Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Förkonditionering luftvägarna av möss med Bleomycin ökar effektiviteten i ortotop Lung Cancer Cell Engraftment

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/56650
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en metod för att avsevärt förbättra ortotop engraftment av lungcancerceller i murina lungorna genom konditionering luftvägarna med skada. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas för att studera stromal interaktioner inom lungan mikromiljö, metastatisk spridning, lung cancer komorbiditeter, och för att mer effektivt generera patienten härrör xenograft.

Abstract

Lungcancer är en dödlig behandling refraktär sjukdom som är biologiskt heterogena. För att förstå och effektivt behandla full klinisk spectrumen av bröstkorg maligniteter, behövs ytterligare djurmodeller som kan sammanfatta olika mänskliga lung cancer subtyper och stadier. Transplantatavstötning eller xenograft-modeller är mångsidiga och möjliggöra kvantifiering av tumörframkallande kapacitet i vivo, med maligna celler av antingen murina eller humant ursprung. Tidigare beskrivna metoder för lung cancer cell engraftment har dock utförts i icke-fysiologiskt platser, såsom flanken av möss, på grund av ineffektivitet ortotop transplantation av celler i lungorna. I denna studie beskriver vi en metod för att förbättra ortotop lung cancer cell engraftment av konditionering luftvägarna av möss med den fibros inducerande agent bleomycin. Som ett proof-of-concept experiment tillämpat vi detta synsätt för att engraft tumörceller av undertypen lunga adenokarcinom, erhållna från antingen musen eller mänskliga källor till olika stammar av möss. Vi visar att skada luftvägarna med bleomycin före tumör cell injektion ökar engraftment av tumörceller från 0-17 71-100%. Denna metod förbättrats avsevärt, lung tumör incidens och efterföljande utväxt med hjälp av olika modeller och mus stammar. Dessutom sprida rekonstituerades lungcancerceller från lungorna i relevanta avlägsna organ. Således, vi tillhandahåller ett protokoll som kan användas för att upprätta och upprätthålla nya ortotop modeller av lungcancer med att begränsa mängder celler eller biospecimen och kvantitativt bedöma lungcancerceller i fysiologiskt relevanta inställningar tumörframkallande förmåga .

Introduction

Lungcancer är ledande orsaken till cancer relaterade dödsfall världen över1. Patienter med lungcancer duka så småningom från metastaser till avlägsna organ, särskilt till det centrala nervsystemet, levern, binjurarna och ben2,3,4. Bröstkorgens maligniteter har traditionellt klassificerats som småcellig lungcancer (SCLC) eller icke-small cell lung cancer (NSCLC)5. Icke-småcellig lungcancer är mest ofta diagnostiseras malignitet och kan delas in i olika histologiska subtyper, inklusive lunga adenokarcinom (LUAD) och lung skivepitelcancer (LUSC)6. Genomisk analys av opererande människans primära lung cancer har visat att tumörer inom en given tidstrender också kan uttrycka olika molekylära störningar, ytterligare bidrar till deras avvikande klinisk progression och confounding patientens prognos. De anmärkningsvärda heterogena lung cancer utgör en betydande utmaning för rationell design, preklinisk testning och genomförande av effektiva terapeutiska strategier. Följaktligen finns det ett behov att utöka repertoaren av eftertraktansvärda experimentella lung cancer modeller att studera de olika cellulära ursprung, molekylära subtyper och stadier av denna sjukdom.

Olika metoder med hjälp av djurmodeller har använts för att studera lung cancer i vivo, alla med sina egna fördelar och nackdelar beroende på de biologiska fråga av intresse. Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) kan rikta specifika genetiska förändringar i en given stamceller celltyp, som leder till tumörer att framsteg inom en immunkompetenta värd7. Extremt kraftfull och kliniskt relevant, kan latens, variabilitet eller lung tumör sjuklighet är associerad med GEMMs vara oöverkomliga till vissa kvantitativa mätningar och upptäckt av sena skede metastaser i avlägsna organ8. En kompletterande strategi är användningen av transplantatavstötning modeller, whereby lungcancerceller, antingen direkt från en mus tumör eller härledda först som etablerade cellinjer i kultur, är återinföras i syngena värdar. Analogt, etableras lung cancer xenograft från mänskliga cellinjer eller patientens härledda tumörprover. Mänsklig cell linje xenograft eller patientens härledda xenograft (PDXs) upprätthålls generellt hos immunsupprimerade möss och därmed omöjliggör komplett immun övervakning9. Trots denna nackdel ger de en aveny för att propagera begränsa mängder mänskliga biospecimens och studera grundläggande i vivo boenden av mänskliga cancerceller, som kodar för mer komplexa genomiska avvikelser än GEMM tumörer.

En användbar egenskap av organtransplantationer och xenograft är att de är mottagliga för traditionella begränsande cell utspädning analyser, sysselsatt att kvantifiera frekvensen av tumör inleda celler (TICs) inom en elakartad cell befolkningen10. I dessa experiment, ett definierat antal celler injiceras subkutant i flanken av djur och frekvensen av TICs kan uppskattas utifrån tumör ta ränta. Subkutana tumörer men kan vara mer hypoxisk11 och kan inte modell viktiga fysiologiska begränsningar av de lung tumör mikromiljö. Intratrakeal leverans av epitelial stamceller eller stamceller in i lungorna av möss är en metod att studera pulmonell regenerering och luftvägarna stamcell biologi12. Engraftment priset från denna teknik kan dock vara relativt låg, såvida inte lungorna utsätts första fysiologiska former av skada, såsom virusinfektion13,14. Stöd från inflammatoriska stromaceller och/eller störningar av lung basalmembranet kan förbättra retention av transplanterade celler i relevanta stamceller nischer i de distala luftvägar15. Fibros inducerande medel kan också pre villkora lungorna för att förbättra engraftment av inducerade pluripotenta celler16 och mesenkymala stamceller17. Om liknande former av luftvägarna skada kan påverka andelen engraftment, har tumör initierande kapacitet och utväxt av lungcancerceller ännu inte bedömas systematiskt.

I denna studie beskriver vi en metod för att öka effektiviteten i ortotop lung cancer cell engraftment, genom konditionering i lungorna av möss med skada. LUAD uppstår i de distala luftvägarna med en betydande delmängd av dessa cancerformer utveckla en fibrotisk stroma18 som ofta korrelerar med dålig prognos19. Bleomycin, en naturlig nonribosomal hybrid peptid-polyketide, har använts i stor utsträckning för att inducera lungfibros i möss20. Luftvägarna instillation av bleomycin främjar först epitelial bortfall i alveolerna och rekrytering av inflammatoriska celler, inklusive makrofager, neutrofiler och monocyter21. Detta följs av vävnad remodeling i distala luftvägarna, basalmembranet omorganisation22,23 och extracellulär matrix (ECM) nedfall24. Effekterna av en enda bleomycin injektion är övergående, med fibros lösa efter 30 dagar i de flesta studier25. Använder både transplantatavstötning och xenograft-modeller, testade vi om förkonditionering luftvägarna av möss med bleomycin kan avsevärt öka ta LUAD celler i lungorna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Yale University.

1. Ställ in / beredning av reagensen.

  1. Bleomycin
    Försiktighet: Baserat på det globalt harmoniserade systemet (GHS) för klassificering och märkning av kemikalier, är bleomycin klassad som en GHS08-hälsofara.
    1. Förbereda bleomycin i en kemisk huva. Återsuspendera 15 U i 5 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    2. Alikvotens 100-200 µL av lösningen i glas flaskor och frysa dem vid-20 ° C för framtida bruk. Korrekt etikett rören med datum för resuspension. Använd inom 6 månader från detta datum.
      Obs: Varje mus stam har en annan känslighet till bleomycin26. Testa olika doser av bleomycin för varje mus stam rekommenderas. Mus-stammar och motsvarande doser av bleomycin används i representativa experiment listas i tabell 1.
  2. Möss
    1. Köp möss behövs för experimentet och Tillåt möss 7 dagar att acklimatisera före injektion. Utföra infusioner i biosäkerhet huva. Överföra djur inrymt i ett icke-BSL2 kompatibel rum till ett BSL2 rum med standardiserade institutionella förfaranden före bleomycin infusion. Injicera möss vid 6-8 veckors ålder.
      Försiktighet: Injicera möss efter institutionella riktlinjer för farliga agenser, biosäkerhet nivå 2 (BSL2) och IACUC godkännande.
      Obs: Möss köpt för representativa experiment listas i Tabell för material. Endast manliga möss har använts.
  3. Lung Cancer Cell linjer
    1. Kultur önskas cellinjer i deras respektive media. Innan injektioner, utföra kort tandem upprepa DNA profilering eller genetisk testning för att säkerställa korrekt cell linje identifiering. För att underlätta i vivo och ex vivo imaging, infektera cellinjer med ett lentivirus som uttrycker tymidinkinas, grönt fluorescerande protein (GFP) och luciferas fusion reporter27och sortera reporter positiva celler av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) före engraftment. Testa linjer för mycoplasma var 6 månader.
      1. Kultur H2030 mänskliga cancer cellinje som rekommenderas av tillverkaren med Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) med 10% fetalt bovint Serum (FBS), penicillin-streptomycin och amfotericin B.
      2. Kultur 368T1 murin cellinje (härlett från en KrasG12D; p53- / - mus) med Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) med 10% FBS, penicillin-streptomycin och amfotericin B.
      3. Kultur PC9 mänskliga cancer cellinje med 10% RPMI FBS, penicillin-streptomycin och amfotericin B.

2. bleomycin behandling

  1. Planera att injicera möss intratracheally med bleomycin 14 dagar före tumör cell engraftment.
  2. Tina bleomycin lager på is 2 h före injektion.
  3. När tinas, späd bleomycin i önskad arbetande koncentrationen (0,02 U/50 µL eller 0,005 U/50 µL) och hålla den på isen.
    Obs: Koncentrationen av bleomycin beror på mus stammen används för experiment (tabell 1). Titrering av bleomycin i möss bör utföras för att fastställa optimal dos.
  4. Förbereda anestesi genom spädning ketamin och xylazin till en slutlig koncentration på 10 mg/mL och 1 mg/mL, respektive, med en 1 mL spruta och 27 G nål, söva varje mus genom att injicera intraperitonealt ketamin/xylazin lösning 100/10 mg/kg respektive.
  5. Övervaka andningen av möss och anställa en tå nypa. Bekräfta rätt anesthetization när mus inte svarar på tå nypa. Applicera vet salva på ögon att förhindra torrhet under anestesi.
  6. Plats 1 mus samtidigt på en intubation plattform genom att hänga sina framtänder med ryggen mot plattformen.
  7. Belysa det övre delen av bröstet med en fiberoptiska illuminator hjälper med visualisering av luftstrupen. Öppna munnen på musen och dra tungan ut försiktigt med steril platt peang.
  8. Använd en intravenös kateter utan nålen för att undvika att blockera andning. Placera katetern över det vita ljuset som avges från öppnandet av luftstrupen.
  9. För in katetern i luftstrupen tills toppen av katetern når framtänderna. Bekräfta rätt placering av katetern i luftstrupen genom att visualisera det vita ljuset som skiner igenom öppningen av katetern i munnen.
  10. Med pipett fördela 50 µL av bleomycin eller fordon (PBS) direkt i katetern att säkerställa att hela volymen inhaleras. Utför det här steget under sterila förhållanden.
  11. Om katetern är korrekt isatt, kommer musen omedelbart Inhalera innehållet i katetern. Vänta några sekunder tills hela volymen färdas ner katetern. Sedan ta bort katetern från luftstrupen och släng i 10% blekmedel lösning.
    Obs: Den genomsnittliga tiden per mus steg 2,7-2.11 är ca 5 min.
  12. Om musen inte är andas in vätskan, noga övervaka andning och justera katetern position. Om musen slutar andas, omedelbart ta bort katetern och låt musen för att återuppta andningen normalt innan du åter sätter in katetern.
  13. Placera den injicerade mus på en IACUC godkända värmedyna på ryggen på en plan yta för återvinning. Hela proceduren tar 10 min per mus. Returnera inte ett djur som har genomgått injektion till företaget av andra djur tills återhämtat sig helt.
  14. Placera ett ”farliga kemiska används” kort på buren för 24 h.

3. övervakning möss efter Intubation

  1. Övervaka möss för andnöd omedelbart efter intubation och sedan varje 15 min tills möss som vaknar från anestesi. Lämna inte möss utan uppsikt tills de har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning.
  2. Injicera ketoprofen (5 mg/kg) intraperitonealt för att lindra smärta.
  3. Undersöka möss 24 h post intubation och 3 gånger i veckan för tecken på sjuklighet.
  4. Föra ett register över dagen för proceduren, identifiering av djur, typ av förfarande, typ av bedövningsmedel och postoperativ övervakning observationer med gånger.
  5. Övervaka möss för viktminskning, andnöd, beteendemässiga avvikelser och en kropp villkoret Poäng < 2 (segmentering av kotpelaren uppenbart/dorsala bäckenbenet är påtaglig) varannan vecka efter injektion av bleomycin.
  6. Euthanize möss under andnöd eller möss som har upplevt 15% förlust av kroppsmassa av CO2 eller ketamin/xylazin följt av cervikal dislokation. Bekräfta dödshjälp genom att utföra palpation för andnings aktivitet.

4. engraftment av lunga adenokarcinom cellinjer.

Obs: Utföra engraftment av celler 14 dagar efter injektion av bleomycin (steg 2.1).

  1. Tillåta celler att växa i 75 cm2 kolvar ostört i 3 dagar före dagen för injektion med motsvarande media som anges i steg 1.3.
    Obs: De bör vara 80% konfluenta på dagen av injektion (vilket motsvarar 2-3 x 106 i varje kolv beroende på det cell fodrar).
  2. Tvätta cellerna växer på 75 cm2 kolvar med 5 mL PBS i rumstemperatur.
  3. Aspirera PBS och tillsätt 1,5 mL trypsin till cellerna och inkubera cellerna vid 37 ° C tills cellerna lossa (vanligtvis 2-5 min).
    Obs: Vi rekommenderar att du kontrollerar varje 2 min för cell avskildhet från plasten av enkel visualisering av botten av kolven eller under ett ljusmikroskop. Inte överstiger 5 minuters inkubation med trypsin.
  4. Neutralisera trypsin genom att lägga till 4 mL av media som innehåller 10% FBS (samma media som steg 4.1). Samla in cellerna i ett 15 mL rör och centrifugera det 200 x g under 3 minuter vid rumstemperatur.
  5. Aspirera media och resuspendera cellpelleten i 5 mL PBS att tvätta cellerna. Centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 min i rumstemperatur till pellet celler. Upprepa detta 1 gång.
  6. Aspirera PBS och återsuspendera pelleten i 1,5 mL PBS per kolv.
  7. Blanda 50 µL av cell blandning med 50 µL av trypan blå och räkna cellerna använder en Cell Counter/Hemocytometer kammare28.
  8. Förbered cellsuspension genom att späda ut cellerna i PBS att injicera 1 x 105 celler (eller andra belopp som anges) i 50 µL per mus. Hålla cellerna på is före injektion.
    Obs: Laga minst två gånger mer celler för injektion för att undvika att köra av cellsuspension.
  9. Förbereda anestesi genom spädning ketamin och xylazin till en slutlig koncentration på 10 mg/mL och 1 mg/mL, respektive, med en 1 mL spruta och 27 G nål, söva varje mus genom att injicera intraperitonealt ketamin/xylazin lösning 100/10 mg/kg respektive.
  10. Övervaka andningen av möss och anställa en tå nypa. Bekräfta rätt anesthetization när mus inte svarar på tå nypa. Applicera vet salva på ögon att förhindra torrhet under anestesi.
  11. Plats 1 mus samtidigt på en intubation plattform genom att hänga sina framtänder med ryggen mot plattformen.
  12. Belysa det övre delen av bröstet med en fiberoptiska illuminator hjälper med visualisering av luftstrupen.
  13. Att resuspendera cellerna försiktigt med p200 pipett för att se till att de inte bildar klumpar. Öppna munnen på musen och dra tungan ut försiktigt med steril platt peang.
  14. Använd en intravenös kateter med nålen bort för att undvika att blockera andning. Placera katetern över det vita ljuset som avges från öppnandet av luftstrupen.
  15. För in katetern i luftstrupen tills toppen av katetern når framtänderna. Bekräfta rätt placering av katetern i luftstrupen genom att visualisera det vita ljuset som skiner igenom öppningen av katetern i munnen.
  16. Med pipett dispensera 50 µL av celler direkt in katetern att säkerställa att hela volymen inhaleras. Utför det här steget under sterila förhållanden.
    Obs: Om katetern är korrekt isatt, musen kommer omedelbart Inhalera innehållet i katetern.
  17. Vänta några sekunder tills hela volymen färdas ner katetern, och sedan ta bort katetern från luftstrupen och sälja i 10% blekmedel lösning.
  18. Om musen inte är andas in vätskan, noga övervaka andning och justera katetern position. Om musen slutar andas, omedelbart ta bort katetern och låt musen för att återuppta andningen normalt innan du åter sätter in katetern.
    Obs: Den genomsnittliga tiden per mus steg 4.11-4.18 är ca 5 min.
  19. Placera den injicerade mus på en IACUC godkända värmedyna på ryggen på en plan yta för återvinning.
    Obs: Hela förfarandet tar 10 min per mus. Returnera inte ett djur som har genomgått injektion till företaget av andra djur tills återhämtat sig helt.
  20. Raka området hela rib båda ventralt och dorsalt B6129SF1/J och andra musen stammar med mörkt hår med en rakapparat före imaging.
  21. 2-3 min efter cell injektionen, injicera 100 µL luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) med hjälp av en insulin nål. Alternativa ögat används för injektion varje bildsession.
  22. Efter minst 2 min, placera upp till 5 möss i ett djurs Mareld imager i dorsala koordinationsrubbning position och förvärva en ventrala bild med luminiscens inställningar29.
  23. Justera upplösning och känslighet inställningar för att mäta luminiscens av en given cell fodrar under Kontrollpanelen. För de flesta tillämpningar, börja med 3 min (eller ”Auto” om mättad), binning = Medium (4), F/Stop = 1, synfält = D, angående höjd = 1,50.
    Obs: Om injektionen lyckas luminiscens signal detekteras i övre bröstet, i en lunga eller båda lungorna.
  24. Vänd möss på sternala koordinationsrubbning position och förvärva en dorsal bild som ovan.
    Obs: Om cell injektionen inte utförs på rätt sätt, kan celler kluster vid ingången av luftstrupen eller i nacken.
  25. Injicera ketoprofen 5 mg/kg intraperitonealt för att lindra smärta.
  26. Flytta möss tillbaka till sin bur och placera ett ”BSL-2 Agent används” kort på buren.
  27. Övervaka möss för andnöd omedelbart efter intubation och sedan varje 15 min tills möss som vaknar från anestesi. Lämna inte möss utan uppsikt tills de har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning.
  28. Undersöka möss 24 h post intubation och tre gånger i veckan för tecken på sjuklighet.
  29. Föra register i Loggboken på dagen för proceduren, identifiering av djur, typ av förfarande, typ av bedövningsmedel och postoperativ övervakning observationer och tider.
  30. Övervaka möss för viktminskning, andnöd, beteendemässiga avvikelser och en kropp villkoret Poäng < 2 (segmentering av kotpelaren uppenbart/dorsala bäckenbenet är påtaglig) varannan vecka efter inokulering av bleomycin.
    Obs: Möss med lungtumörer kan uppvisa luftvägsirritation, viktminskning, kakexi eller döden.
  31. Euthanize möss under andnöd eller möss som har upplevt 15% förlust av kroppsmassa av CO2 eller ketamin/xylazin följt av cervikal dislokation om samlande vävnader. Bekräfta dödshjälp genom att utföra palpation för andnings aktivitet.

5. övervakning av tumörtillväxt av Mareld Imaging

  1. Upprepa avbildning av mössen på dag 3 efter engraftment och veckan därefter.
  2. Söva möss genom att injicera ketamin/xylazin (enligt beskrivningen i steg 2,4-2,5) eller inhalerade isofluran (2%). Övervaka andning av möss och anställa en tå nypa att bekräfta rätt anesthetization. Applicera vet salva på ögon att förhindra torrhet under anestesi.
  3. Raka området hela rib båda ventralt och dorsalt B6129SF1/J och andra musen stammar med mörkt hår med en rakapparat före imaging.
  4. När mössen är under narkos, injicera 100 µL luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) med hjälp av en insulin nål. Vänta 2 min. suppleant ögat används för injektion varje bildsession.
  5. Placera möss i kameran och förvärva dorsala och ventrala bilder enligt beskrivningen i steg 4,22-4.24.
  6. Placera möss tillbaka i buren efter imaging, på ryggen på en plan yta för återvinning.
    Obs: Hela förfarandet tar 5 min per grupp 5 möss. Lämna inte möss utan uppsikt tills de har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning.
  7. Analysera bilderna med hjälp av imager/Mareld analys programvara.
    1. Välj de lämpliga bilderna och läsa in dem som en grupp i programvaran Mareld analys.
    2. Klicka på ROI-verktyg | square att lägga till en fyrkantig region av intresse (ROI). Placera ROI över övre bröstet, som omfattar hela lungan bilden. Upprepa detta för varje mus bild.
    3. Högerklicka och välj Kopiera alla ROI funktionen att tillämpa samma ROI på alla bilder i gruppen och placera dem i övre delen av bröstkorgen av möss, både ventrala och dorsala visningar.
    4. I det övre vänstra hörnet i bildfönstret, Välj funktionen fotoner . Klicka på funktionen åtgärd control panel för att mäta ROIs. Kopiera och klistra in utdatatabellen som innehåller total flux (fotoner/s) i en programvara val att analysera data ytterligare.
    5. Normalisera dagliga ROI värdet av varje mus till sitt ROI värde mätt på dag 0.

6. vävnaderna isolering och bearbetning.

  1. Söva möss genom att injicera ketamin/xylazin (enligt beskrivningen i steg 2,4-2,5 eller av inhalerade isofluran (2%). Övervaka andning av möss och anställa en tå nypa. Bekräfta rätt anesthetization när mus inte svarar på tå nypa. Applicera vet salva på ögon att förhindra torrhet under anestesi.
  2. Injicera 100 µL luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) med hjälp av en insulin nål. Vänta 2 min.
  3. Bild möss efter steg 4,22-4.24 från detta protokoll.
  4. Injicera i det andra ögat från steg 6,2 en annan 100 µL av luciferin retro-orbitally med hjälp av en insulin nål före dödshjälp.
  5. Euthanize möss av intraperitoneal injektion av ketamin/xylazin (se steg 2,4 för detaljer) följt av cervikal dislokation om möss är under djup anestesi i enlighet med riktlinjer som tillhandahålls av IACUC. Bekräfta dödshjälp genom att utföra palpation för andnings aktivitet.
  6. Med hjälp av sterila kirurgiska sax göra ett huden snitt nedanför bröstbenet. Öppna muskellagrar längs membranet med kirurgisk sax och pincett och exponera brösthålan genom att skära genom bröstkorgen på antingen av de laterala sidorna att undvika interna bröstkorg artärerna.
  7. BEGJUTA musen genom att göra ett litet snitt i höger förmak i hjärtat och injicera 5 mL PBS genom vänster kammare. Färgen på lungvävnad går från rött till blek rosa-vit om blodgenomströmning görs ordentligt.
  8. Punktskatt lungorna från brösthålan noggrant genom att ta tag i matstrupen eller hjärtat med pincett. Försiktigt dra vävnaden och Använd kirurgisk sax att försiktigt skära anslutande vävnad att undvika punktering av lungvävnad. Bevara luftstrupen så mycket som möjligt för inflationen i lungan luftvägarna i ett senare steg.
  9. Tvätta lungorna genom att dränka och virvlande vävnaden 3 gånger i en 6 väl tallrik fylld med 3 mL PBS ta bort överflödigt blod.
  10. Placera lungcancer på locket 6 väl platta, och placera locket som innehåller vävnaden i självlysande kameran och förvärva en självlysande bild30.
    Obs: Vi rekommenderar att välja följande inställningar från ”förvärv Kontrollpanelen” ”synfält = A” och ”ämne höjd = 0,75 cm” och sedan ”automatisk exponering” att undvika att få mättade bilder.
  11. Punktskatter och bild andra organ, som gjort steg 6,9-6.10, där metastaser har identifierats genom luminiscens, till exempel hjärnan, levern, binjurarna, ben, lymfkörtlar, njur- eller mjälte31.
  12. BEGJUTA lungan med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD genom att sätta nålen i luftstrupen av musen. Lungorna kommer att blåsa om väl perfunderade.
    Varning: 4% PARAFORMALDEHYD är en giftig, en hälso fara GHS07 och GHS08.
  13. Överföra lungorna in i en 15 mL konisk med 5 mL 4% PARAFORMALDEHYD.
  14. Åtgärda lungorna eller andra vävnader genom ruvning vävnaden med 4% PARAFORMALDEHYD övernattning på 4 ° C i en skakande enhet vid 30-50 rpm.
  15. Bädda in lungor (eller andra vävnader) i paraffin eller optimal skärtemperatur sammansatta beroende på program32.
    Obs: Paraffin är den rekommenderade metoden att bevara strukturen lung och för Masson Trichrome och Hematoxylin-Eosin färgning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att öka effektiviteten i LUAD cancer cell engraftment i lungorna av möss, utvecklade vi ett protokoll det först pre villkorar luftvägarna använder bleomycin följt av ortotop tumör cell injektion (figur 1). Vi bekräftade att även när det ges till immunsupprimerade atymiska möss, bleomycin inducerad övergående fibros av dag 14 vilket framgår av förlust av luftvägarna arkitektur och ökad kollagen nedfall (figur 2). Brutto fibros hos dessa möss löst 50 dagar efter bleomycin injektion (figur 2, rätt panelerna) överensstämmer med tidigare studier24.

Baserat på dessa iakttagelser, rekonstituerades vi LUAD celler av olika ursprung i lungorna av olika mus stammar som hade betingats pre med en engångsdos av fordonet eller bleomycin 14 dagar före. Exempelvis levererades en suspension av LUAD celler från den etablerade mänskliga LUAD cellinje, H2030, intratracheally i lungorna hos atymiska möss. Efter 35 dagar hade möss som förbehandlats med bleomycin hög lung tumör börda som upptäcks av Mareld (figur 3A). Omvänt, i fordonet-behandlade djur, inga tumörer upptäcktes över samma tidsram (figur 3A). Lung tumör börda bekräftades av histologi efter obduktion. Lungor som förbehandlats med fordonet hade inga tecken på tumör knölar medan bleomycin förbehandlade lungor hade stor tumör knölar (figur 3B). Använder det här protokollet, ökat vi också engraftment av en annan mänsklig LUAD cell fodrar in atymiska möss (PC9; Figur 3 c) och en murin LUAD cellinje som injicerades i syngena immunkompetenta B6129SF1/J möss (figur 3D). De tidiga lesioner observerades i bleomycin förbehandlade syngena möss var främst grade 1 och 2 och var väl differentierad, som liknar tumörer som uppstår i situ från KrasG12D / +; p53- / - GEMMs33. Alla engrafted LUADs växte både i proximala och distala lungan (figur 3B, figur 3E, figur 3 g; asterisk (distala), star (proximala)). Etableringen av PDXs från lung cancer biospecimens (från biopsier eller kirurgiska resektioner) är relativt ineffektiv, även när mänskliga celler transplanteras subkutant till kraftigt nedsatt immunförsvar djur såsom nicka scid gamma (NSG) mus stam34. Utvärdera potentiella tillämpningen av vår metod på PDXs, vi också injiceras en mycket metastaserande cell delpopulation av H2030 cell linje, kallas H2030-BrM3 celler35, intratracheally i NSG möss som hade varit konditionerade med fordon eller bleomycin. Vi noterar att NSG möss kan vara mer mottagliga för de toxiska effekterna av bleomycin (inga data anges) och att en lägre dos än 0,02 enheter per mus är lämpligt när du arbetar med denna stam. Ändå ökade vårt protokoll också avsevärt engraftment och tumör börda i lungorna av NSG möss (figur 3F, figur 3 g).

Vi använde sedan detta protokoll för att testa engraftment andelen begränsa mängder celler med raden H2030 cell hos atymiska möss. Möss som förbehandlats med bleomycin injicerades med 5 x 105, 5 x 104eller 5 x 103 H2030 celler. 85,7-100% av möss utvecklat lungtumörer mellan 7 och 10 veckor på alla spädningar testas (tabell 2). Vi konstatera att engraftment av en relativt låg antalet tumörceller i lungan är möjlig om möss konditionerade med bleomycin. Sammantaget våra protokoll kan anpassas till flera stammar av möss och olika LUAD cell linje modeller att öka andelen engraftment cancer celler i lungorna från 0-16,7% till 71,4-100% (tabell 2).

Slutligen utvärdera förmodad kineticsen av LUAD cell utväxt och metastatisk spridning från bleomycin konditionerade lungor, kännetecknas vi beteendet för mycket metastaserande H2030-BrM3 celler med hjälp av våra protokoll. Efter ortotop engraftment i fordonet-behandlade möss, observerades tumör cell förslitningen av Mareld på dag 3 efter injektion och lung tumörtillväxt kunde inte detekteras därefter eller vid endpoint (dag 35) (figur 4A, figur 4B). Däremot upptäckte vi lung tumör utväxt i möss förbehandlade med bleomycin så tidigt som dag 7 efter injektion (figur 4A). Efter 39-57 dagar av tumör expansion samband sjuklighet och självlysande intensitet med hög lung tumör börda begränsningar analysen av disseminerad sjukdom (inga data anges). Därför avbildade vi metastaser i avlägsna organ ex vivo vid obduktion. I djur som hade lung tumör börda för 57 dagar, kan små lesioner också upptäckas i vävnader som hjärnan, levern, njurarna, binjurarna och ben bakbenen vid varierande frekvenser (figur 4 c). Därför drar vi slutsatsen att spontan disseminerad sjukdom i kliniskt relevanta platser kan genereras från denna ortotop metod.

Figure 1
Figur 1: metod med pre villkor lungorna för tumör cell engraftment. Schematisk bild av det protokoll som används. Lungskada utförs genom att injicera bleomycin intratracheally. LUAD celler injiceras sedan i luftstrupen av möss 14 dagar efter. Möss är därefter avbildade veckovis för Luminiscens monitor tumör engraftment, tillväxten och fjärrmetastaser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Bleomycin orsakar övergående lungfibros och ECM remodeling. Representativa bilder av Hematoxylin-Eosin (H & E) och Masson trikrom färgning av lungorna från fordonet och bleomycin behandlade möss 14 dagar efter injektion (topp av fibros) och på 51 dagar efter injektion (fibros upplösning) i avsaknad av tumör cell injektion. Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Lung engraftment av LUAD cellinjer i flera musmodeller är förhöjd hos möss förbehandlade med bleomycin. A) atymiska möss förbehandlade med fordon eller bleomycin injicerades med 5 x 105 H2030 celler. Relativa lung tumör börda på endpoint (dag 35 normaliserade till dag 0 efter injektion) ritas mätt med Mareld. För varje grupp visas en mus med median tumör börda. n = 6-7 möss per grupp. B) representant H & E bilder av lungorna förbehandlade med fordon eller bleomycin från A på dag 35. Asterisk = distala; Stjärnigt = proximala. C) atymiska möss behandlas liksom A injicerades med 1 x 105 PC9 celler. Tumör börda och representativa bilder mäts och visas som i A. n = 7 möss per grupp. D-E) B6129SF1/J möss förbehandlade med fordonet eller bleomycin injicerades med 1 x 105 368T1 KrasG12D / + p53- / - (KP T-icke Met) celler. Tumör börda, representativa bilder och H & Es mäts och skildras som i A och B. n = 7 möss per grupp. F-G) NSG möss förbehandlade med fordonet eller bleomycin injicerades med 1 x 105 H2030-BrM3 celler. Tumör börda, representativa bilder och H & Es (dag 9 och dag 10 efter injektion) mäts och visas som i A och B. n = 3-6 möss per grupp. Skalstapeln = 500 µm. infälld = hög förstoring av tumör cell rekonstituerades områden. Skalstapeln av inläggningar = 100 µm. p värden som beräknas av Mann-Whitney test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: LUAD celler rekonstituerades i bleomycin-behandlade möss metastasera till flera avlägsna organ. A) atymiska möss förbehandlade med fordon eller bleomycin injicerades med 5 x 105 H2030-BrM3 celler. Lung tumör börda mättes varje vecka med Mareld. Dorsala totala photon flux normaliserade till dag 0 visas. B) tumör börda av mareld i lungorna från A vid endpoint (dag 35 efter injektion). För varje grupp visas en mus med median tumör börda. n = 6-7 möss per grupp. C) representativa bilder av organ med påvisbara metastaser från samma mus vid obduktion (vänster). Tabell med angivna frekvenser av möss med metastaser i avlägsna organ vid endpoint (dag 39-57 efter engraftment) (höger). Ex-vivo organ med självlysande ljussignal över 1,5 x 104 fotoner / (SEK cm2 steradian) räknades som positiva metastas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mus-stam Enheter/mus
Atymiska 0,02
NSG 0,02
B6129SF1/J 0,005

Tabell 1: Lista över rekommenderade doser av bleomycin för mus stammar testade.

Mus-stam Cellinje Antalet celler injiceras % engraftment p -värde
Fordon Bleomycin
Atymiska H2030 5 x 105 0% (0/7) 100% (6/6) 0,0006
Atymiska H2030 5 x 104 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Atymiska H2030 5 x 103 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Atymiska PC-9 1 x 105 0% (0/7) 85,7% (6/7) 0.0023
NSG H2030-BrM3 1 x 105 16,7% (1/6) 100% (3/3) * 0.0476
B6129SF1/J 368T1 1 x 105 0% (0/7) 71,4% (5/7) * 0.0105

Tabell 2: Sammanfattande tabell över engraftment frekvensen (%) med hjälp av angivna mus stammar, cellinjer och cell nummer. Engraftment var fastställt i vivo luminiscens imaging och bekräftas av ex vivo imaging med histologi av vävnader mellan 37 och 50 dagar efter injektion. * Positiva engraftment bekräftades i vivo luminiscens på dag 10 efter injektionSonjs värden beräknas genom ensidig Fischers exakta test. n.a. = inte tillämpligt. nd = ej fastställt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Slående kliniska paralleller har dokumenterats mellan lungcancer och andra kroniska sjukdomar lung36. I synnerhet patienter med idiopatisk lungfibros (IPF) har en ökad förkärlek för utveckla lungcancer, och denna koppling är oberoende av rökning historia37,38. IPF kännetecknas av progressiv förstörelse av lung arkitektur och försämrad lungfunktion genom nedfall av ECM39. Även efter kirurgisk resektion har tidigt skede NSCLC patienter med samtidiga IPF en dålig resultatet40. De flesta NSCLC tumörer innehålla en fibrotisk komponent vid tidpunkten för diagnosen, och omfattningen av denna stromal reaktion korrelerar med dålig prognos18. Akut eller ihållande vävnadsskada från fibros kan öka incidensen av tumourigenesis på flera sätt. Exempelvis efter skada, kan processen för epitelial regenerering utvidga poolen av stamceller som är mottagliga för omvandling. Alternativt kan inflödet och funktion av olika immunceller hjälpa upprätta en immunsuppressiv mikromiljö, medan aktivering av myofibroblaster kan utsöndra tillväxtfaktorer eller insättning tumör-främja ECM. Således vår metod för förkonditionering lungorna med en fibros inducerande agent kan visa sig vara särskilt apt på studera effekter av lung cancer komorbiditet (t.ex. fibros) och modellering NSCLC subtyper, som är rika på extracellulära matrix och ett inflammatoriska stroma41.

Övergripande, vår metod avsevärt förbättrat engraftment av tumörceller injiceras i luftvägarna via luftstrupen. Denna iakttagelse gäller mus stammar med varierande grad av djurets. Andra metoder för tumör cell injektion i lungorna inkluderar svans ven injektion eller direkt injektion i lungparenkym via bröstkorgen. För det särskilda syftet att studera lung cancer cell tumorigenicitetsprov, är dessa metoder optimala, eftersom de förstnämnda kräver tumörceller att överleva i omlopp och extravasate innan utväxt (en process mer besläktad med metastaser i lungorna), medan den senare kan orsaka cellerna att läcka ut i pleura rymden snart efter injektionen (inga data anges). Båda metoderna kan blanda ihop loco-regionalt kvantifiering av lung cancer cell utväxt. Alternativt garanterar våra protokoll att seedade tumörceller lagras först i luftvägarna omges av lung stroma. Avgörande för framgång i detta protokoll, är korrekt intubation av möss, tolerabel dos bleomycin, och tidpunkten för luftvägarna förkonditioneringen i förhållande till tumör cell injektionen. Vi visar också att detta protokoll tillåter cellerna att därefter sprida till andra vävnader, inklusive hjärnan. Även om den sjuklighet som är associerad med lung tumör börda kan fortfarande begränsa omfattande karakterisering av avlägsen macrometastasis, kan detta tillvägagångssätt vara användbart att kvantifiera och studera cirkulerande tumörceller med ursprung från lungorna.

Trots fördelarna med den metod som beskrivs häri, kan flera tekniska variabler påverka engraftment ultimata effektivitet och övervakning av tumör progression. Först, det är väl dokumenterat att fibrotiska svar till bleomycin i möss är stam-beroende. Exempelvis är C57Bl/6 möss mer benägna att fibros jämfört med Balb/c möss42. Andra är känslighet för bleomycin kön och ålder beroende. Vår erfarenhet är kvinnor och yngre möss mer benägna att negativa effekter över hela protokollet. Detta kan begränsa uppkomst studier som kräver direkta jämförelser mellan manliga och kvinnliga, eller unga och gamla djur. Dessutom intratrakeal instillation av möss yngre än 7 veckor är tekniskt krävande och justeringar till kateterns storlek kan krävas. Tredje, bleomycin är giftigt och kan vara mutagena på grund av dess förmåga att inducera DNA raster. Det är viktigt att testa den tolerabla dosen bleomycin för varje mus stam innan du utför experimenten. I detta bevis på principen studie tillhandahåller vi föreslagna doser för hanmöss över olika stammar. Dessutom är möss med mörk päls mindre lämpliga för självlysande imaging på grund av låg vävnad penetration och maskering av självlysande signalen av pälsen. Depilating möss kan förbättra bilden mätningar, men alternativa metoder kan också användas som magnetisk resonanstomografi och fluorescerande bildåtergivning med sonder med lång våglängd såsom TdTomato eller Katushka43. Slutligen, potentiella immunogeniciteten hos ett givet reporter protein övervägas när du väljer en tumör upptäckt modaliteten för en given musmodell.

Bleomycin remodels distala lungorna av första skadliga alveolära typ 2 (AT2) celler som sedan regenererar i ett försök att reparera de alveoler44. Eftersom AT2 celler är en av de stora celltyper kan ge upphov till NSCLC, kan förkonditionering lungorna med bleomycin också ändra initiering och progression av tumörer uppstår i situ GEMMs. Andra typer av skador, inklusive influensa infektion13 eller naftalen instillation14, har visats öka engraftment av mänskliga och murina lung stam/stamceller. Särskilt, naftalen skador stam/stamceller celler i de bronkoalveolära korsningarna och ökar potentiellt tumör inledande i GEMMs45. Finjustera typ av skada och luftvägarna nisch riktade till rekonstituerades celltyper kan ytterligare optimera vår metod för att studera lung cancer organtransplantationer eller xenograft av olika ursprung. Slutligen föreslår vi att denna metod kan genomföras för standard generation av lungcancer PDXs. Andelen framgångsrika inrättandet av lungcancer PDXs från mänskliga biospecimens genom subkutan transplantation i NSG möss är relativt låg (30-40%)46,47. Ortotop tillväxten av PDXs kan inte bara öka denna framgång med begränsande mängder provbit (från mänskliga lungor), men också generera mer fysiologiskt relevanta villkor att testa farmakokinetiken och farmakodynamiken för lung cancer therapeutics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Denna studie har finansierats genom bidrag från National Cancer Institute (R01CA166376 och R01CA191489 till D.X. Nguyen) och Department of Defense (W81XWH-16-1-0227 till D.X. Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair - To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. -
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) -
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , pdb prot078261 (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, Suppl 2. S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).

Tags

Medicin fråga 136 lunga adenokarcinom ortotop musmodeller intratrakeal injektion bleomycin engraftment metastaser
Förkonditionering luftvägarna av möss med Bleomycin ökar effektiviteten i ortotop Lung Cancer Cell Engraftment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stevens, L. E., Arnal-Estapé,… More

Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter