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Medicine

ब्लीयामीसिन के साथ चूहों के एयरवेज पूर्व कंडीशनिंग Orthotopic फेफड़ों के कैंसर कोशिका Engraftment की क्षमता बढ़ जाती है

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/56650
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हम एक विधि का वर्णन करने के लिए काफी murine फेफड़ों में फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं के orthotopic engraftment पूर्व के द्वारा चोट के साथ वायुमार्ग कंडीशनिंग बढ़ाने के लिए । इस दृष्टिकोण भी फेफड़ों microenvironment, मेटास्टेटिक प्रसार, फेफड़ों के कैंसर सह रुग्णता के भीतर stromal बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, और अधिक कुशलता से रोगी व्युत्पंन xenografts उत्पंन करने के लिए ।

Abstract

फेफड़ों के कैंसर एक घातक उपचार दुर्दम्य रोग है कि जैविक रूप से विषम है । को समझने और प्रभावी ढंग से वक्ष द्रोह के पूर्ण नैदानिक स्पेक्ट्रम का इलाज, अतिरिक्त पशु मॉडल है कि विविध मानव फेफड़ों के कैंसर उपप्रकार और चरणों दोहराऊंगा कर सकते है की जरूरत है । Allograft या xenograft मॉडल बहुमुखी है और vivo मेंtumorigenic क्षमता के ठहराव सक्षम, या तो murine या मानव मूल के घातक कोशिकाओं का उपयोग कर । हालांकि, पहले फेफड़ों के कैंसर कोशिका engraftment के तरीकों का वर्णन गैर-शारीरिक साइटों में किया गया है, जैसे चूहों की पार्श्व, फेफड़ों में कोशिकाओं के orthotopic प्रत्यारोपण की अक्षमता के कारण. इस अध्ययन में, हम फाइब्रोसिस उत्प्रेरण एजेंट ब्लीयामीसिन के साथ चूहों के वायुमार्ग से पूर्व कंडीशनिंग द्वारा orthotopic फेफड़ों के कैंसर सेल engraftment को बढ़ाने के लिए एक विधि का वर्णन । एक सबूत के अवधारणा प्रयोग के रूप में, हम चूहों के विभिंन उपभेदों में, या तो माउस या मानव स्रोतों से प्राप्त फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता उपप्रकार के ट्यूमर कोशिकाओं engraft के लिए इस दृष्टिकोण लागू किया । हम प्रदर्शित करते है कि ट्यूमर सेल इंजेक्शन से पहले ब्लीयामीसिन के साथ एयरवेज घायल 0-17% से 71-100% करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के engraftment बढ़ जाती है । गौरतलब है कि इस विधि से फेफड़ों के ट्यूमर की घटना और बाद में विभिन्न मॉडलों और माउस उपभेदों का उपयोग कर आगे बढ़ना बढ़ाया । इसके अलावा, engrafted फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को प्रासंगिक दूर अंगों में फेफड़ों से प्रसार । इस प्रकार, हम एक प्रोटोकॉल है कि स्थापित करने और कोशिकाओं या नमूना की मात्रा सीमित और मात्रात्मक शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेटिंग्स में फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं की tumorigenic क्षमता का आकलन करने के साथ फेफड़ों के कैंसर के नए orthotopic मॉडल बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदान .

Introduction

फेफड़ों के कैंसर का प्रमुख कारण है कैंसर से संबंधित मौतों दुनिया भर में1। फेफड़ों के कैंसर के साथ रोगियों को अंततः दूर के अंगों के लिए मेटास्टेसिस से शिकार, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए विशेष रूप से, जिगर, अधिवृक्क ग्रंथियों, और हड्डियों2,3,4. वक्ष द्रोह पारंपरिक रूप से छोटे कोशिका फेफड़ों के कैंसर (SCLC) या गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC)5के रूप में वर्गीकृत किया गया है । NSCLC सबसे अक्सर निदान द्रोह है और अलग ऊतकवैज्ञानिक उपप्रकार, फेफड़े ग्रंथिकर्कटता (LUAD) और फेफड़ों स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (LUSC)6सहित में विभाजित किया जा सकता है । जीनोमिक मानव प्राथमिक फेफड़ों के कैंसर के विश्लेषण से पता चला है कि ट्यूमर एक दिया histotype के भीतर भी विविध आणविक perturbations व्यक्त कर सकते हैं, आगे उनके अलग नैदानिक प्रगति और रोगी रोग का निदान करने के लिए योगदान । उल्लेखनीय विविधता फेफड़ों के कैंसर के तर्कसंगत डिजाइन, पूर्व नैदानिक परीक्षण, और प्रभावी चिकित्सकीय रणनीतियों के कार्यांवयन के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । नतीजतन, वहां एक के लिए पथीय प्रयोगात्मक फेफड़ों के कैंसर के मॉडलों की प्रदर्शनियों का विस्तार करने के लिए विविध सेलुलर मूल, आणविक उपप्रकार, और इस रोग के चरणों का अध्ययन करने की आवश्यकता है ।

विभिंन तरीकों का उपयोग कर पशु मॉडल के लिए vivo मेंफेफड़ों के कैंसर का अध्ययन किया गया है, अपने स्वयं के फायदे और नुकसान के आधार पर जैविक प्रश्न (ओं) ब्याज की । आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) एक दिया जनक सेल प्रकार में विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन को लक्षित कर सकते हैं, ट्यूमर में जिसके परिणामस्वरूप एक असुरक्षित मेजबान7के भीतर प्रगति । जबकि अत्यंत शक्तिशाली और नैदानिक रूप से प्रासंगिक, विलंबता, परिवर्तनशीलता, और/या फेफड़ों के ट्यूमर GEMMs के साथ जुड़े रुग्णता कुछ मात्रात्मक माप और दूर के अंगों में देर चरण मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है8. एक पूरक दृष्टिकोण allograft मॉडल, जिससे फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं का उपयोग होता है, या तो सीधे एक माउस ट्यूमर से प्राप्त या संस्कृति में सेल लाइनों की स्थापना के रूप में पहले व्युत्पंन, syngeneic मेजबान में फिर से शुरू कर रहे हैं । Analogously, फेफड़ों के कैंसर xenografts मानव कोशिका लाइनों या रोगी व्युत्पंन ट्यूमर नमूने से स्थापित कर रहे हैं । मानव कोशिका रेखा xenografts या रोगी व्युत्पंन xenografts (PDXs) आम तौर पर प्रतिरक्षा चूहों में बनाए रखा है और इसलिए पूर्ण प्रतिरक्षा-निगरानी9बाधा । इस खामी के बावजूद, वे एक एवेंयू प्रदान करने के लिए मानव के लिए सीमित मात्रा में प्रचार के लिए और मानव कैंसर की कोशिकाओं है, जो GEMM ट्यूमर से अधिक जटिल जीनोमिक विचलन के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना vivo में मौलिक अध्ययन ।

allografts और xenografts का एक उपयोगी गुण यह है कि वे पारंपरिक सीमित सेल कमजोर करने की परख के लिए उत्तरदायी हैं, एक घातक कोशिका जनसंख्या10के भीतर ट्यूमर की शुरूआत कोशिकाओं (TICs) की आवृत्ति यों तो कार्यरत हैं. इन प्रयोगों में, कोशिकाओं की एक परिभाषित संख्या चमड़े के नीचे जानवरों के पार्श्व में इंजेक्शन और TICs की आवृत्ति ट्यूमर ले दर के आधार पर अनुमान लगाया जा सकता है । चमड़े के नीचे ट्यूमर हालांकि और अधिक hypoxic11 हो सकता है और फेफड़ों के ट्यूमर microenvironment के प्रमुख शारीरिक बाधाओं मॉडल नहीं हो सकता । Intratracheal चूहों के फेफड़ों में उपकला स्टेम या जनक कोशिकाओं के वितरण फेफड़े के उत्थान और airway स्टेम सेल जीव विज्ञान12अध्ययन करने के लिए एक विधि है । हालांकि, इस तकनीक से engraftment दर अपेक्षाकृत कम हो सकता है, जब तक फेफड़ों पहले चोट के शारीरिक रूपों के अधीन हैं, जैसे वायरल संक्रमण13,14। भड़काऊ stromal कोशिकाओं और/या फेफड़ों के तहखाने झिल्ली के विघटन से समर्थन प्रासंगिक स्टेम सेल बाहर एयरवेज में15niches में प्रत्यारोपित कोशिकाओं की अवधारण में सुधार हो सकता है । फाइब्रोसिस उत्प्रेरण एजेंट भी पूर्व हालत फेफड़ों प्रेरित pluripotent कोशिकाओं के engraftment को बढ़ाने के लिए कर सकते हैं16 और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं17. क्या airway चोट के समान रूपों engraftment दर, ट्यूमर शुरू करने की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं, और फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं की वृद्धि अभी तक व्यवस्थित मूल्यांकन किया जाना है ।

इस अध्ययन में, हम एक विधि का वर्णन orthotopic फेफड़ों के कैंसर कोशिका engraftment की दक्षता बढ़ाने के लिए, चोट के साथ चूहों के फेफड़ों के पूर्व कंडीशनिंग द्वारा. LUAD इन कैंसर का एक महत्वपूर्ण सबसेट के साथ बाहर एयरवेज में उठता है एक fibrotic स्ट्रोमा18 कि अक्सर गरीब पूर्वानुमान19के साथ संबद्ध विकासशील । ब्लीयामीसिन, एक प्राकृतिक nonribosomal संकर पेप्टाइड-polyketide, बड़े पैमाने पर चूहों20में फेफड़े की फाइब्रोसिस पैदा करने के लिए उपयोग किया गया है । ब्लीयामीसिन के Airway जगाकर मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल और monocytes21सहित भड़काऊ कोशिकाओं के alveoli और भर्ती में उपकला उदासीनता को बढ़ावा देता है । यह बाहर एयरवेज, तहखाने झिल्ली पुनर्गठन22,23 और extracellular मैट्रिक्स (ECM)24साठा में ऊतक remodeling द्वारा पीछा किया जाता है । एक एकल ब्लीयामीसिन इंजेक्शन के प्रभाव सबसे अधिक अध्ययन25में 30 दिनों के बाद फाइब्रोसिस संपति के साथ क्षणिक हैं । दोनों allograft और xenograft मॉडल का प्रयोग, हम परीक्षण अगर पूर्व ब्लीयामीसिन के साथ चूहों के वायुमार्ग कंडीशनिंग काफी फेफड़ों में LUAD कोशिकाओं की दर में वृद्धि कर सकता है ।

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Protocol

सभी प्रयोगों को येल विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता था ।

1. रिएजेंटों को तैयार/

  1. ब्लीयामीसिन
    चेतावनी: विश्व स्तर पर संगत प्रणाली (वर्गीकरण और रसायनों के लेबलिंग की GHS) के आधार पर, ब्लीयामीसिन एक GHS08 स्वास्थ्य के लिए खतरा के रूप में वर्गीकृत है ।
    1. एक रासायनिक हुड में ब्लीयामीसिन तैयार करें । बाँझ फॉस्फेट के 5 मिलीलीटर में 15 यू reसस्पेंड (पंजाब) खारा ।
    2. Aliquot 100-200 कांच शीशियों में समाधान के µ एल और उंहें फ्रीज में-20 ° c भविष्य के उपयोग के लिए । ठीक से resuspension की तारीख के साथ ट्यूबों लेबल । इस तिथि से 6 माह के अंदर प्रयोग करें ।
      नोट: प्रत्येक माउस तनाव26ब्लीयामीसिन के लिए एक अलग संवेदनशीलता है । प्रत्येक माउस तनाव के लिए ब्लीयामीसिन के विभिंन खुराक परीक्षण की सिफारिश की है । माउस उपभेदों और प्रतिनिधि प्रयोगों में इस्तेमाल किया ब्लीयामीसिन की इसी खुराक 1 तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
  2. चूहों
    1. प्रयोग के लिए आवश्यक चूहों की खरीद और इंजेक्शन से पहले acclimate करने के लिए चूहों 7 दिनों की अनुमति. एक सुरक्षा डाकू में अर्की प्रदर्शन । हस्तांतरण ब्लीयामीसिन अर्क से पहले मानक संस्थागत प्रक्रियाओं का उपयोग कर एक BSL2 कमरे में एक गैर BSL2 अनुरूप कमरे में स्थित पशुओं । उंर के 6-8 सप्ताह में चूहों इंजेक्षन ।
      चेतावनी: खतरनाक एजेंटों के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों के बाद चूहों इंजेक्षन, सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) और IACUC अनुमोदन.
      नोट: प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए खरीदा चूहों सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं. केवल नर चूहों का प्रयोग किया गया है ।
  3. फेफड़ों के कैंसर सेल लाइंस
    1. संस्कृति अपने संबंधित मीडिया में सेल लाइनों वांछित । इंजेक्शन से पहले, लघु मिलकर दोहराने डीएनए रूपरेखा या आनुवंशिक परीक्षण करने के लिए उचित सेल लाइन पहचान सुनिश्चित करते हैं । vivo और ex vivo इमेजिंग में सुविधा के लिए, एक lentivirus एक्सप्रेस thymidine कळेनासे, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और luciferase फ्यूजन रिपोर्टर27के साथ सेल लाइनों को संक्रमित, और प्रतिदीप्ति द्वारा क्रमबद्ध रिपोर्टर सकारात्मक कोशिकाओं engraftment करने से पहले सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) । माइकोप्लाज्मा के लिए परीक्षण लाइनों हर 6 महीने ।
      1. संस्कृति H2030 मानव कैंसर सेल लाइन के रूप में निर्माता द्वारा अनुशंसित रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम (RPMI) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन-streptomycin के साथ, और amphotericin बी का उपयोग कर
      2. कल्चर 368T1 murine सेल लाइन (एक KrasG12D;p ५३-/- माउस से व्युत्पंन) Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) का उपयोग कर 10% FBS, पेनिसिलिन-streptomycin, और amphotericin बी के साथ ।
      3. संस्कृति PC9 मानव कैंसर सेल लाइन 10% FBS, पेनिसिलिन-streptomycin, और amphotericin बी के साथ RPMI का उपयोग कर ।

2. ब्लीयामीसिन उपचार

  1. ब्लीयामीसिन के साथ चूहों intratracheally इंजेक्षन करने के लिए योजना 14 दिन से पहले ट्यूमर सेल engraftment.
  2. इंजेक्शन से पहले आइस 2 एच पर गल ब्लीयामीसिन स्टॉक ।
  3. एक बार गल, वांछित काम एकाग्रता (०.०२ u/50 µ l या ०.००५ u/50 µ l), और यह बर्फ पर रखने के लिए ब्लीयामीसिन पतला ।
    नोट: ब्लीयामीसिन की एकाग्रता प्रयोग (तालिका 1) के लिए इस्तेमाल माउस तनाव पर निर्भर करता है । चूहों में ब्लीयामीसिन की अनुमापन इष्टतम खुराक निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए.
  4. कमजोर ketamine और xylazine द्वारा संज्ञाहरण तैयार 10 मिलीग्राम/एमएल और 1 मिलीग्राम/एमएल, के अंतिम एकाग्रता के लिए क्रमशः, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और 27 जी सुई का उपयोग कर, anesthetize प्रत्येक माउस इंजेक्शन द्वारा intraperitoneally ketamine/xylazine समाधान पर 100/10 मिलीग्राम/ क्रमशः.
  5. चूहों की साँस लेने की निगरानी और एक पैर की अंगुली चुटकी रोजगार. उचित anesthetization की पुष्टि करें जब माउस को पैर की अंगुली चुटकी का जवाब नहीं है । संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें ।
  6. मंच के खिलाफ अपनी पीठ के साथ अपने सामने दांत लटक द्वारा एक इंटुबैषेण मंच पर एक समय में 1 माउस प्लेस ।
  7. श्वासनली के दृश्य के साथ मदद करने के लिए एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक का उपयोग कर ऊपरी छाती रोशन । माउस का मुंह खोलो और जीभ बाहर धीरे बाँझ फ्लैट संदंश के साथ खींचो ।
  8. श्वास अवरुद्ध करने से बचने के लिए सुई के बिना एक नसों कैथेटर का उपयोग करें । श्वासनली के उद्घाटन से उत्सर्जित सफेद प्रकाश पर कैथेटर की स्थिति ।
  9. कैथेटर के ऊपर सामने दांत तक पहुँच जाता है जब तक श्वासनली में मुंह में कैथेटर के उद्घाटन के माध्यम से चमक सफेद प्रकाश visualizing द्वारा श्वासनली में कैथेटर की उचित स्थान की पुष्टि करें ।
  10. एक पिपेट का प्रयोग, ब्लीयामीसिन या वाहन (पंजाब) के ५० µ एल वितरण सीधे कैथेटर में सुनिश्चित करें कि पूरी मात्रा सांस है । बाँझ शर्तों के तहत इस चरण को निष्पादित करें ।
  11. कैथेटर सही ढंग से डाला जाता है, तो माउस कैथेटर की सामग्री तुरंत साँस लेगा । कुछ सेकंड रुको जब तक पूरे मात्रा कैथेटर नीचे यात्रा । फिर श्वासनली से कैथेटर निकालें और 10% ब्लीच समाधान में निपटारा ।
    नोट: चरण 2.7-2.11 के प्रति माउस औसत समय 5 मिनट के आसपास है ।
  12. अगर चूहे तरल श्वास नहीं है, ध्यान से श्वास की निगरानी और कैथेटर स्थिति को समायोजित । यदि माउस सांस लेना बंद कर देता है, कैथेटर तुरंत निकालें और माउस को फिर से डालने से पहले सामांय श्वास फिर से शुरू करने की अनुमति दें ।
  13. एक फ्लैट की सतह पर वसूली के लिए उनकी पीठ पर एक IACUC अनुमोदित हीटिंग पैड पर इंजेक्शन माउस रखें । पूरी प्रक्रिया माउस प्रति 10 मिनट लगेगा । एक जानवर है कि अंय जानवरों की कंपनी को इंजेक्शन से आया है वापस नहीं जब तक पूरी तरह से बरामद किया ।
  14. 24 ज के लिए पिंजरे पर एक "उपयोग में खतरनाक रासायनिक" कार्ड प्लेस ।

3. निगरानी चूहों पोस्ट-इंटुबैषेण

  1. श्वसन संकट के लिए चूहों की निगरानी तुरंत इंटुबैषेण के बाद और फिर हर 15 मिनट तक चूहों संज्ञाहरण से जाग. जब तक वे स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना फिर से प्राप्त किया है चूहों को उपेक्षित मत छोड़ो ।
  2. दर्द कम करने के लिए सुई ketoprofen (5 मिलीग्राम/intraperitoneally ।
  3. चूहों की जांच 24 एच पोस्ट इंटुबैषेण और रुग्णता के किसी भी लक्षण के लिए एक सप्ताह में 3 बार ।
  4. प्रक्रिया, पशु पहचान, प्रकार की कार्यविधि, संवेदनाहारी का प्रकार, और समय के साथ पोस्ट-ऑपरेटिव मॉनिटरिंग प्रेक्षणों की तिथि का रिकॉर्ड रखें ।
  5. वजन घटाने के लिए चूहों की निगरानी, श्वसन संकट, व्यवहार असामान्यताओं, और एक शरीर की स्थिति स्कोर < 2 (कशेरुका कॉलम के विभाजन स्पष्ट/पृष्ठीय श्रोणि हड्डियों स्पष्ट कर रहे हैं) ब्लीयामीसिन के द्वि-साप्ताहिक निम्न इंजेक्शन.
  6. श्वसन संकट या चूहों कि सह द्वारा शरीर द्रव्यमान के 15% नुकसान का अनुभव किया है के तहत चूहों Euthanize2 या ketamine/xylazine द्वारा गर्भाशय ग्रीवा के बाद विस्थापन । टटोलने का कार्य श्वसन गतिविधि के लिए आयोजित करके इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।

4. फेफड़ों की Engraftment ग्रंथिकर्कटता सेल लाइंस ।

नोट: ब्लीयामीसिन (चरण २.१) के इंजेक्शन के बाद 14 दिनों के कक्षों की engraftment निष्पादित करें ।

  1. कोशिकाओं ७५ सेमी2 में बढ़ने के लिए अनुमति दें 3 दिन के लिए परेशान कुप्पी के रूप में इसी मीडिया के साथ इंजेक्शन के दिन से पहले १.३ कदम में कहा गया है ।
    नोट: वे इंजेक्शन के दिन ८०% धाराप्रवाह होना चाहिए (जो प्रत्येक कुप्पी में 2-3 x 106 सेल लाइन के आधार पर करने के लिए मेल खाती है) ।
  2. कमरे के तापमान पर पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ ७५ सेमी2 कुप्पी पर बढ़ रही कोशिकाओं को धो लें ।
  3. महाप्राण पंजाबियों और कोशिकाओं को trypsin की १.५ मिलीलीटर जोड़ने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को अलग (आम तौर पर 2-5 मिनट) तक कोशिकाओं ।
    नोट: हम कुप्पी के नीचे या एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सरल दृश्य द्वारा प्लास्टिक से सेल टुकड़ी के लिए हर 2 मिनट की जाँच की सलाह देते हैं. trypsin के साथ मशीन के 5 मिनट से अधिक नहीं है ।
  4. 10% FBS युक्त मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बेअसर (४.१ कदम के रूप में एक ही मीडिया) । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करने और यह २०० एक्स जी पर कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  5. महाप्राण मीडिया और कोशिकाओं को धोने के लिए पंजाब के 5 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए २०० एक्स जी में कोशिकाओं को गोली कोशिकाओं के केंद्रापसारक । इस 1 बार दोहराएं ।
  6. पंजाबियों महाप्राण और कुप्पी के प्रति पंजाब के १.५ मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  7. मिश्रण ५० trypan नीले रंग के ५० µ एल के साथ सेल मिश्रण के µ एल और गिनती कोशिकाओं का उपयोग कर एक सेल काउंटर/Hemocytometer चैंबर28।
  8. ५० µ एल प्रति माउस में 1 x 105 कोशिकाओं (या संकेत दिया अंय राशि) इंजेक्षन करने के लिए पंजाब में कोशिकाओं कमजोर द्वारा सेल निलंबन की तैयारी करें । इंजेक्शन से पहले बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।
    नोट: सेल सस्पेंशन से बाहर चलने से बचने के लिए इंजेक्शन के लिए न्यूनतम दो गुना अधिक सेल तैयार करें ।
  9. कमजोर ketamine और xylazine द्वारा संज्ञाहरण तैयार 10 मिलीग्राम/एमएल और 1 मिलीग्राम/एमएल, के अंतिम एकाग्रता के लिए क्रमशः, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और 27 जी सुई का उपयोग कर, anesthetize प्रत्येक माउस इंजेक्शन द्वारा intraperitoneally ketamine/xylazine समाधान पर 100/10 मिलीग्राम/ क्रमशः.
  10. चूहों की साँस लेने की निगरानी और एक पैर की अंगुली चुटकी रोजगार. उचित anesthetization की पुष्टि करें जब माउस को पैर की अंगुली चुटकी का जवाब नहीं है । संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें ।
  11. मंच के खिलाफ अपनी पीठ के साथ अपने सामने दांत लटक द्वारा एक इंटुबैषेण मंच पर एक समय में 1 माउस प्लेस ।
  12. श्वासनली के दृश्य के साथ मदद करने के लिए एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक का उपयोग कर ऊपरी छाती रोशन ।
  13. धीरे से एक p200 पिपेट का उपयोग कर सुनिश्चित करें कि वे झुरमुट के फार्म नहीं है कोशिकाओं reसस्पेंड । माउस का मुंह खोलो और जीभ बाहर धीरे बाँझ फ्लैट संदंश के साथ खींचो ।
  14. श्वास अवरुद्ध से बचने के लिए हटाया सुई के साथ एक नसों कैथेटर का उपयोग करें । श्वासनली के उद्घाटन से उत्सर्जित सफेद प्रकाश पर कैथेटर की स्थिति ।
  15. कैथेटर के ऊपर सामने दांत तक पहुँच जाता है जब तक श्वासनली में मुंह में कैथेटर के उद्घाटन के माध्यम से चमक सफेद प्रकाश visualizing द्वारा श्वासनली में कैथेटर की उचित स्थान की पुष्टि करें ।
  16. एक पिपेट का उपयोग करना, ५० µ एल कोशिकाओं के सीधे कैथेटर में वितरण सुनिश्चित करें कि पूरे मात्रा साँस है. बाँझ शर्तों के तहत इस चरण को निष्पादित करें ।
    नोट: कैथेटर सही ढंग से डाला गया है, तो माउस कैथेटर की सामग्री तुरंत साँस लेगा ।
  17. कुछ सेकंड रुको जब तक पूरे मात्रा कैथेटर नीचे यात्रा, और फिर श्वासनली से कैथेटर निकालें और 10% ब्लीच समाधान में निपटाने ।
  18. अगर चूहे तरल श्वास नहीं है, ध्यान से श्वास की निगरानी और कैथेटर स्थिति को समायोजित । यदि माउस सांस लेना बंद कर देता है, कैथेटर तुरंत निकालें और माउस को फिर से डालने से पहले सामांय श्वास फिर से शुरू करने की अनुमति दें ।
    नोट: चरण 4.11-4.18 के प्रति माउस औसत समय 5 मिनट के आसपास है ।
  19. एक फ्लैट की सतह पर वसूली के लिए उनकी पीठ पर एक IACUC अनुमोदित हीटिंग पैड पर इंजेक्शन माउस रखें ।
    नोट: पूरी प्रक्रिया माउस प्रति 10 मिनट लग जाएगा । एक जानवर है कि अंय जानवरों की कंपनी को इंजेक्शन से आया है वापस नहीं जब तक पूरी तरह से बरामद किया ।
  20. पूरे रिब क्षेत्र दाढ़ी दोनों ventrally और B6129SF1/जे और काले बालों के साथ अंय माउस उपभेदों के एक इलेक्ट्रिक शेविंग इमेजिंग से पहले का उपयोग कर के पृष्ठीय ।
  21. 2-3 मिनट के बाद सेल इंजेक्शन, सुई १०० µ एल के luciferin रेट्रो-कक्षा (15 मिलीग्राम/एमएल) एक इंसुलिन सुई का उपयोग कर । वैकल्पिक हर इमेजिंग सत्र इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल आंख ।
  22. के बाद कम से 2 मिनट, एक जानवर bioluminescence imager में 5 चूहों पृष्ठीय recumbency स्थिति में ऊपर प्लेस और एक ventral luminescence सेटिंग्स29का उपयोग कर चित्र प्राप्त ।
  23. नियंत्रण कक्ष के अंतर्गत समाधान और संवेदनशीलता सेटिंग्स किसी दिए गए कक्ष रेखा के luminescence को मापने के लिए समायोजित करें । सबसे अनुप्रयोगों के लिए, 3 मिनट के साथ शुरू (या "ऑटो" यदि संतृप्त), बिन्नी = मध्यम (4), F/Stop = 1, दृश्य के क्षेत्र = D, विषय ऊंचाई = 1.50 ।
    नोट: इंजेक्शन सफल होता है, luminescence संकेत ऊपरी छाती क्षेत्र में, एक फेफड़े या दोनों फेफड़ों में पाया जाता है ।
  24. recumbency स्थिति पर चूहों फ्लिप और ऊपर के रूप में एक पृष्ठीय तस्वीर हासिल ।
    नोट: अगर सेल इंजेक्शन ठीक से नहीं किया जाता है, कोशिकाओं श्वासनली के द्वार पर या गर्दन में क्लस्टर हो सकता है ।
  25. दर्द कम करने के लिए सुई ketoprofen 5 मिलीग्राम/intraperitoneally ।
  26. चूहों को वापस उनके पिंजरे में ले जाएँ और पिंजरे पर एक "बीएसएल-2 एजेंट उपयोग में" कार्ड जगह है ।
  27. इंटुबैषेण के तुरंत बाद श्वसन संकट के लिए चूहों पर नजर रखें, और फिर हर 15 मिनट तक चूहों संज्ञाहरण से जाग. जब तक वे स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना फिर से प्राप्त किया है चूहों को उपेक्षित मत छोड़ो ।
  28. चूहों की जांच 24 एच पोस्ट इंटुबैषेण और रुग्णता के किसी भी लक्षण के लिए एक सप्ताह में तीन बार ।
  29. प्रक्रिया, पशु पहचान, प्रकार की प्रक्रिया, प्रकार की संवेदनाहारी और पोस्ट-ऑपरेटिव मॉनिटरिंग प्रेक्षणों और समय की तिथि के कार्यपंजी में रिकॉर्ड रखें ।
  30. वजन घटाने, श्वसन संकट, व्यवहार असामान्यताओं, और एक शरीर की स्थिति स्कोर < 2 (कशेरुका कॉलम के विभाजन स्पष्ट/पृष्ठीय श्रोणि हड्डियों साफ कर रहे हैं) ब्लीयामीसिन के द्वि-साप्ताहिक निम्नलिखित टीका के लिए चूहों पर नजर रखें ।
    नोट: फेफड़े के ट्यूमर के साथ चूहों श्वसन जलन, वजन घटाने, दुर्बलता प्रदर्शन, हो सकता है, और/
  31. श्वसन संकट या चूहों कि सह द्वारा शरीर द्रव्यमान के 15% नुकसान का अनुभव किया है के तहत चूहों Euthanize या ketamine/xylazine द्वारा गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन के बाद अगर ऊतकों का संग्रह. टटोलने का कार्य श्वसन गतिविधि के लिए आयोजित करके इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।

5. Bioluminescence इमेजिंग द्वारा ट्यूमर के विकास की निगरानी

  1. 3 दिन के बाद engraftment और साप्ताहिक के बाद चूहों के दोहराने इमेजिंग ।
  2. Anesthetize चूहों ketamine/xylazine इंजेक्शन द्वारा (के रूप में कदम में वर्णित 2.4-2.5) या द्वारा श्वास isoflurane (2%) । चूहों की साँस लेने की निगरानी और उचित anesthetization की पुष्टि करने के लिए एक पाँव चुटकी रोजगार. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें ।
  3. पूरे रिब क्षेत्र दाढ़ी दोनों ventrally और B6129SF1/जे और काले बालों के साथ अंय माउस उपभेदों के एक इलेक्ट्रिक शेविंग इमेजिंग से पहले का उपयोग कर के पृष्ठीय ।
  4. एक बार चूहों संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं, luciferin रेट्रो के १०० µ एल सुई-कक्षा (15 मिलीग्राम/एमएल) एक इंसुलिन सुई का उपयोग कर । 2 min. वैकल्पिक आंख हर इमेजिंग सत्र इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया रुको ।
  5. imager में चूहों प्लेस और 4.22-4.24 चरणों में वर्णित के रूप में पृष्ठीय और ventral छवियों को प्राप्त ।
  6. माउस इमेजिंग के बाद पिंजरे में वापस प्लेस, वसूली के लिए एक सपाट सतह पर उनकी पीठ पर ।
    नोट: पूरी प्रक्रिया 5 चूहों के समूह प्रति 5 मिनट लग जाएगा । जब तक वे स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना फिर से प्राप्त किया है चूहों को उपेक्षित मत छोड़ो ।
  7. imager/bioluminescence विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण ।
    1. उपयुक्त छवियों का चयन करें और उंहें bioluminescence विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक समूह के रूप में लोड ।
    2. roi टूल पर क्लिक करें. ब्याज का एक वर्ग क्षेत्र जोड़ने के लिए स्क्वायर (रॉय) । ऊपरी छाती क्षेत्र पर रॉय प्लेस, पूरे फेफड़ों की छवि को कवर । प्रत्येक माउस छवि के लिए इसे दोहराएं ।
    3. ठीक क्लिक करें और चुनें सभी roi समारोह की नकल के लिए समूह में सभी छवियों को एक ही रॉय लागू करते है और उंहें चूहों के ऊपरी छाती में स्थिति, दोनों ventral और पृष्ठीय विचार ।
    4. छवि विंडो के ऊपरी बाएँ कोने में, फोटॉनों फ़ंक्शन का चयन करें । ROIs को मापने के लिए नियंत्रण कक्ष माप फ़ंक्शन क्लिक करें । कॉपी और पेस्ट कुल प्रवाह से युक्त उत्पादन तालिका विकल्प के एक सॉफ्टवेयर में डेटा का विश्लेषण करने के लिए आगे (फोटॉनों/
    5. प्रत्येक माउस के दैनिक roi मूल्य को अपने roi मूल्य के अनुसार सामान्य करें 0 दिन पर मापा जाता है.

6. ऊतक अलगाव और प्रसंस्करण ।

  1. Anesthetize चूहों ketamine/xylazine इंजेक्शन द्वारा (के रूप में कदम में वर्णित 2.4-2.5 या द्वारा श्वास isoflurane (2%) । चूहों की साँस लेने की निगरानी और एक पैर की अंगुली चुटकी रोजगार. उचित anesthetization की पुष्टि करें जब माउस को पैर की अंगुली चुटकी का जवाब नहीं है । संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें ।
  2. luciferin रेट्रो के १०० µ एल सुई-कक्षा (15 मिलीग्राम/एमएल) एक इंसुलिन सुई का उपयोग कर । 2 मिनट रुको ।
  3. छवि चूहों इस प्रोटोकॉल से 4.22-4.24 कदम निंनलिखित ।
  4. दूसरी आंख में इंजेक्षन से ६.२ एक और १०० µ एल के luciferin रेट्रो-कक्षा एक इंसुलिन सुई इच्छामृत्यु से पहले का उपयोग कर ।
  5. चूहों को Euthanize के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा ketamine/xylazine (विवरण के लिए चरण २.४ देखें) ग्रीवा विस्थापन के बाद अगर चूहों IACUC द्वारा प्रदान दिशा निर्देशों के अनुसार गहरी संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं । टटोलने का कार्य श्वसन गतिविधि के लिए आयोजित करके इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।
  6. बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग उरोस्थि के नीचे एक त्वचा चीरा बनाते हैं । डायाफ्राम संदंश और सर्जिकल कैंची का उपयोग कर के साथ मांसपेशी परत खोलें और पार्श्व पक्षों में से किसी पर रिब पिंजरे के माध्यम से काटने के द्वारा वक्ष गुहा बेनकाब आंतरिक वक्ष धमनियों से परहेज ।
  7. Perfuse दिल के सही atrium में एक छोटा सा चीरा लगाकर माउस को छोड़ निलय के माध्यम से पंजाब के 5 मिलीलीटर इंजेक्ट करें । फेफड़ों के ऊतकों का रंग लाल से पीला गुलाबी सफेद करने के लिए जाना होगा अगर रक्त छिड़काव ठीक से किया जाता है ।
  8. संदंश के साथ घेघा या दिल पकड़कर ध्यान से वक्ष गुहा से उत्पाद के फेफड़े । धीरे ऊतक खींचने के लिए और शल्य कैंची का उपयोग करने के लिए ध्यान से जोड़ने ऊतक फेफड़ों के ऊतकों के पंचर से बचने में कटौती । श्वासनली एक बाद में कदम पर फेफड़ों एयरवेज की मुद्रास्फीति के लिए जितना संभव हो संरक्षित ।
  9. विलय और ऊतक घूमता एक 6 अच्छी तरह से पंजाब के 3 मिलीलीटर से भरा थाली में 3 बार अतिरिक्त रक्त को हटाने के द्वारा फेफड़ों धो लो ।
  10. एक 6 अच्छी तरह से थाली के ढक्कन पर फेफड़े प्लेस, और ढक्कन जगह bioluminescent imager में ऊतक युक्त और एक luminescent छवि प्राप्त30।
    नोट: हम अनुशंसा करते हैं "अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष" से निम्न सेटिंग्स का चयन "दृश्य के फ़ील्ड = A" और "विषय ऊँचाई = 0.75 सेमी" और फिर "ऑटो एक्सपोजर" संतृप्त छवियों हो रही से बचने के लिए.
  11. उत्पाद शुल्क और छवि अन्य अंगों, के रूप में कदम में किया 6.9-6.10, जहां मेटास्टेसिस luminescence द्वारा पहचान की गई है, जैसे मस्तिष्क, जिगर, अधिवृक्क, हड्डी, लिम्फ नोड्स, गुर्दे या तिल्ली31.
  12. Perfuse को माउस के श्वासनली में सुई डालने से 4% paraformaldehyde के 1 मिलीलीटर के साथ फेफड़ों में डालें । फेफड़ों अगर अच्छी तरह से perfused फुलाना होगा ।
    चेतावनी: 4% paraformaldehyde एक विषाक्त, एक स्वास्थ्य खतरा GHS07 और GHS08 है ।
  13. 4% paraformaldehyde के 5 मिलीलीटर के साथ एक 15 मिलीलीटर शंकु में फेफड़ों स्थानांतरण ।
  14. 30-50 rpm पर एक मिलाते हुए डिवाइस में 4 ° c पर रातोंरात 4% paraformaldehyde के साथ ऊतक की मशीन द्वारा फेफड़ों या अन्य ऊतकों को ठीक करें ।
  15. (या अंय ऊतकों) तेल या इष्टतम काटने तापमान यौगिक में एंबेड फेफड़ों आवेदन३२के आधार पर ।
    ध्यान दें: तेल के लिए फेफड़ों की संरचना को बनाए रखने और Masson Trichrome और Hematoxylin-Eosin धुंधला के लिए पसंदीदा तरीका है ।

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Representative Results

चूहों के फेफड़ों में LUAD कैंसर कोशिका engraftment की दक्षता बढ़ाने के लिए, हम एक प्रोटोकॉल है कि पहले पूर्व शर्तों orthotopic ट्यूमर सेल इंजेक्शन (चित्रा 1) द्वारा पीछा ब्लीयामीसिन का उपयोग कर एयरवेज विकसित की है । हम पुष्टि की है कि जब भी प्रतिरक्षा athymic चूहों में प्रशासित, ब्लीयामीसिन airway वास्तुकला और बढ़ी हुई कोलेजन जमाव (चित्रा 2) के नुकसान से सबूत के रूप में 14 दिन से क्षणिक फाइब्रोसिस प्रेरित किया । इन चूहों में सकल फाइब्रोसिस का समाधान ५० दिन बाद ब्लीयामीसिन इंजेक्शन (चित्रा 2; सही पैनलों) पूर्व अध्ययन के अनुरूप24.

इन टिप्पणियों के आधार पर, हम विभिन्न मूल के LUAD कोशिकाओं engrafted कि पूर्व किया गया था विभिंन माउस उपभेदों के फेफड़ों में वाहन या ब्लीयामीसिन की एक खुराक के साथ 14 दिन पहले वातानुकूलित । उदाहरण के लिए, स्थापित मानव LUAD सेल लाइन, H2030 से LUAD कोशिकाओं के निलंबन, athymic चूहों के फेफड़ों में intratracheally दिया गया था । ३५ दिनों के बाद, ब्लीयामीसिन के साथ इलाज चूहों उच्च फेफड़ों के ट्यूमर बोझ था के रूप में bioluminescence द्वारा पता लगाया (3 ए आंकड़ा). इसके विपरीत, वाहन में इलाज पशुओं, कोई ट्यूमर एक ही समय सीमा (चित्रा 3ए) पर पता लगाया गया । फेफड़े के ट्यूमर के बोझ प्रोटोकॉल निंनलिखित necropsy द्वारा की पुष्टि की थी । फेफड़े वाहन के साथ इलाज ट्यूमर पिंड का कोई सबूत नहीं था, जबकि ब्लीयामीसिन पूर्व इलाज फेफड़ों के बड़े ट्यूमर पिंड (चित्र बी) था । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग करते हुए हमने athymic चूहों में एक अन्य मानव LUAD कोशिका रेखा के engraftment को भी बढ़ा दिया (PC9; चित्र 3सी) और एक murine LUAD सेल लाइन है कि syngeneic असुरक्षित B6129SF1/जे चूहों (चित्रा 3 डी) में इंजेक्ट किया गया था । ब्लीयामीसिन पूर्व इलाज syngeneic चूहों में मनाया प्रारंभिक घावों मुख्य रूप से 1 और 2 ग्रेड थे और अच्छी तरह से विभेदित थे, KrasG12Dसे सीटू में उत्पन्न होने वाले ट्यूमर जैसी/ p53-/ GEMMs३३. सभी engrafted LUADs समीपस्थ और बाहर फेफड़े (चित्रा 3 बी, चित्रा 3E, चित्रा 3g, तारांकन (बाहर), स्टार (समीपस्थ)) में दोनों बढ़ी । फेफड़ों के कैंसर से PDXs की स्थापना के लिए (बायोप्सी या शल्य लकीर से), अपेक्षाकृत अक्षम है, यहां तक कि जब मानव कोशिकाओं को इस तरह की मंजूरी scid गामा (एनएसजी) के रूप में गंभीर रूप से immunodeficient पशुओं में प्रत्यारोपित कर रहे है माउस तनाव३४। PDXs करने के लिए हमारे विधि के संभावित अनुप्रयोग का मूल्यांकन करने के लिए, हम भी H2030 सेल लाइन के एक उच्च मेटास्टेटिक सेल उप जनसंख्या इंजेक्शन, H2030-BrM3 कोशिकाओं३५, एनएसजी चूहों कि पूर्व में वाहन के साथ वातानुकूलित किया गया था में intratracheally या ब्लीयामीसिन. हम ध्यान दें कि एनएसजी चूहों अधिक ब्लीयामीसिन के विषाक्त प्रभाव के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) और है कि एक खुराक कम माउस प्रति ०.०२ इकाइयों की सलाह दी जाती है जब इस तनाव के साथ काम कर रहा है । इसके बावजूद, हमारे प्रोटोकॉल भी काफी engraftment और एनएसजी चूहों के फेफड़ों में ट्यूमर बोझ बढ़ (चित्रा 3F, चित्रा 3 जी) ।

हम अगले athymic चूहों में H2030 सेल लाइन का उपयोग कोशिकाओं की मात्रा सीमित की engraftment दरों का परीक्षण करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया. चूहों ब्लीयामीसिन के साथ पूर्व इलाज 5 x 105, 5 x 104, या 5 x 103 H2030 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन थे । 85.7-चूहों के 100% सभी कमजोर पड़ने पर परीक्षण (तालिका 2) के बीच 7 और 10 सप्ताह के बीच फेफड़े के ट्यूमर विकसित की है । हम निष्कर्ष है कि फेफड़ों में ट्यूमर कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत कम संख्या के engraftment संभव है अगर चूहों पूर्व ब्लीयामीसिन के साथ वातानुकूलित हैं । कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल चूहों और विभिंन LUAD सेल लाइन मॉडलों के कई उपभेदों के अनुरूप किया जा सकता है फेफड़ों में 0-16.7% से 71.4-100% (तालिका 2) के लिए कैंसर की कोशिकाओं की engraftment दर में वृद्धि ।

अंत में, ब्लीयामीसिन पूर्व-वातानुकूलित फेफड़ों से LUAD कोशिका वृद्धि और मेटास्टेटिक प्रसार के ख्यात कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए, हम हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग अत्यधिक मेटास्टेटिक H2030-BrM3 कोशिकाओं के व्यवहार की विशेषता । निम्नलिखित orthotopic engraftment में वाहन-इलाज चूहों, ट्यूमर सेल उदासीनता bioluminescence द्वारा दिन में मनाया गया था 3 पोस्ट-इंजेक्शन और फेफड़े के ट्यूमर के विकास के बाद या समापन बिंदु (३५ दिन) (चित्रा 4a, चित्रा 4B) पर नहीं पाया जा सका. इसके विपरीत, हम ब्लीयामीसिन के साथ चूहों पूर्व इलाज में फेफड़े ट्यूमर वृद्धि का पता लगाया के रूप में दिन के रूप में जल्दी 7 बाद इंजेक्शन (चित्रा 4a) । ट्यूमर के विस्तार के 39-57 दिनों के बाद, रुग्णता और bioluminescent तीव्रता उच्च फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ के साथ जुड़े प्रसार रोग के विश्लेषण सीमा (नहीं दिखाया गया डेटा) । इसलिए, हम सुदूर अंगों में मेटास्टेसिस imaged necropsy पर vivo ex । ५७ दिनों के लिए फेफड़ों ट्यूमर बोझ था कि पशुओं में, छोटे घावों भी इस तरह के मस्तिष्क, जिगर, गुर्दे, अधिवृक्क ग्रंथियों, और चर आवृत्तियों (आंकड़ा 4c) में अस्थि हिंद अंगों के रूप में ऊतकों में पता लगाया जा सकता है. इसलिए, हम निष्कर्ष निकालना है कि नैदानिक प्रासंगिक साइटों में सहज प्रसार रोग इस orthotopic विधि से उत्पंन किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: ट्यूमर कोशिका engraftment के लिए फेफड़ों की पूर्व स्थिति के लिए विधि. इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । फेफड़ों में चोट ब्लीयामीसिन intratracheally इंजेक्शन द्वारा किया जाता है । LUAD कोशिकाओं को तो चूहों के श्वासनली में 14 दिन बाद इंजेक्शन लगाया जाता है. चूहों बाद में ट्यूमर engraftment, विकास और दूर मेटास्टेसिस की निगरानी के लिए luminescence के लिए साप्ताहिक imaged हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ब्लीयामीसिन क्षणिक फेफड़े फाइब्रोसिस और ECM remodeling का कारण बनता है । Hematoxylin के प्रतिनिधि छवियां-Eosin (एच एंड ई) और Masson Trichrome वाहन से फेफड़ों के दाग और ब्लीयामीसिन इलाज चूहों 14 दिनों के बाद इंजेक्शन (फाइब्रोसिस की चोटी) और ५१ दिनों के बाद ट्यूमर सेल के अभाव में इंजेक्शन (फाइब्रोसिस संकल्प) इंजेक्शन. स्केल बार = ५०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: LUAD कक्ष लाइनों के फेफड़े engraftment एकाधिक माउस मॉडलों में ब्लीयामीसिन के साथ चूहों पूर्व इलाज में वृद्धि हुई है । क) Athymic चूहों पूर्व में वाहन या ब्लीयामीसिन के साथ इलाज 5x105 H2030 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन थे । सापेक्ष फेफड़े ट्यूमर समापन बिंदु पर बोझ (दिन ३५ 0 दिन के लिए सामान्यीकृत) के रूप में bioluminescence द्वारा मापा साजिश रची है । प्रत्येक समूह के लिए, औसत ट्यूमर बोझ के साथ एक माउस दिखाया गया है । n = 6-7 प्रति समूह चूहों । ख) प्रतिनिधि एच और ई फेफड़ों की छवियां पूर्व-वाहन या ब्लीयामीसिन के साथ इलाज से एक दिन ३५ पर । तारांकन = बाहर का; सितारा = समीपस्थ । ग) Athymic चूहों के रूप में एक 1x105 PC9 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन थे इलाज किया । ट्यूमर बोझ और प्रतिनिधि छवियों को मापा जाता है और एक. n = प्रति समूह 7 चूहों में के रूप में दिखाया गया है । D-E) B6129SF1/जे चूहों वाहन या ब्लीयामीसिन के साथ पूर्व इलाज 1x105 368T1 KrasG12D/+ p53-/- (केपी टी-गैर मिले) कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन थे । ट्यूमर का बोझ, प्रतिनिधि छवियों और H & Es मापा और समूह के अनुसार एक और B. n = 7 चूहों में के रूप में चित्रित कर रहे हैं । एफजी) एनएसजी चूहों वाहन या ब्लीयामीसिन के साथ पूर्व इलाज 1 x 105 H2030-BrM3 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन थे । ट्यूमर बोझ, प्रतिनिधि छवियों और H & Es (दिन 9 और दिन 10 पोस्ट इंजेक्शन) मापा जाता है और एक और बी. एन = 3-6 चूहों के प्रति समूह में के रूप में दिखाया गया है । स्केल बार = ५०० µm. इनसेट = ट्यूमर कोशिका engrafted क्षेत्रों का उच्च आवर्धन । प्रीसेट की स्केल पट्टी = १०० µm. p मान मान-Whitney परीक्षण द्वारा परिकलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: LUAD कोशिकाओं ब्लीयामीसिन-इलाज चूहों में engrafted कई दूर के अंगों के लिए metastasize. क) Athymic चूहों पूर्व में वाहन या ब्लीयामीसिन के साथ इलाज 5x105 H2030-BrM3 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन थे । फेफड़े के ट्यूमर बोझ bioluminescence का उपयोग कर साप्ताहिक मापा गया था । पृष्ठीय कुल फोटॉन प्रवाह 0 दिन के लिए सामान्यीकृत दिखाया गया है । ख) (दिन ३५ पोस्ट-इंजेक्शन) समापन बिंदु पर एक से फेफड़ों के bioluminescence द्वारा ट्यूमर बोझ । प्रत्येक समूह के लिए, औसत ट्यूमर बोझ के साथ एक माउस दिखाया गया है । n = 6-7 प्रति समूह चूहों । ग) necropsy पर एक ही माउस से detectable मेटास्टेसिस के साथ अंगों के प्रतिनिधि छवियों (बाएं) । समापन बिंदु पर सुदूर अंगों में मेटास्टेसिस के साथ चूहों की संकेत आवृत्तियों के साथ तालिका (दिन ३९ से ५७ पोस्ट-engraftment) (दाएं) । Ex-vivo अंगों से ऊपर visual bioluminescent संकेत के साथ १.५ x 104 फोटॉनों/(एसईसी सेमी2 steradian) सकारात्मक मेटास्टेसिस के रूप में गिना गया। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

माउस तनाव इकाइयों माउस/
Athymic ०.०२
एनएसजी ०.०२
B6129SF1 J/ ०.००५

तालिका 1: परीक्षण माउस उपभेदों के लिए ब्लीयामीसिन की सिफारिश की खुराक की सूची ।

माउस तनाव सेल लाइन इंजेक्शन की कोशिकाओं की संख्या % engraftment p मान
वाहन ब्लीयामीसिन
Athymic H2030 5x105 0% (0/7) १००% (6/6) ०.०००६
Athymic H2030 5x104 जवाबतलब ८५.७% (6/7) एनए
Athymic H2030 5x10३ जवाबतलब ८५.७% (6/7) एनए
Athymic पीसी-9 1x105 0% (0/7) ८५.७% (6/7) ०.००२३
एनएसजी H2030-BrM3 1x105 १६.७% (1/6) १००% (3/3) * ०.०४७६
B6129SF1 J/ 368T1 1x105 0% (0/7) ७१.४% (5/7) * ०.०१०५

तालिका 2: engraftment आवृत्ति (%) संकेत माउस उपभेदों, कक्ष लाइनों और सेल संख्या का उपयोग कर सारांश तालिका । Engraftment vivo luminescence इमेजिंग में द्वारा निर्धारित किया गया था और ३७ और ५० दिनों के बाद इंजेक्शन के बीच ऊतकों की प्रोटोकॉल के साथ पूर्व vivo इमेजिंग द्वारा की पुष्टि की । * पॉजिटिव engraftment की पुष्टि वीवो luminescence में दिन में 10 पोस्ट-इंजेक्शन. p मान एक तरफा फिशर के सटीक परीक्षण द्वारा परिकलित की गई । एनए = लागू नहीं; जवाबतलब = निर्धारित नहीं ।

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Discussion

हड़ताली नैदानिक समानताएं फेफड़ों के कैंसर और अंय फेफड़ों३६के पुराने रोगों के बीच प्रलेखित किया गया है । विशेष रूप से, अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस (आईपीएफ) के साथ रोगियों फेफड़ों के कैंसर के विकास के लिए एक वृद्धि हुई predilection है, और इस संघ के धूंरपान इतिहास३७,३८से स्वतंत्र है । आईपीएफ ECM३९के जमाव के माध्यम से फेफड़े वास्तुकला और बिगड़ा श्वसन समारोह के प्रगतिशील विनाश की विशेषता है । इसके अलावा, शल्य लकीर के बाद, समवर्ती आईपीएफ के साथ प्रारंभिक चरण NSCLC रोगियों एक गरीब परिणाम४०है । सबसे NSCLC ट्यूमर निदान के समय में एक fibrotic घटक होते हैं, और इस stromal प्रतिक्रिया की हद तक गरीब पूर्वानुमान18के साथ संबद्ध । फाइब्रोसिस से तीव्र या निरंतर ऊतक क्षति कई मायनों में tumorigenesis की घटनाओं में वृद्धि हो सकती है । उदाहरण के लिए, चोट के बाद, उपकला पुनर्जनन की प्रक्रिया जनक कोशिकाओं के परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील के पूल का विस्तार हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, आमद और विभिंन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समारोह में मदद कर सकते है एक immunosuppressive microenvironment की स्थापना, जबकि myofibroblasts के सक्रियकरण विकास कारकों या जमा ट्यूमर स्रावित ECM को बढ़ावा देने सकता है । तदनुसार, पूर्व के हमारे विधि एक फाइब्रोसिस उत्प्रेरण एजेंट के साथ फेफड़ों कंडीशनिंग विशेष रूप से फेफड़ों के कैंसर सह रुग्णताओं (जैसे फाइब्रोसिस) और मॉडलिंग NSCLC उपप्रकार है, जो extracellular मैट्रिक्स में अमीर है और एक के प्रभाव का अध्ययन करने में उपयुक्त साबित हो सकता है भड़काऊ स्ट्रोमा४१।

कुल मिलाकर, हमारे विधि काफी ट्यूमर श्वासनली के माध्यम से एयरवेज में इंजेक्शन कोशिकाओं के engraftment बढ़ाया । इस प्रेक्षण immunocompetence की डिग्री बदलती के साथ माउस उपभेदों के लिए सच रखती है । फेफड़ों में ट्यूमर सेल इंजेक्शन के अन्य तरीकों पूंछ नस इंजेक्शन या छाती की दीवार के माध्यम से फेफड़ों पैरेन्काइमा में प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल हैं । फेफड़ों के कैंसर सेल tumorigenicity के अध्ययन के विशिष्ट प्रयोजन के लिए, इन तरीकों उप इष्टतम हैं, के रूप में पूर्व ट्यूमर कोशिकाओं में वृद्धि से पहले संचलन और extravasate में जीवित रहने के लिए की आवश्यकता है (एक प्रक्रिया अधिक फेफड़ों में मेटास्टेसिस सदृश), जबकि बाद इंजेक्शन के बाद फुफ्फुस अंतरिक्ष में बाहर लीक करने के लिए कोशिकाओं के कारण (डेटा नहीं दिखाया गया है) कर सकते हैं । दोनों तरीकों से फेफड़े के कैंसर सेल के लोको-क्षेत्रीय ठहराव को पाया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, हमारे प्रोटोकॉल सुनिश्चित करता है कि बीज ट्यूमर कोशिकाओं को पहले फेफड़े स्ट्रोमा से घिरा एयरवेज में बनाए रखा जाता है । इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, चूहों के उचित इंटुबैषेण हैं, ब्लीयामीसिन की संतोषजनक खुराक, और airway पूर्व के समय ट्यूमर सेल इंजेक्शन के सापेक्ष कंडीशनिंग । हम यह भी प्रदर्शित करता है कि इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं को बाद में मस्तिष्क सहित अंय ऊतकों को प्रसार करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ के साथ जुड़े रुग्ण दूर macrometastasis के व्यापक लक्षण वर्णन को सीमित कर सकते हैं, इस दृष्टिकोण के लिए उपयोगी हो सकता है और ट्यूमर कोशिकाओं फेफड़ों से उत्पंन घूम अध्ययन ।

यहां वर्णित विधि के लाभों के बावजूद, कई तकनीकी चर engraftment और ट्यूमर प्रगति की निगरानी की अंतिम दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं । सबसे पहले, यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि चूहों में ब्लीयामीसिन के लिए fibrotic प्रतिक्रिया तनाव पर निर्भर है । उदाहरण के लिए, C57Bl/6 चूहों बालब/सी चूहों४२की तुलना में जब फाइब्रोसिस करने के लिए प्रवण हैं । दूसरा, ब्लीयामीसिन के प्रति संवेदनशीलता लिंग और उम्र निर्भर है । हमारे अनुभव में, महिलाओं और छोटे चूहों और अधिक पूरे प्रोटोकॉल पर प्रतिकूल प्रभाव के लिए प्रवण हैं । यह पुरुष और महिला, या युवा और पुराने जानवरों के बीच प्रत्यक्ष तुलना की आवश्यकता होती है tumorigenesis अध्ययनों की सीमा हो सकती है । इसके अलावा, 7 सप्ताह से छोटी चूहों की intratracheal जगाकर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और कैथेटर आकार के समायोजन की आवश्यकता हो सकती है । तीसरा, ब्लीयामीसिन विषाक्त है और डीएनए टूट प्रेरित करने की क्षमता के कारण mutagenic हो सकता है । यह प्रयोग करने से पहले प्रत्येक माउस तनाव के लिए ब्लीयामीसिन की संतोषजनक खुराक परीक्षण महत्वपूर्ण है । सिद्धांत अध्ययन के इस सबूत में, हम विभिंन उपभेदों भर में पुरुष चूहों के लिए सुझाव दिया खुराक प्रदान करते हैं । इसके अतिरिक्त, डार्क फर के साथ चूहों कम ऊतक प्रवेश और फर द्वारा bioluminescent संकेत के मास्किंग के कारण bioluminescent इमेजिंग के लिए कम उपयुक्त हैं. Depilating चूहों छवि माप में सुधार हो सकता है, लेकिन वैकल्पिक तरीके भी ऐसे चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और फ्लोरोसेंट इमेजिंग TdTomato या Katushka४३के रूप में लंबी तरंग दैर्ध्य की जांच का उपयोग कर के रूप में नियोजित किया जा सकता है । अंत में, एक दिया रिपोर्टर प्रोटीन के संभावित immunogenicity जब एक दिया माउस मॉडल के लिए एक ट्यूमर का पता लगाने के साधन का चयन पर विचार किया जाना चाहिए ।

ब्लीयामीसिन पहले हानिकारक वायुकोशीय प्रकार 2 (AT2) कोशिकाओं जो alveoli४४की मरंमत करने के प्रयास में फिर पुनर्जंम द्वारा बाहर फेफड़े remodels । चूंकि AT2 कोशिकाओं NSCLC को जंम देने के लिए प्रमुख कोशिका प्रकार में से एक हैं, ब्लीयामीसिन के साथ फेफड़े के पूर्व कंडीशनिंग भी GEMMs से सीटू में उत्पन्न होने वाले ट्यूमर की दीक्षा और प्रगति को संशोधित कर सकते हैं । चोट के अंय प्रकार, इंफ्लूएंजा संक्रमण13 या naphthalene जगाकर14सहित, मानव और murine फेफड़े स्टेम/जनक कोशिकाओं के engraftment को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है । विशेष रूप से, naphthalene हर्जाना स्टेम/जनक bronchio-वायुकोशीय जंक्शनों में कोशिकाओं और संभावित GEMMs४५में ट्यूमर दीक्षा बढ़ जाती है । ठीक-ट्यूनिंग प्रकार की चोट और airway engrafted कोशिका प्रकार के लिए लक्षित आला आगे हमारे विधि का अनुकूलन करने के लिए फेफड़ों के कैंसर allografts या विभिंन मूल के xenografts अध्ययन कर सकते हैं । अंत में, हम प्रस्ताव है कि इस विधि फेफड़ों के कैंसर PDXs के मानक पीढ़ी के लिए लागू किया जा सकता है । एनएसजी चूहों में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण द्वारा मानव के PDXs से फेफड़ों के कैंसर की स्थापना की सफलता की दर अपेक्षाकृत कम है (30-40%)४६,४७। PDXs के Orthotopic वृद्धि न केवल नमूना की मात्रा सीमित (मानव फेफड़ों से) के साथ इस सफलता की दर में वृद्धि हो सकती है, लेकिन यह भी अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक शर्तों को उत्पंन करने के लिए फार्माकोकाइनेटिक्स और फेफड़ों के कैंसर चिकित्सकीय के pharmacodynamics परीक्षण ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

यह अध्ययन राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R01CA166376 और R01CA191489 to D.X. गुयेन) और रक्षा विभाग (W81XWH-16-1-0227 to D.X. गुयेन) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair - To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. -
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) -
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -

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मेडिसिन इश्यू १३६ लंग ग्रंथिकर्कटता orthotopic माउस मॉडल्स intratracheal इंजेक्शन ब्लीयामीसिन engraftment मेटास्टेसिस
ब्लीयामीसिन के साथ चूहों के एयरवेज पूर्व कंडीशनिंग Orthotopic फेफड़ों के कैंसर कोशिका Engraftment की क्षमता बढ़ जाती है
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Stevens, L. E., Arnal-Estapé,… More

Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).

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