Summary
상해 항공을 미리 조절 하 여 murine 폐에 폐 암 세포의 orthotopic engraftment를 크게 향상 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 폐 microenvironment, 전이성 보급, 폐 암 공동 morbidities stromal 상호 작용 연구에 적용 될 수 있습니다 그리고 파생 xenografts 환자를 보다 효율적으로 생성 하.
Abstract
폐 암은 생물학적으로 이기종은 치명적인 치료 내 화 질병입니다. 이해 하 고 효과적으로 치료 흉부 악성의 전체 임상 스펙트럼, 다양 한 인간의 폐 암 하위 유형 및 단계 정리 수 추가적인 동물 모델 필요 합니다. 이식 또는 종이 식 모델 다재 다능 하 고 tumorigenic 용량에 vivo에서, murine 또는 인간 기원의 악성 세포를 사용 하 여의 정량화를 활성화. 그러나, 폐 암 세포 engraftment의 앞에서 설명한 방법 orthotopic 이식 세포는 폐로의 비 효율으로 인해 마우스의 측면 등 생리 적 비 사이트에서 수행 되었습니다. 이 연구에서 우리가 미리 섬유 증 유도 에이전트 bleomycin와 쥐의 기도 조절 하 여 orthotopic 폐 암 세포 engraftment를 강화 하는 방법을 설명 합니다. 개념 증명 실험으로 우리 쥐의 다양 한 긴장으로 마우스 또는 인간의 소스에서 얻은 폐 선 암 하위의 종양 세포를 engraft에이 접근을 적용. 우리는 0-17에서 종양 세포의 engraftment 증가 종양 세포 주입 전에 bleomycin과 항공 부상 입증 71-100% %. 상당히,이 방법은 폐 종양 발생과 이후의 파생물을 다른 모델 및 마우스 긴장을 사용 하 여 향상. 또한, engrafted 폐 암 세포 관련 먼 장기로는 폐에서 보급. 따라서, 설정 하 고 셀 또는 biospecimen의 양의 제한 폐암의 새로운 orthotopic 모델을 유지 하 고 양적 폐 암 세포 생리학 관련 설정에서의 tumorigenic 용량을 평가 하기 위해 사용할 수 있는 프로토콜 제공 .
Introduction
폐암은 주요 원인의 암 관련 사망 세계1. 폐암 환자 결국 굴복 하는 전이에서 먼 장기에, 특히 중앙 신경 조직, 간, 부 신 분 비, 및 뼈2,,34. 흉부 악성 작은 세포 폐 암 (SCLC) 또는 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC)5전통적으로 분류 되어 있다. NSCLC 이며 가장 자주 암 진단 폐 선 암 (LUAD)와 폐 편평 상피 세포 암 (LUSC)6을 포함 하 여 다른 조직학 하위로 세분화 될 수 있습니다. 절제 인간의 기본 폐 암의 게놈 분석 주어진된 histotype 내 종양 또한 다양 한 분자 섭, 더 그들의 분기 임상 진행에 기여 하 고 환자의 예 후를 혼동을 표현할 수 있는 공개 했다. 폐 암의 놀라운이 합리적인 디자인, 전 임상 테스트 및 효과적인 치료 전략의 구현에 중요 한 도전을 나타냅니다. 따라서, 다양 한 세포 기원, 분자 하위,이 질병의 단계를 공부 하 고 온순한 실험 폐 암 모델의 레 퍼 토리를 확장 하는 필요가 있다.
동물 모델을 사용 하 여 다양 한 접근 폐 암에서 공부 vivo에서, 각각의 생물 학적 질문에 따라 그들의 자신의 장단점을 고용 했습니다. 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 주어진된 조상 세포 유형, 종양 immunocompetent 호스트7그 진행 결과에 특정 유전 변경 대상 수 있습니다. 매우 강력 하 고 임상 관련, 대기 시간, 변화, 및 폐 종양 사망률 GEMMs와 관련 된 특정 양적 측정 및 먼 장기8에 늦게 단계 전이의 탐지 금지 될 수 있습니다. 상호 보완적인 접근 이식 모델, 폐 암 세포, 마우스 종양에서 직접 하거나 문화, 설립된 셀 라인으로 먼저 파생 된 syngeneic 호스트에 다시 도입 이다 그것에 의하여의 사용 이다. 비슷하게, 폐 암 xenografts 인간 세포 선 또는 환자 파생된 종양 샘플에서 설정 됩니다. 인간 세포 선 xenografts 또는 환자 파생된 xenografts (PDXs)는 일반적으로 immunocompromised 쥐에서 하 고 따라서 완전 한 면역 감시9배제. 이 결점에도 불구 하 고 그들은 인간 biospecimens 연구 기본적인 vivo에서 속성과 GEMM 종양 보다 더 복잡 한 게놈 착오에 대 한 인코딩 인간 암 세포의 양의 제한 전파 하는 수단을 제공 합니다.
이식 및 xenografts 하나의 유용한 속성은 전통적인 제한 셀 희석 분석 실험, 종양 세포 (TICs)을 시작 하는 악성 세포 인구10의 주파수 척도를 고용 의무가 다는 것. 이 실험에서 셀의 정의 수는 동물의 측면으로 피하 주입 하 고 TICs의 주파수를 종양 걸릴 속도에 따라 예상할 수 있는. 그러나 피하 종양은 더 hypoxic11 수 있으며 폐 종양 microenvironment의 주요 생리 적인 제약을 모델링 하지 않을 수 있습니다. 쥐의 폐에 상피 줄기 또는 조상 세포의 Intratracheal 배달 폐 중생과 기도 줄기 세포 생물학12공부 하는 방법입니다. 그러나,이 기술은에서 engraftment 속도 폐 손상, 바이러스 감염13,14등의 생리 적 형태를 먼저 받게 됩니다 않는 한 상대적으로 낮은 수 있습니다. 자극적인 stromal 세포에서 지원 및 폐 지하실 막의 장애 원심 항공15벽 감 관련 줄기 세포로 이식된 세포의 보존을 높일 수 있습니다. 에이전트를 유도 하는 섬유 증 폐 engraftment 유도 만능 세포16 및17중간 엽 줄기 세포 강화에 사전 조건 또한 수 있습니다. 비슷한 형태의 기도 부상 engraftment 속도 영향을 미칠 수 있습니다, 여부를 종양 시작 용량 및 폐 암 세포의 파생물은 아직 체계적으로 평가 한다.
이 연구에서 우리는 사전 조건 부상으로 쥐의 폐에 의해 orthotopic 폐 암 세포 engraftment의 효율성을 증가 하는 방법을 설명 합니다. LUAD는 수시로 빈약한 예 지19와 상관 관계가 거리 기질18 개발이 암의 중요 한 하위 집합으로 원심 항공에서 발생 한다. Bleomycin polyketide-자연 nonribosomal 하이브리드 펩 티 드은 쥐20에 폐 섬유 증을 유도 하기 위해 광범위 하 게 이용 되어. Bleomycin의 기도 점 먼저 상피 마찰을 포에 염증 세포, 대 식 세포, 호 중구, monocytes21등의 채용을 승진 시킨다. 이것은 원심 항공, 지하실 멤브레인 개편22,23 , 세포 외 기질 (ECM) 증 착24에 개장 하는 조직에 의해 선행 된다. 대부분 연구25에서 30 일 후 해결 하는 섬유 증과 단일 bleomycin 주입의 효과 일시적 이며, 이식 및이 종이 식 모델을 사용 하 여, 사전 조건 bleomycin와 쥐의 기도 폐에서 LUAD 셀의 포획 률 증가 크게 수 테스트.
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Protocol
모든 실험 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 예일 대학에 의해 승인에 따라 실행 되었다.
1. 설정 /는 시 약의 준비.
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Bleomycin
주의: 기반에 세계 조화 시스템 (GHS) 분류와 화학 물질의 라벨, bleomycin GHS08 건강 위험으로 분류 됩니다.- 화학 후드에서 bleomycin을 준비 합니다. 멸 균 인산 염의 5 mL로 15 U resuspend 버퍼링 식 염 수 (PBS).
- Aliquot 100-200 µ L 유리에 솔루션의 리 바이 알 및 나중에 사용-20 ° C에서 그들을 동결. 제대로 물의 resuspension의 날짜와 튜브 라벨. 이 날짜 로부터 6 개월 이내 사용 합니다.
참고: 각 마우스 스트레인 bleomycin26에 다른 감도 있다. 각 마우스 스트레인에 대 한 bleomycin의 다른 복용량을 테스트 하는 것이 좋습니다. 마우스 긴장 및 bleomycin 대표 실험에 사용 된 해당 복용량은 표 1에 나열 됩니다.
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마우스
- 쥐 실험에 필요한 구입 하 고 허용 마우스 주입 전에 적응 7 일. Biosafety 두건에서 혼합을 수행 합니다. 동물 bleomycin 주입 전에 표준 제도적 절차를 사용 하 여 BSL2 룸 비 BSL2 규격 룸에 전송 합니다. 나이의 6-8 주에 쥐를 주입.
주의: 마우스 기관 가이드라인 유해 에이전트, biosafety 수준 2 (BSL2)과 IACUC 승인 주사.
참고: 마우스 대표 실험에 대 한 구입 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 남자 마우스만 사용 되었습니다.
- 쥐 실험에 필요한 구입 하 고 허용 마우스 주입 전에 적응 7 일. Biosafety 두건에서 혼합을 수행 합니다. 동물 bleomycin 주입 전에 표준 제도적 절차를 사용 하 여 BSL2 룸 비 BSL2 규격 룸에 전송 합니다. 나이의 6-8 주에 쥐를 주입.
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폐 암 세포 선
- 그들의 각각 미디어 문화 원하는 셀 라인입니다. 주사, 전에 짧은 탠덤 반복 DNA 프로 파일링 또는 적절 한 셀 라인 식별 되도록 유전자 검사를 수행 합니다. 및 촉진 하기 위하여 vivo에서 ex vivo imaging, lentivirus 티 미 딘 키 니 아 제, 녹색 형광 단백질 (GFP)와 luciferase 퓨전 기자27, 세포 감염 하 고 형광 기자 긍정적인 셀 정렬 engraftment 이전 (FACS)를 정렬 하는 세포를 활성화. 테스트 라인 mycoplasma에 대 한 6 개월 마다.
- H2030 인간 암 세포 선 소 태아 혈 청 (FBS), 10% 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI)를 사용 하 여 제조업체에서 권장 하는 대로 문화 페니실린-스와 암포 b
- 문화 ( KraG12D, p53-/- 마우스에서 파생 된) 368T1 murine 셀 라인 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)를 사용 하 여 10 %FBS, 페니실린-스와 암포 b
- 문화 PC9 인간 암 세포 라인 RPMI를 사용 하 여 10 %FBS, 페니실린-스와 암포 b
- 그들의 각각 미디어 문화 원하는 셀 라인입니다. 주사, 전에 짧은 탠덤 반복 DNA 프로 파일링 또는 적절 한 셀 라인 식별 되도록 유전자 검사를 수행 합니다. 및 촉진 하기 위하여 vivo에서 ex vivo imaging, lentivirus 티 미 딘 키 니 아 제, 녹색 형광 단백질 (GFP)와 luciferase 퓨전 기자27, 세포 감염 하 고 형광 기자 긍정적인 셀 정렬 engraftment 이전 (FACS)를 정렬 하는 세포를 활성화. 테스트 라인 mycoplasma에 대 한 6 개월 마다.
2. bleomycin 치료
- 주입 마우스 intratracheally bleomycin 14 일전 종양 세포 engraftment 계획.
- 얼음 2 h 주입 이전에 bleomycin 주식 녹여
- 일단 해 동, bleomycin 원하는 작업 농도 (0.02 U/50 µ L 또는 0.005 U/50 µ L)에 희석 하 고 얼음에 그것을 유지.
참고: bleomycin의 농도 실험 (표 1)을 위해 사용 마우스 변형에 따라 달라 집니다. 적정 bleomycin 생쥐에서의 최적의 복용량을 결정 하기 위해 수행 되어야 한다. - 각각 마 취 제 및 xylazine 10 mg/mL 및 1 mg/mL의 최종 농도를 희석 하 여 마 취 준비, 100/10 mg/kg에서 케 타 민/xylazine intraperitoneally 용액을 주입 하 여 각 마우스 anesthetize 1 mL 주사기와 27 G 니 들을 사용 하 여 각각.
- 생쥐의 호흡을 모니터링 하 고 발가락 핀치를 고용. 마우스 핀치 발가락에 응답 하지 않는 경우 적절 한 anesthetization를 확인 합니다. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
- 플랫폼에 대 한 그것의 뒤와 앞 이빨을 교수형에 삽 관 법 플랫폼에 한 번에 1 마우스를 놓습니다.
- 기도의 시각화로 돕기 위하여 광섬유 조명 기를 사용 하 여 상단의 가슴을 밝히는. 마우스의 입을 열고 꺼내 혀 부드럽게 살 균 플랫 집게와.
- 바늘 없이 정 맥 카 테 터를 사용 하 여 호흡을 차단 하지 마십시오. 하얀 빛을 통해 카 테 터의 위치는 기관지의 개통에서 방출.
- 카 테 터의 위쪽 앞 니에 도달할 때까지 기도에 카 테 터를 삽입 합니다. 입에는 카 테 터의 개방을 통해 빛나는 하얀 빛을 시각화 하 여 기도에 카 테 테 르의 적절 한 배치를 확인 합니다.
- 전체 볼륨 흡입 되도록 카 테 터에 직접 bleomycin 또는 차량 (PBS)의 50 µ L를 분배를 피 펫을 사용 하 여. 무 균 조건 하에서이 단계를 수행 합니다.
- 카 테 터 삽입 올바르게 경우 마우스 카 테 터의 내용을 흡입 즉시 것입니다. 전체 볼륨 테 아래로 이동 될 때까지 몇 초 동안 기다립니다. 다음 기도에서 카 테 터를 제거 하 고 10% 표 백제 솔루션에서 처리.
참고: 단계 2.7-2.11 마우스 당 평균 시간 약 5 분입니다. - 경우 마우스는 액체를 흡입 하지은, 신중 하 게 호흡을 모니터링 하 고 카 테 테 르 위치를 조정. 마우스에 호흡 중지 하는 경우 즉시 카 테 터를 제거 하 고 다시 카 테 터를 삽입 하기 전에 일반적으로 호흡을 다시 시작 하려면 마우스를 허용.
- 복구에 대 한 평평한 표면에 그들의 뒤에 IACUC 승인된 난방 패드에 주입 된 마우스를 놓습니다. 모든 절차는 마우스 당 10 분을 걸릴 것입니다. 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 주입 받은 동물을 반환 하지 않습니다.
- 24 h에 대 한 감 금 소에 "유해 화학 물질 사용" 카드를 놓습니다.
3. 모니터링 마우스 후 삽 관 법
- 마우스 마 취에서 깨어날 때까지 삽 관 법 및 다음 모든 15 분 직후 호흡 곤란에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 두지 마십시오 쥐 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지.
- 고통을 완화 시키기 위해 intraperitoneally (5 mg/kg) ketoprofen 주사.
- 쥐 24 시간 게시물 삽 관 법 그리고 병의 어떤 표시 든 지를 위한 일주일에 3 번 검사 합니다.
- 절차, 동물 식별, 절차의 유형, 유형의 시간, 마 취 및 수술 모니터링 관측의 날짜의 기록을 유지.
- 체중 감소, 호흡 곤란, 행동 이상, 및 몸 상태 점수에 대 한 마우스를 모니터 < 2 (척추 열 분명 지 골반 뼈의 세분화는 만져 서) 격주 bleomycin의 주입 다음.
- 호흡 곤란에서 마우스 또는 마우스는 CO2 또는 케 타 민/xylazine 뒤에 자 궁 경부 전위 몸 질량의 15% 감소를 경험 했다 안락사. 호흡 활동에 대 한 촉진을 실시 하 여 안락사를 확인 합니다.
4입니다. 폐 선 암 세포 선의 engraftment입니다.
참고: 셀의 engraftment bleomycin (2.1 단계)의 주사 후 14 일을 수행 합니다.
- 성장을 75 cm2 플라스 크에서 그대로 해당 미디어와 함께 주입의 하루 전에 3 일 동안 1.3 단계에서 설명한 대로 셀을 허용 합니다.
참고: 그들은 주입의 하루에 80% 합칠 수 한다 (해당 2-3 10 배 하는6 셀 라인에 따라 각 플라스 크에). - 실 온에서 PBS의 5 mL와 75 c m2 플라스 크에 세포를 씻어.
- PBS를 발음 하 고 셀에 trypsin의 1.5 mL를 추가 하 고 셀 분리 (일반적으로 2-5 분) 때까지 37 ° C에서 세포를 품 어.
참고: 아래 플라스 크 또는 가벼운 현미경의 간단한 시각화 플라스틱에서 셀 분리에 대 일 분 마다 검사 것이 좋습니다. 트립 신 가진 외피의 5 분을 초과 하지 마십시오. - 10%를 포함 하는 미디어의 4 mL를 추가 하 여 트립 신 중화 FBS (동일한 미디어 4.1 단계로). 15 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 실 온에서 3 분 x g 200에서 원심.
- 미디어를 발음 하 고 세포를 씻어 PBS의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 셀 작은 셀을 실 온에서 3 분 200 x g에서 원심 이 1 시간을 반복 합니다.
- PBS를 발음 하 고 플라스 크 당 1.5 ml PBS의 펠 릿을 resuspend.
- Trypan 블루의 50 µ L로 세포 혼합물의 50 µ L를 혼합 하 고 셀 카운터/Hemocytometer 챔버28를 사용 하 여 셀.
- 마우스 당 50 µ L에서 세포 현 탁 액 셀 1 x 105 셀 (또는 표시 다른 금액)을 주입 하는 PBS에 희석 하 여 준비 합니다. 주입 전에 얼음에 셀을 계속.
참고: 적어도 두 번 셀 세포 현 탁 액의 밖으로 실행 되지 않도록 분사에 대 한 준비. - 각각 마 취 제 및 xylazine 10 mg/mL 및 1 mg/mL의 최종 농도를 희석 하 여 마 취 준비, 100/10 mg/kg에서 케 타 민/xylazine intraperitoneally 용액을 주입 하 여 각 마우스 anesthetize 1 mL 주사기와 27 G 니 들을 사용 하 여 각각.
- 생쥐의 호흡을 모니터링 하 고 발가락 핀치를 고용. 마우스 핀치 발가락에 응답 하지 않는 경우 적절 한 anesthetization를 확인 합니다. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
- 플랫폼에 대 한 그것의 뒤와 앞 이빨을 교수형에 삽 관 법 플랫폼에 한 번에 1 마우스를 놓습니다.
- 기도의 시각화로 돕기 위하여 광섬유 조명 기를 사용 하 여 상단의 가슴을 밝히는.
- 부드럽게 p200 피 펫을 사용 하 여 그들은 덩어리를 형성 하지 않는다 다는 것을 확인 하는 셀 resuspend 마우스의 입을 열고 꺼내 혀 부드럽게 살 균 플랫 집게와.
- 정 맥 카 테 터를 사용 하 여 호흡을 차단 하지 않도록 제거 하는 바늘. 하얀 빛을 통해 카 테 터의 위치는 기관지의 개통에서 방출.
- 카 테 터의 위쪽 앞 니에 도달할 때까지 기도에 카 테 터를 삽입 합니다. 입에는 카 테 터의 개방을 통해 빛나는 하얀 빛을 시각화 하 여 기도에 카 테 테 르의 적절 한 배치를 확인 합니다.
- 전체 볼륨 흡입 되도록 카 테 터에 직접 셀의 50 µ L를 분배를 피 펫을 사용 하 여. 무 균 조건 하에서이 단계를 수행 합니다.
참고:이 경우 카 테 터 삽입 올바르게 마우스는 즉시 카 테 터의 내용을 흡입. - 전체 볼륨 카 테 터, 아래로 여행 때까지 몇 초 정도 기다린 다음 기도에서 카 테 터를 제거 하 고 10% 표 백제 솔루션에서 처리.
- 경우 마우스는 액체를 흡입 하지은, 신중 하 게 호흡을 모니터링 하 고 카 테 테 르 위치를 조정. 마우스에 호흡 중지 하는 경우 즉시 카 테 터를 제거 하 고 다시 카 테 터를 삽입 하기 전에 일반적으로 호흡을 다시 시작 하려면 마우스를 허용.
참고: 4.11-4.18 단계의 마우스 당 평균 시간 약 5 분입니다. - 복구에 대 한 평평한 표면에 그들의 뒤에 IACUC 승인된 난방 패드에 주입 된 마우스를 놓습니다.
참고: 모든 절차는 마우스 당 10 분을 소요 됩니다. 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 주입 받은 동물을 반환 하지 않습니다. - Ventrally 전체 갈비뼈 두 영역을 면도 하 고 dorsally B6129SF1/J와 검은 머리와 다른 마우스 긴장의 이미징 이전 전기 면도기를 사용 하 여.
- 세포 주입 후 2-3 분 복고 orbitally 소의 100 µ L를 주사 (15 mg/mL)는 인슐린 바늘을 사용 하 여. 대체 눈 주입 모든 이미징 세션에 대 한 사용.
- 적어도 2 분 후 최대 5 쥐 등 recumbency 위치에 동물 생물 발광 영상에서 놓고 발광 설정29를 사용 하 여 복 부 사진을 수집 합니다.
- 제어판에서 주어진된 셀 라인의 발광 측정 해상도 감도 설정을 조정 합니다. 대부분의 응용 프로그램에 대 일 분 (또는 "자동" 포화 하는 경우), binning 시작 매체 (4), F/정지 = = 1, 보기의 필드 = D, 주제 높이 1.50 =.
참고: 성공적으로 주입 되 면 한 폐 또는 모두 폐에 위 가슴 지역에 발광 신호 감지 됩니다. - Sternal recumbency 위치에 마우스를 플립 하 고 위와 같이 등 그림을 확보.
참고: 셀 주입이 제대로 수행 되지 않습니다, 경우 목 또는 기도의 입구에서 셀 클러스터 수 있습니다. - Ketoprofen 주사 5 mg/kg intraperitoneally 고통을 완화.
- 그들의 감 금 소에 다시 마우스를 이동 하 고 감 금 소에 "에이전트에서 사용 BSL-2" 카드를 놓습니다.
- 마우스 마 취에서 깨어날 때까지 삽 관 법, 및 다음 모든 15 분 직후 호흡 곤란에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 두지 마십시오 쥐 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지.
- 마우스 24 시간 게시물 삽 관 법 그리고 병의 어떤 표시 든 지를 위한 일주일에 세 번 검사 합니다.
- 절차, 동물 식별, 절차의 유형, 종류의 마 취 및 수술 모니터링 관측 및 시간의 날짜의 일지에 기록을 유지.
- 체중 감소, 호흡 곤란, 행동 이상, 및 몸 상태 점수에 대 한 마우스를 모니터 < 2 (척추 열 분명 지 골반 뼈의 세분화는 만져 서) 격주 bleomycin의 접종 다음.
참고: 폐 종양 쥐 호흡기 자극, 체중 감소, 악, 및 죽음 전시 수 있습니다. - 호흡 곤란에서 마우스 또는 마우스는 CO2 또는 케 타 민/xylazine 조직 수집 하는 경우 자 궁 경부 전위 뒤 몸 질량의 15% 감소를 경험 했다 안락사. 호흡 활동에 대 한 촉진을 실시 하 여 안락사를 확인 합니다.
5. 생물 발광 영상에서 종양의 성장을의 모니터링
- 그 후 3 일 후 engraftment 주간에서 쥐의 이미지를 반복 합니다.
- Anesthetize 마우스 (2.4-2.5 단계에서 설명)로 마 취 제/xylazine를 주입 또는 흡입된 isoflurane (2%). 생쥐의 호흡을 모니터링 하 고 적절 한 anesthetization를 확인 하는 발가락 핀치를 고용. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
- Ventrally 전체 갈비뼈 두 영역을 면도 하 고 dorsally B6129SF1/J와 검은 머리와 다른 마우스 긴장의 이미징 이전 전기 면도기를 사용 하 여.
- 일단 쥐 마 취, 복고풍 orbitally 소의 100 µ L을 주입 (15 mg/mL)는 인슐린 바늘을 사용 하 여. 2 분 대체 주입 모든 이미징 세션에 사용 하는 눈을 기다립니다.
- 영상에 마우스를 놓고 단계 4.22-4.24에에서 설명 된 대로 등 쪽과 복 부 이미지를 취득 합니다.
- 이미징, 복구에 대 한 평평한 표면에 그들의 뒤에 후 다시으로 마우스를 놓습니다.
참고: 모든 절차 5 쥐의 그룹 당 5 분 소요 됩니다. 두지 마십시오 쥐 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지. - 영상/생물 발광 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다.
- 적절 한 이미지를 선택 하 고 생물 발광 분석 소프트웨어에서 그룹으로 그들을 로드.
- 클릭 ROI 도구 | 스퀘어 (ROI)의 사각형 영역을 추가 하려면. 장소 전체 폐 이미지를 취재 위 가슴 지역에 투자 수익. 각 마우스 이미지에 대 한이 반복 합니다.
- 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 모든 수익을 복사 함수 그룹에 있는 모든 이미지에 같은 투자 수익을 적용 하 고 마우스, 복 부 및 등 쪽의 위 가슴에 그들의 위치를 선택 합니다.
- 이미지 창의 왼쪽된 상단에서 광자 함수를 선택 합니다. ROIs를 측정 하기 위해 측정 제어 패널 기능을 클릭 합니다. 복사 하 고 데이터를 분석 하는 선택의 소프트웨어에 총 속 (광자/s)를 포함 하는 출력 테이블을 붙여 넣습니다.
- 0에 측정 ROI 값 각 마우스의 매일 ROI 값 정상화.
6. 조직 절연 고 처리 합니다.
- (대로 2.4-2.5 또는 흡입된 isoflurane (2%)에 의해 단계에서 설명 케 타 민/xylazine를 주입 하 여 마우스 anesthetize 합니다. 생쥐의 호흡을 모니터링 하 고 발가락 핀치를 고용. 마우스 핀치 발가락에 응답 하지 않는 경우 적절 한 anesthetization를 확인 합니다. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
- 복고풍 orbitally 소의 100 µ L를 주사 (15 mg/mL)는 인슐린 바늘을 사용 하 여. 2 분을 기다립니다.
- 이 프로토콜에서 단계 4.22-4.24 다음 이미지 마우스.
- 6.2 단계에서 다른 눈에 복고풍 orbitally 안락사 전에 인슐린 바늘을 사용 하 여 소의 또 다른 100 µ L를 삽입할.
- 케 타 민/xylazine의 복 주입 하 여 쥐를 안락사 경우 마우스 IACUC에 의해 제공 된 지침에 따라 깊은 마 취는 자 궁 경관 탈 구 다음 (자세한 내용은 2.4 단계 참조). 호흡 활동에 대 한 촉진을 실시 하 여 안락사를 확인 합니다.
- 무 균 수술가 위 게 흉 골 아래 피부 절 개를 사용 하 여. 집게와 수술가 위를 사용 하 여 횡 경 막 따라 근육 층 열고 흉 강 내부 흉부 동맥을 피하고 측면 측면 중 하나에 흉 곽을 통해 절단 하 여 노출 합니다.
- 심장의 오른쪽 아 트리 움에 작은 절 개를 하 여 마우스를 perfuse 하 고 좌 심 실 통해 PBS의 5 mL 주입. 폐 조직의 색 혈액 관류 제대로 창백한 핑크-흰색 빨강에서 갈 것입니다.
- 집게와 식도 또는 마음을 잡아서 흉 강에서 폐를 신중 하 게 소비 세. 부드럽게 당겨 조직 하 고 수술가 위를 사용 하 여 신중 하 게 찔린 폐 조직의 피하 연결 조직을 잘라. 기도 유지 가능한 나중 단계에서 폐 기도의 인플레이션에 대 한.
- 잠수 하 여 폐를 세척 하 고 과잉 혈액을 제거 하는 PBS의 3 mL 가득 6 잘 플레이트에 조직 3 번 소용돌이.
- 6 잘 플레이트의 뚜껑에 폐 고 발광 영상에서 조직을 포함 하는 뚜껑 장소 놓고 발광 이미지30을 취득.
참고: 좋습니다 "수집 제어판"에서 다음과 같은 설정을 선택 "보기의 필드 = A" 및 "주제 높이 = 0.75 m" 다음 "자동 노출" 선명한 이미지를 받지 않으려면. - 소비 세 단계 6.9-6.10, 발광, 뇌, 간, 부 신, 뼈, 림프절, 신장 또는 비장의31등으로 확인 된 전이에서 다 다른 장기를 심상 하 고.
- 마우스의 기관지에 바늘을 삽입 하 여 4 %paraformaldehyde 1 mL와 함께 폐를 perfuse. 폐 면 잘 perfused 부 풀 려 것입니다.
주의: 4 %paraformaldehyde 이다 독성, 건강 위험 GHS07 및 GHS08. - 4 %paraformaldehyde 5 mL와 함께 15 mL 원뿔로 폐를 전송 합니다.
- 30-50 rpm에서 떨고 장치에 4 ° C에서 하룻밤 4 %paraformaldehyde 조직 배양 하 여 폐 나 다른 조직 수정.
- 파라핀 또는 복합 응용 프로그램32에 따라 최적의 절삭 온도에 폐 (또는 다른 조직)를 포함 합니다.
참고: 파라핀은 폐 구조 유지를 선호 하는 방법 및 Masson Trichrome 및 Hematoxylin에 오신 얼룩이.
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Representative Results
LUAD 암 세포 engraftment 쥐의 폐에의 효율성 증가, 우리는 먼저 사전 조건 항공 bleomycin orthotopic 종양 세포 주입 (그림 1) 다음을 사용 하 여 프로토콜 개발. 우리는 immunocompromised athymic 마우스에 투여 하는 경우에 bleomycin 과도 섬유 증에 의해 유도 된 하루 14 기도 건축과 증가 교원 질 공 술 서 (그림 2)의 손실에 의해 입증으로 확인 했다. 이 마우스에 총 섬유 증 해결 50 일 이전 연구24일치 bleomycin 주입 (그림 2, 오른쪽 패널)를 게시.
다른 근원의 LUAD 세포 했다 미리 단련 되어 차량 또는 bleomycin의 단일 투여 14 일 이전 다양 한 마우스 긴장의 폐에 engrafted 이러한 관찰을 바탕으로, 우리. 예를 들어 설립된 인간 LUAD 셀 라인에서 H2030, LUAD 세포의 현 탁 액 athymic 쥐의 폐에 intratracheally는 전달 했다. 35 일 후 쥐 bleomycin과 청소용된 높은 폐 종양 부담을 생물 발광 (그림 3A)에 의해 감지 했다. 반대로, 차량 취급 동물 종양 없음 같은 시간 프레임 (그림 3A) 감지 했다. 폐 종양 부담 조직학 검 시를 다음에 의해 확인 됐다. 반면 bleomycin 미리 치료 폐 했다 큰 종양 작은 혹 (그림 3B) 청소용된 차량 폐 종양 작은 혹의 증거를 했다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리 또한 증가 했다 athymic 마우스 (PC9;으로 또 다른 인간의 LUAD 셀 라인의 engraftment 그림 3C) 그리고는 murine LUAD 셀 라인을 syngeneic immunocompetent B6129SF1/J 쥐 (그림 3D)에 주입 했다. Bleomycin 미리 치료 syngeneic 쥐에서 관찰 초기 병 변 주로 1, 2 학년 고 분화 잘 되었다 제자리에서 에서 발생 하는 종양을 닮은 KraG12D / +; p53-/- GEMMs33. 모든 engrafted LUADs 인접 하 고 말 초 폐에서 둘 다 증가 했다 (그림 3B, 그림 3E, 그림 3G; 별표 (원심), 스타 (근 위)). (생 검 또는 수술 절제)에서 폐 암 biospecimens에서 PDXs의 설립은 상대적으로 비효율적, 인간 세포는 피하 끄 덕 scid 감마 (NSG) 등 심각 하 게 immunodeficient 동물에 이식 하는 경우에 마우스 스트레인34 PDXs 우리의 방법의 잠재적인 응용 프로그램을 평가, 우리는 또한 H2030 BrM3 셀35, NSG 마우스를 미리 차량 조건에서 intratracheally 나 H2030 셀 라인의 높은 전이성 세포 하위 인구 주입 또는 bleomycin입니다. 우리는 NSG 쥐 bleomycin (데이터 표시 되지 않음)의 독성 영향에 더 취약 있을 수 있습니다 마우스 당 0.02 단위 보다 낮은 복용량은 권장 작업이 긴장을 할 때 참고. 그럼에도 불구 하 고, 우리의 프로토콜 또한 크게 증가 engraftment NSG 생쥐 (그림 3 층, 그림 3G)의 폐에 있는 종양 짐.
우리는 다음 athymic 쥐에서 H2030 셀 라인을 사용 하 여 셀의 금액을 제한의 engraftment 속도 테스트 하려면이 프로토콜 사용. 마우스 bleomycin 미리 치료 5 x 105, 5 × 104, 또는 5 x 103 H2030 세포 주입 했다. 85.7 쥐의-100% 모든 희석 테스트 (표 2)에 7 그리고 10 주 사이의 폐 종양 개발. 우리 결론의 상대적으로 낮은 그 engraftment 폐에 종양 세포의 수는 마우스는 bleomycin을 미리 조절 가능. 전반적으로, 우리의 프로토콜 수에 맞게 마우스의 여러 변종 및 다양 한 LUAD 셀 라인 모델 0-16.7에서 폐로 암 세포의 engraftment 속도 증가 %71.4 100% (표 2).
마지막으로, LUAD 세포 파생물 및 bleomycin 사전 조건된 폐에서 전이성 보급의 putative 활동 평가, 우리는 우리의 프로토콜을 사용 하 여 높은 전이성 H2030 BrM3 셀의 동작 특징. 차량 취급 생쥐에서 orthotopic engraftment, 다음 종양 세포 교육 생 관찰 되었다 생물 발광에 의해 3 일에 포스트 주입 및 폐 종양의 성장 이후 또는 끝점 (주 35)에서 검출 될 수 없습니다 (그림 4A, 그림 4B). 반대로, 우리 쥐 bleomycin로 미리 치료 하는 빠르면 7 일 후 주입 (그림 4A)에서 폐 종양 파생물을 감지. 39-57 일 후 종양 확장, 사망률 및 발광 휘도와 관련 된 높은 폐 종양 부담 한계 전파 질병 (데이터 표시 되지 않음)의 분석. 따라서, 우리는 먼 장기 비보 전 검 시에 전이 몇 군데. 57 일 폐 종양 부담 했다 동물에 작은 병 변 또한 뇌, 간, 신장, 부 신 분 비, 및 가변 주파수 (그림 4C)에서 뼈 뒷 다리 사지 같은 조직에서 검출 될 수 있습니다. 따라서, 우리는 임상 관련 사이트에서 자발적인 전파 질병이 orthotopic 방법에서 생성 될 수 있습니다 결론 지었다.
그림 1: 폐 종양 세포 engraftment에 대 한 사전 조건 방법. 사용 하는 프로토콜의 회로도 폐 상해 bleomycin intratracheally를 주입 하 여 수행 됩니다. LUAD 셀은 다음에 주입 생쥐의 기도 후에 14 일. 마우스는 연속적으로 발광 모니터 종양 engraftment, 성장과 먼 전이 대 한 매주 몇 군데. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Bleomycin 원인과 과도 폐 섬유 증 ECM 개장. 되며 오신 (H & E)의 대표 이미지와 차량 및 bleomycin에서 폐의 Masson Trichrome 얼룩 처리 마우스 14 일 후 주입 (섬유 증의 피크)와 51 일 후 주사 (섬유 증 해결) 부재에 종양 세포의 사출입니다. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 여러 마우스 모델에서 LUAD 셀 라인의 폐 engraftment bleomycin 미리 치료 하는 쥐에서 증가 된다. A) Athymic 마우스 미리 차량 또는 bleomycin 치료 5 x 105 H2030 세포로 주입 했다. 끝점 (하루 35 0 포스트 주입으로 정규화)에서 상대 폐 종양 부담 생물 발광에 의해 측정 된 대로 플롯 됩니다. 각 그룹에 대 한 평균 종양 부담으로 마우스 표시 됩니다. n = 그룹 당 6-7 쥐. 폐의 B) 대표 H & E 이미지 사전 처리 차량 또는 bleomycin A에서 하루 35에. 별표 원심; = 스타 = 인접. 마우스 A에서 취급 C) Athymic 1 x 105 PC9 세포로 주입 했다. 종양 및 대표 이미지는 측정 하 고 A. n = 그룹 당 7 마우스 표시. D-E) B6129SF1/J 쥐 전 차량 대우 또는 bleomycin 1 x 105 368T1와 함께 주입 했다 KraG12D / + p53-/- (KP T 비 메트로) 세포. 종양 부담, 대표 이미지 및 H & Es 측정 하 고에 묘사는 A와 B n = 그룹 당 7 쥐. F-G) NSG 쥐 전 차량 대우 또는 bleomycin 1 x 105 H2030 BrM3 세포로 주입 했다. 종양 부담, 대표 이미지 및 H & Es (9 일과 10 일 후 주입) 측정 하 고로 표시는 A와 B n = 그룹 당 3-6 쥐. 눈금 막대 = 500 µ m. 삽입 된 종양 세포 engrafted 영역의 높은 확대를 =. 눈금 막대 너비의 100 µ m. p 값 맨-휘트니 테스트 계산 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: LUAD 세포 쥐 bleomycin 취급에 engrafted 여러 먼 장기에 전이. A) Athymic 마우스 미리 차량 또는 bleomycin 치료 5 x 105 H2030 BrM3 세포로 주입 했다. 폐 종양 부담 주간 생물 발광을 사용 하 여 측정 했다. 0으로 정규화 등 총 광자 유량 표시 됩니다. B) 종양 끝점 (하루 35 포스트 주입)에서 A에서 폐의 생물 발광에 의해 부담. 각 그룹에 대 한 평균 종양 부담으로 마우스 표시 됩니다. n = 그룹 당 6-7 쥐. C) 검 시 (왼쪽)에서 동일한 마우스에서 감지 전이 된 장기의 대표 이미지. 끝점 (하루 39 57 후 engraftment) (오른쪽)에서 먼 장기에 전이 된 쥐의 표시 주파수 테이블. 1.5 x 104 광자 위 시각 발광 신호 전 비보 장기 / (초 cm2 스테라디안) 긍정적인 전이. 으로 계산 했다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 마우스 스트레인 | 단위/마우스 |
| Athymic | 0.02 |
| NSG | 0.02 |
| B6129SF1/J | 0.005 |
표 1: 마우스 긴장 테스트에 대 한 bleomycin의 권장된 복용량의 목록입니다.
| 마우스 스트레인 | 셀 라인 | 주입 하는 셀의 수 | % engraftment | p 값 | |
| 차량 | Bleomycin | ||||
| Athymic | H2030 | 5 x 105 | 0% (0/7) | 100% (6/6) | 0.0006 |
| Athymic | H2030 | 5 x 104 | 노스다코타 | 85.7% (6/7) | 없음 |
| Athymic | H2030 | 5 x 103 | 노스다코타 | 85.7% (6/7) | 없음 |
| Athymic | PC-9 | 1 x 105 | 0% (0/7) | 85.7% (6/7) | 0.0023 |
| NSG | H2030-BrM3 | 1 x 105 | 16.7% (1/6) | 100% (3/3) * | 0.0476 |
| B6129SF1/J | 368T1 | 1 x 105 | 0% (0/7) | 71.4% (5/7) * | 0.0105 |
표 2: 표시 된 마우스 긴장, 셀 라인 및 셀 번호를 사용 하 여 engraftment 주파수 (%)의 요약 테이블. Engraftment 발광 이미징 비보에 의해 결정 되었고 비보 전 영상 37, 50 일 후 주입 사이 조직의 조직학으로 확인. * 긍정적인 engraftment vivo에서 발광 10 포스트 주입.p 값 계산 일방적인 피셔의 정확한 시험 날에 의해 확인 되었다. n.a. = 적용; 노스다코타 = 결정.
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Discussion
눈에 띄는 임상 유사물 폐암 및 폐36의 다른 만성 질환 사이 문서화 되었습니다. 특히, 환자 특 발성 폐 섬유 증 (IPF) 개발 폐암에 대 한 증가 취향이 있고이 협회는 독립적인 역사37,38흡연의. IPF 폐 건축과 ECM39의 증 착을 통해 장애인된 호흡 기능의 진보적인 파괴에 의해 특징입니다. 또한, 외과 절제술 다음 초기 단계 NSCLC 환자 동시 IPF 가난한 결과40있다. 대부분 NSCLC 종양 진단의 시간에 거리 구성 요소를 포함 하 고이 실질 반응의 정도 빈약한 예 지18와 상관 관계가. 섬유 증에서 급성 또는 지속적인 조직의 손상을 tumorigenesis 여러 가지 방법으로 부각을 증가할 수 있습니다. 예를 들어, 부상, 후 상피 재생 과정 조상 세포 변환에 취약의 수영장을 확장 수 있습니다. 또는, 유입 및 다양 한 면역 세포의 기능 반면 myofibroblasts 활성화 성장 인자를 분 비 하거나 종양 촉진 ECM 입금 면역 microenvironment를 확립 도움이 수 있습니다. 따라서, 사전 조건 설정 에이전트를 유도 하는 섬유 증과 폐의 우리의 방법을 하 증명 할지도 모른다 폐 암 공동 morbidities (예: 섬유 증)의 효과 공부 하 고 있는 기질에 풍부한 NSCLC 하위 모델링에 특히 적절 한 고 선 동적인 기질41.
전반적으로, 우리의 방법은 크게 기도 통해 기도에 주입 하는 종양 세포의 engraftment 향상. 이 관측은 immunocompetence의 다양 한 각도 마우스 긴장에 대 한 사실이 보유 하고있다. 폐에 종양 세포 주입의 다른 방법은 포함 꼬리 정 맥 주입 또는 흉 벽을 통해 폐 실질에 직접 분사 합니다. 폐 암 세포 tumorigenicity의 특정 목적을 위해 이러한 메서드는 최적의 종양 세포의에서 생존과 후자 동안 파생물 (프로세스 더 폐에 전이 가깝다), 전에 extravasate을 필요로 하는 전 세포 주입 (데이터 표시 되지 않음) 후 곧 흉 막 공간으로 밖으로 누출을 일으킬 수 있습니다. 두 방법 모두 폐 암 세포 파생물의로 코 지역 정량화를 혼동 수 있습니다. 또는, 우리의 프로토콜 시드 종양 세포 폐 기질에 의해 포위 하는 기도에 먼저 유지 됩니다 보장 합니다. 이 프로토콜의 성공에 중요 한, 쥐의 적절 한 삽 관 법, bleomycin, 쾌활 복용량 및 종양 세포 주입 상대적인 기도 사전 조절의 타이밍입니다. 우리는 또한이 프로토콜 이후 두뇌를 포함 하 여 다른 조직에 보급을 셀 수 보여 줍니다. 폐 종양 짐과 관련 된 사망률은 여전히 먼 macrometastasis의 포괄적인 특성화를 제한할 수 있습니다, 있지만이 이렇게 계량 하 고 폐에서 발생 하는 순환 종양 세포를 공부에 유용할 수 있습니다.
여기에 설명 된 방법의 장점에도 불구 하 고 몇 가지 기술 변수 engraftment의 궁극적인 효율 및 종양 진행의 모니터링을 좌우할 지도 모른다. 첫째, 그것은 잘 쥐에서 bleomycin 거리 응답은 스트레인 종속적 문서화. 예를 들어, C57Bl/6 마우스 Balb/c 마우스42에 비해 섬유 증에 더 많은 경향이 있다. 둘째, bleomycin 감도 성별 및 연령에 따라. 우리의 경험에서는, 여성 및 젊은 쥐 더 경향이 있다 부작용 전체 프로토콜. 이 남자와 여자, 사이 직접적인 비교를 요구 하는 tumorigenesis 연구 또는 젊고 오래 된 동물을 제한할 수 있습니다. 또한, intratracheal 점 7 주 보다 젊은 쥐의 기술적으로 도전 이며 카 테 터 크기를 조정 해야 할 수 있습니다. 셋째, bleomycin 독성과 돌연변이 DNA 휴식을 유도 하는 능력으로 인해 수 있습니다. 그것은 실험을 수행 하기 전에 각 마우스 스트레인에 대 한 bleomycin의 쾌활 복용량을 테스트 해야 합니다. 이 증거의 원리 연구에 우리 다양 한 변종에 걸쳐 남성 쥐에 대 한 권장된 복용량 제공합니다. 또한, 어두운 모피와 마우스는 덜 발광 낮은 조직 침투 인해 이미징 및 모피에 의해 발광 신호의 마스킹에 적합 합니다. Depilating 쥐 이미지 측정을 향상 시킬 수 있습니다 있지만 다른 방법 또한 자기 공명 영상 및 형광 이미징 TdTomato 또는 Katushka43같은 긴 파장의 프로브를 사용 하 여 같은 채택 될 수 있다. 마지막으로, 주어진된 기자 단백질의 잠재적인 immunogenicity 주어진된 마우스 모델에 대 한 종양 탐지 적임을 선택할 때 고려 되어야 한다.
Bleomycin 개장 한다 첫번째 손상 치경에 의해 말 초 폐 포44을 복구 하려고 다음 재생성 2 (AT2) 세포를 입력 합니다. AT2 셀 NSCLC를 위해 주요 셀 형식 중 하나 이므로은 개시와 GEMMs에서 현장에서 발생 하는 종양의 진행 또한 수정할 수 있습니다 사전 bleomycin과 폐 조건. 부상, 인플루엔자 감염13 또는 나 프 탈 렌 점14를 포함 하 여 다른 유형의 engraftment 인간과 murine 폐 줄기/뿌리 세포의 증가를 보였다. 특히, 렌 손해 줄기/뿌리 bronchio-치경 접속점 세포 하 고 잠재적으로 GEMMs45종양 개시를 증가 시킨다. 부상 및 기도 틈새 engrafted 셀 형식 대상 유형의 조정 폐 암 이식 또는 다른 기원의 xenografts 연구 하 우리의 방법을 최적화 추가 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 폐암 PDXs의 표준 세대에 대 한이 메서드를 구현 될 수도 있습니다 제안 합니다. NSG 쥐에 피하 이식 하 여 인간의 biospecimens에서 폐암 PDXs 설정의 성공률은 상대적으로 낮은 (30-40%)46,47. PDXs의 Orthotopic 성장 뿐만 아니라 견본 (폐)에서 양의 제한이 성공률 증가 하지만 더 순수 관련 조건 테스트 약 동학 및 폐 암 치료제의 pharmacodynamics를 생성 수 있습니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 암 연구소 (R01CA166376 및 D.X. 구 엔에 R01CA191489)와 국방부 (W81XWH-16-1-0227 D.X. 구 엔 하)에서 교부 금에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
| Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
| Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
| Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
| Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
| D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
| Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
| Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
| Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
| Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | - | To shave mice |
| Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
| Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
| Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
| IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
| Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
| BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
| Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
| 26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
| Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
| Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
| Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
| 6 well plate | Corning | C3516 | |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
| OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
| Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
| Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | - | |
| Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
| B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
| NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | - | |
| PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | - | |
| H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | - |
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