H3K79me2.
  10. Verhältnis der beiden Proben verwenden um ein Log2 Verhältnis zwischen ChIP und Eingabesample, Log2 die Anzahl der Lesevorgänge des lautet zu erhalten BamCoverage und BamCompare.
  11. Gelten Sie für alle anderen ChIP-Seq spezifische Tiefenanalyse deepTools2 Version 2.3.5 oder 2.4.137, d. h. , Abdeckung Trackdateien (BamCoverage für den ChIP nur, BamCompare für den Vergleich des Chips an den Eingang) zu generieren, um den ChIP zu schätzen Leistung verwenden PlotFingerprint und erzeugen ein allgemeiner Überblick über ComputeMatrix, PlotHeatmap. Wählen Sie K-Mittelwert Clusterbildung während des ComputeMatrix-Prozesses zur cluster-genomischer Regionen entsprechend der H3K79me2 Verteilung.
  12. Nutzung veröffentlichten ChIP-Seq-Daten als H3K79me2 der E14.5 DT hinterlegt bei NCBI für Testzwecke (Accession Number: SRP057733).

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Representative Results

Allgemeine Systematik der neuronalen Vorläuferzellen Isolation, Anbau, H3K79me2 ChIP und ChIP-Analyse-Methoden: Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm H3K79me2 ChIP der kortikalen Vorläuferzellen zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung des embryonalen Gehirns oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter in postnatale Phasen durchführen. Als ersten Schritt das Gehirn isoliert werden und das Telencephalon (zwischen E11.5 und E14.5) oder das Kleinhirn (P5-P7) abgerufen werden. Es ist möglich, die verschiedenen Regionen das Telencephalon zu analysieren, indem man es in DT und VT Danach wird das Gewebe homogenisiert werden und der neuronalen Vorläuferzellen getrennt. Jetzt ist es möglich die Vorläuferzellen Kultur und behandeln sie mit DOT1L-Hemmer. Eine weitere Möglichkeit ist die Stammväter direkt zu beheben und das ChIP-Verfahren zu unterziehen. ChIP das Chromatin in Fragmente von 200-500 bp geschoren und anschließend mit Magnet-Perlen-gekoppelten Antikörper gegen H3K79me2 inkubiert. Nach dem Waschen der Perlen und Abrufen der DNS, kann die ausgefällte DNA Sequenzierung oder qPCR (Abbildung 1A) analysiert werden. Es ist wichtig, eine gute Größenverteilung der Chromatin-Fragmente nach dem Scheren, zu haben, so ist es ratsam, die Fragmentgröße mit DNA Gelelektrophorese oder mit anderen Methoden (Beispiele in der Abbildung 1 b) zu überprüfen. Bei der Auswahl genomweite Sequenzierung ChIP-Seq-Lesevorgänge für H3K79me2 Personen als Fastq-Datei zur weiteren Analyse (Abbildung 1) erfolgt. Die Qualität der Sequenzierung liest Bedürfnisse durch Anwendung des FastQC zu beurteilen und gegebenenfalls die Fastq-Dateien können getrimmt werden mit TrimGalore. Zuordnung zu Mus Musculus Genom mm9 oder mm10 kann durchgeführt mit Bowtie2 und über PlotFingerprint gesteuert werden. Es ist ratsam, Duplikate mit MarkDuplicates und liest von BamCoverage zu normalisieren und den ChIP an der Eingabesamples mit BamCompare zu vergleichen. Der ChIP-Seq liest kann anschließend visualisierten Genom breite Heatmaps oder gene-wise in Integrative Genomics Viewer (IGV) Browser-Sitzungen.

CPC Kultur und DOT1L Hemmung: CPCs wurden isoliert und an Tag 0 und Tag 2 mit 5 µM DOT1L Inhibitor SGC0946 behandelt. Die Lösungsmittel DMSO diente als Kontrolle. Am 3. Tag CPCs wurden geerntet, die Proteine wurden isoliert, quantifiziert und analysiert über Immunoblot (Abbildung 2A). Abbildung 2A zeigt, dass H3K79me2 Ebenen nach drei Tagen Kultivierung CPC und DOT1L Hemmung gewährleisten einen wirksamen Inhibitor Behandlungsschema effektiv verringert werden. Die Protein-Menge von H3, GAPDH oder Tubulin-Alpha als Steuerelemente laden war dadurch nicht beeinträchtigt. Immunostaining festen CPCs mit Antikörpern gegen aktive Caspase 3 (CASP3 +) zur Detektion von Apoptose und HuC/D zur Visualisierung von neuronaler Zellen angegeben, dass die Behandlung des CPCs mit DOT1L Inhibitor führte zu verstärkten Zelltod nach drei Tagen in der Kultur, wie gezeigt in Abbildung 2 b. Quantifizierung der Zellen die CASP3 + / DAPI + oder HuC/D + / DAPI + innerhalb der CPC-Kultur zeigte eine deutliche Steigerung der CASP3 + Zellen enthüllt programmierten Zelltod bei der DOT1L Hemmung. Die Zahl der HuC/D-positiven Neuronen, blieb jedoch unverändert (Abbildung 2).

H3K79me2 ChIP-qPCR Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, und Npm1 von CPCs mit DOT1L-Inhibitor behandelt: zu testen, ob die SGC0946-Hemmer-Behandlung von DOT1L effizient und führte zu einer Verringerung des H3K79me2 zu bestimmten Gene, führten wir eine ChIP-Analyse, gefolgt von qPCR CPC für 3 Tage behandelt. Kaninchen-IgG diente als ein ChIP-Steuerung. Denn es ist bekannt, dass die endoplasmatischen Stress-responsive Gene Aft4, Ddit3, Scd1, und Aft3 sowie bei den Nukleartransporten gen Npm133,38H3K79me2 befindet, haben wir qPCR-Primer für das TSS TES und der genomischen Regionen innerhalb der gen-Gremien um Unterschiede in der Verteilung der H3K79me2 nach DOT1L Hemmung (Abbildung 3A) zu bestimmen. Gene mit hoher H3K79me2 Abnahme wie Atf4, Ddit3, und Npm1 reaktionsschnellste der Inhibitor Behandlung waren, so dass drei Tage der Hemmung der DOT1L zu einer signifikanten führte in erster Linie der H3K79me2. Gene mit einer niedrigeren H3K79me2 Abdeckung, wie Atf3 und Scd1, zeigte keine signifikante Veränderung in H3K79me2 Ebenen.

Übersicht der H3K79me2 ChIP-Seq-Analyse: Genomweite Analyse der H3K79me2 Ebenen in CPCs von E14.5, durchgeführt und analysiert nach der vorgestellten Systeme und Protokolle (Abbildung 1), ergab eine sehr hohe Qualität ChIP. Während der gebinnten zählt, sortiert nach ihrer Häufigkeit der Eingabe lautet in der Fingerabdruck-Blot (Abb. 4A), gleichmäßig verteilt waren, zeigten die H3K79me2 Grafen Bereicherung in bestimmten Regionen (Lagerplätze auf Platz 1), die erfolgreiche anzeigt Ansammlung von Chromatin-Fragmente in H3K79 geändert. Eine Heatmap H3K79me2 entlang Gene zwischen ihre TSS und ihre TES und + /-10Kb vor- oder nachgelagerten zeigt (Abbildung 4 b), H3K79me2-Gipfel rund um das TSS und verringerte sich gegenüber dem TES im Allgemeinen. Es gibt Gene, die vollständig mit H3K79me2 bedeckt sind, und Gene, die eine Spitze nur innerhalb der TSS-Region haben. Endoplasmatischen Stress assoziierte Gene wie Atf4, Ddit3, und dem Nucleophosmin Npm1 Hafen, zum Beispiel eine H3K79me2 hohe an der TSS, die entlang der gesamten gen Körper (Abbildung 4) nur geringfügig verringert wird. Im Gegensatz dazu hat Scd1 einen geringen Auslastung der H3K79me2 an der TSS und keine H3K79me2 innerhalb des Körpers des gen. Atf3 als ein letztes Beispiel hat verschiedene scharfe und niedrige H3K79me2 Pegelspitzen gen Körper entlang.

Figure 1
Abbildung 1: Schema der H3K79me2 ChIP-Protokoll von isolierten CPCs oder CGNPs und Flussdiagramm der Sequenzierung Analyse. (A) Übersicht der vorgestellten Protokoll. Für CPC-Isolierung erste E14.5 Gehirne werden isoliert und die Rinde können in DT und VT, unterteilt werden, wenn nötig. Für CGNPs Cerebelli von P5-P7 Mäusen abgerufen werden müssen. Die Gewebe werden homogenisiert, Stammväter getrennt, und dann die Zellen kultiviert und mit geeigneter Inhibitor behandelt oder direkt für ChIP verwendet werden können. Für ChIP Fixierung des Chromatins Scheren und Immunopräzipitation mit einer Anti-H3K79me2-Antikörper und Kaninchen IgG als Kontrolle folgt. Nach der Reinigung von DNA ChIP Proben über Bibliothek-Vorbereitung und Sequenzierung analysiert werden können oder über qPCR analysiert werden können. (B) Beispiele für angemessene und unangemessene Qualität Chromatin. Die DNA-Fragment Verteilung zeigt bp. (C) ChIP-Seq-Ergebnisse können eine Analyse Pipeline auf dem Freiburg/Galaxy Server unterworfen werden. Nach einer Qualitätskontrolle (FastQC) können liest werden mit TrimGalore und dann über Bowtie2 auf das Maus-Genom (in den dargestellten Fällen mm9) abgebildet. PlotFingerprint bewertet die Qualität des Chips. Spitzen für H3K79me2 definieren, können MACSpeaks angewendet werden. Für die Normalisierung BamCoverage und zum Vergleich mit der Eingabe BamCompare sind verwendbar. Zur Visualisierung der Ergebnisse IGV sind Browser und Heatmaps geeignet. Erwarteten Dateiformate sind kursiv gesetzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: kortikale Stammvater Kultur und Hemmung der DOT1L. (A) Immunoblots zeigen H3K79me2 Ebenen im CPC an E14.5 nach DOT1L Hemmung für 3 Tage (Tag 3, n = 3 / 11) im Vergleich zur Kontrolle von DMSO. H3, GAPDH und Tubulin Alpha dienten als Steuerelemente laden. (B) Immunocytological Färbung einer CPC-Kultur am Tag 2 und 3. Aktiviert Caspase-3 (CASP3 grün)-positiven Zellen und Nervenzellen (HuC/D: rot) waren voller Flecken. DAPI (blau) wurde verwendet, um die Zellkerne zu visualisieren. Maßstab: 100 µm. (C) Quantifizierung der Immunostainings in (B) dargestellt. Das Verhältnis von positiven Zellen für CASP3 + / DAPI + oder HuC/D + / DAPI + in Prozent angegeben. Für statistische Analysen wurden ungepaarten Student t-Tests durchgeführt. p < 0,01 **. Diese Zahl wurde von Roidl Et Al. modifiziert. 33 , 38 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: H3K79me2 ChIP-qPCR Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1, und Npm1 von CPCs mit DOT1L-Hemmer behandelt. (A) E14.5 abgeleitet CPCs wurden behandelt mit 5 µM DOT1L Inhibitor 4-5 h nach Isolierung und ein zweites Mal am 2. Tag in Kultur. CPCs wurden am 3. Tag, gefolgt von Chromatin-Extraktion, ChIP Experiment und qPCR behoben. Ergebnisse werden als der Mittelwert (+ /-SEM) % Eingang dargestellt (n = 3). IgG diente als Negativkontrolle. Der Mittelwert der IgG-Ebene wird als gestrichelte Linie dargestellt. Für die statistische Analyse wurde zwei-Wege-ANOVA angewendet. p < 005 *; p < 0,01 **, p < 0,001 ***; TSS transkriptionelle Startsite, TES transkriptionelle Ende Website. Diese Zahl wurde von Roidl Et Al. modifiziert. 33 , 38 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Überblick über H3K79me2 ChIP-Seq Analyse. (A) Fingerabdruck des H3K79me2 ChIP-Seq aus E14.5 stammenden CPCs im Vergleich zur Eingabe zeigt eine Bereicherung von DNA-Fragmenten für H3K79me2 gewährleisten eine hohe Qualität der ChIP-Seq. (B) H3K79me2 ChIP-Seq-Ergebnisse in einer Heatmap gezeichnet. Stark bereicherte genomische Regionen sind in blau dargestellt. Skalierung 0 (dunkelrot) - 45 (dunkelblau). H3K79me2 Gipfel in der Nähe der TSS und sinkt in Richtung 3´ um TES. (C) H3K79me2 ChIP-Seq liest wurden auf mm9 Genom abgebildet und mit dem integrativen Genom-Viewer (IGV) visualisiert. Die H3K79me2-Belegung eines Gens wird als log2 Anzahl der Lesevorgänge Verhältnis zwischen ChIP und Eingabe Lesevorgänge pro Kilobase pro million (Scaling: 09:50). RefSeq Genstruktur wird dargestellt, während ein rotes Kästchen der erste Exon einschließlich der TSS angibt. Die Gene Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, und Npm1 werden angezeigt. Zum Vergleich: wird ein H3K4me3 Signal von der gleichen genomic Region angezeigt. TSS transkriptionelle Startsite, TES transkriptionelle Ende Website. Diese Zahl wurde von Roidl38geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Gen Region Grundierung vorwärts 5' - 3' Reverse Primer 5' - 3'
Aft4 TSS GGACGATCTCTAACGCCACA GCCCTAAACCCGCCCTTTAT
Aft4 TSS + 1500 CTCCCGAATATGACATGAACCG TCCATTCGAAACAGAGCATCG
Aft4 TES CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC AAAGAATGACACTGAAAACCCACA
Ddit3 TSS GTACTGGCTCCGTCTAACCC CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA
Ddit3 TSS + 2500 TCAAGCAGCCGGTCTCATAG CTCAGATCCCCCAATGGCTT
Ddit3 TSS + 4500 GAGCTGGAAGCCTGGTATGA TCACCTCTTCGTTTCCTGGG
Ddit3 TES CACCAAGCATGAACAGTGGG GTACCGTCTATGTGCAAGCC
Aft3 TSS AACTGAGAGCGCAACTCCTC GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA
Aft3 TES CTGTTGGCACAAAGTGGCTC GGGATCTGCCATGGTGGAAA
Scd1 TSS TAGTGACCACACACAAAAGCTC CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC
Npm1 TSS TCCCCCTCCAGTCAGTTACC CGTCCTTTCCTTGGCGTGA
Npm1 TES AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT
TSS: Transcriptional Startsite
TES: Transcriptional Ende Website

Tabelle 1: Liste der Zündkapseln für ChIP-qPCR verwendet.

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Discussion

Es gibt zwei große Möglichkeiten, um führen Sie Chromatin Immunopräzipitation um die genomische Belegung der Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren, Histon-Code-Leser, Autoren oder Radiergummis zu erkennen. Eine ist die native ChIP-Methode mit Nuklease verdaut, native Chromatin für Immunopräzipitation, und die andere ist die vorgestellte Methode mit PFA-repariert, abscherend Chromatin, in dem die Nukleosomen und andere DNA-attached Proteine kovalent an die DNA gebunden sind 39. native ChIP mit seiner hohen Antikörper-Erkennungsrate sollten für Histon-Methylierung seit dem Chromatin gültig sein und Histon Methylations sind relativ stabil in den ChIP. Aber da eine große Menge an Ausgangsmaterial benötigt wird, ist nicht anwendbar für das Studium der kortikalen oder zerebelläre Entwicklung, wo die Anzahl der Zellen von Mäusegehirnen ist in der Regel begrenzt. Obwohl Antikörper gegen nicht feste Material in der Regel ausgelöst werden, konnten wir beweisen, dass der Antikörper speziell H3K79me2 seit spezifischen Hemmung des DOT1L führt zu einer verringerten H3K79me2 Signal bei ChIP-qPCR Analyse und Immunoblots (Abbildung 2A erkennt und Abbildung 3A). ChIP mit vernetzten Material möglicherweise ineffizient, aber die vorgestellte Protokoll sorgt für genug speziell angereicherte Material für qPCR und Sequenzierung Analyse.

Für einen effektiven ChIP kann die SDS-Konzentration des Puffers Lyse entscheidend sein, da SDS Proteine denaturiert und sie für die Antikörperbindung zugänglich macht. Diese Funktion ist besonders wichtig für H3K79me2, eine Histon-Modifikation befindet sich innerhalb der globulären Domäne von Histon 3 und das Nukleosom Kern von Chromatin der kleinsten Einheit22. Daher ist für H3K79me2, eine höhere SDS-Konzentration (ca. 0,3 % w/V) während des Tests erforderlich, um optimale Antigene Zugänglichkeit zu gewährleisten. Mit dieser Konzentration SDS konnten wir H3K79me2 hoch über IgG Kontrollen (Abbildung 3) und Eingabe (Abbildung 4) bereichern. So die Qualität des ChIP-Materials für die Sequenzierung war angemessen und die Anreicherung über Eingabe des H3K4me3 vergleichbar (Abbildung 4). Wir erwarten, dass die gleiche Konzentration der SDS für ChIP H3K79 Mono oder Trimethylation Marke gebraucht werden würde. Im Allgemeinen, je strenger die ChIP-Puffer ist, die weniger falsch-positiv-Chromatin-Fragmente sind Immunoprecipitated, wenn die Qualität des Antikörpers das Waschmittel verwendet nicht betroffen ist. Für die Zukunft könnte es machbar, die vorgestellte Protokoll zu anderen Histon-Modifikationen innerhalb der globulären Domäne der Histone anzuwenden sein.

Wenn die Antikörper eignen sich für ChIP und sind stabil bei höheren Konzentrationen Waschmittel, enthält das Protokoll vor allem zwei wichtige Schritte. Erstens sollte die Fixierung der Zellen und der anschließenden Schur des Chromatins für jede Zelle und jedes Ultrasonicator optimiert werden. Verlängerte Vernetzung führt zu Fixierung Artefakte und verringern die Antikörper-Erkennungsrate da Antigene maskiert werden können. Das Chromatin Scheren musste eine Größenverteilung der DNA zwischen 200 und 500 bp (Abbildung 1 b) führen. Nukleosomen enthalten 147 bp DNA. Chromatin-Fragmente, die zu lange dauern führt zu falsch positiven Ergebnissen in qPCRs. Während der genomweite Sequenzierung führt eine falsche Größenverteilung zu falsch-negativen Ergebnissen, da oft nur kleine Fragmente gelten. Der zweite wichtige Schritt ist die Bibliothek Vorbereitung für genomweite Sequenzierung. Ein DNA-Amplifikation Schritt muss mit 6-9 PCR-Zyklen durchgeführt werden. Vermeidung von zahlreichen PCR-Zyklen ist wichtig, da sie einen hohen GC-Bias und viele PCR Duplikate führen können. Mit dem vorgestellten Protokoll kann genügend DNA abgerufen werden, um die Anzahl der notwendigen PCR-Zyklen niedrig zu halten.

Gehirngewebe besteht aus einer sehr unterschiedliche Menge von Zelltypen wie Neuronen, Oligodendrozyten und Glia-Zellen-4. Während der Entwicklung dieser Zellen stammen aus neuralen Stammzellen und bestimmte Bereiche im Gehirn in einem Zeit und ortsabhängigen Weise3zu bauen. Neurogenese der Großhirnrinde, findet zum Beispiel zwischen E11.5 und E18.5 bei Mäusen. In früheren Stadien wie E11.5 und E12.5 haben fast alle Zellen Vorläuferzellen Identität1, aber später zellulären Vielfalt muss Rechnung getragen werden. Daher ein ChIP von kortikalen Gewebe am E14.5 H3K79me2 oder jede andere Histon-Änderung an diesem bestimmten Zeitpunkt offenbaren kann aber nicht Zelltyp spezifische Chromatin Funktionen anzeigen. Dieses Problem kann gelöst werden durch Anreicherung bestimmter Zellen mit Fluoreszenz-aktivierte Sortierung (FACS) oder magnetischen aktiviert Zellen sortieren (MaCS-Sortierung)40, die nach Gehirn Homogenisierung möglich ist. Mit MaCS-Sortierung neurale Vorläuferzellen, die bestimmte Zelle Oberflächenmarker tragen können mit magnetischen Beads beschriftet werden und dann isoliert mit einem Magnetstativ40. Danach können die Zellen kultiviert oder direkt für ChIP verwendet werden. Die vorgestellte Protokoll kann nicht nur für neurale Vorläuferzellen, sondern auch für andere homogene Zellpopulationen verwendet werden. Mit Zusatz von FACS oder MaCS kann das Protokoll für alle isolierbare Zellen innerhalb eines Lebewesens angewendet werden.

Zusammengenommen, macht die vorgestellte Protokoll es möglich die Histon-Modifikation H3K79me2 zu verschiedenen Zeitpunkten der kortikalen und zerebelläre Entwicklung in eine effiziente und reproduzierbare Methode untersuchen. Es kann zu anderen Histon-Modifikationen befindet sich innerhalb des Histon-Core anwendbar und kann auch auf andere homogene Zelltypen innerhalb des Organismus. Da H3K79me2 eine konservierte Histon Änderung23ist, kann das Protokoll auch geeignet, um H3K79me2 zu analysieren, nicht nur bei Mäusen, aber auch über verschiedene Arten sein.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte

Acknowledgments

Wir danken für die Unterstützung der CGN-Anbau-Protokoll im Labor herstellen Henriette Bertemes. Dieser Methode Papier wurde von der DFG-geförderten CRC992 medizinische Epigenetik unterstützt, durch die Finanzierung zu TV. Die Autoren erkennen die Unterstützung von Freiburg Galaxy Team: Pavankumar Videm, Björn Grüning und Prof. Rolf Backofen, Bioinformatik, Universität Freiburg, Deutschland finanziert Collaborative Research Center 992 medizinische Epigenetik (DFG Stipendium SFB 992/1 2012) Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF Grant 031 A538A RBC (de.) NBI)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 131 zerebelläre Zellkultur kortikalen Zellkulturen Cortex Entwicklung zerebelläre Entwicklung H3K79 Methylierung DOT1L ChIP DOT1L Hemmung
Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke
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Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S.,… More

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

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