Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Forudgående konditionering luftvejene i mus med Bleomycin øger effektiviteten af Orthotopic lunge kræft celle Engraftment

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/56650
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en metode til at forbedre betydeligt orthotopic engraftment lunge kræft celler i murine lungerne af forudgående konditionering airways med skade. Denne tilgang kan også anvendes til at studere stromale interaktioner i lunge mikromiljø, metastatisk spredning, lung cancer co-morbiditet, og for at mere effektivt generere patienten afledt xenografts.

Abstract

Lungekræft er en dødelig behandling refraktær sygdom, der er biologisk heterogene. For at forstå og effektivt at behandle den fuldstændige klinisk spektrum af thorax maligniteter, der er behov for yderligere dyremodeller, der kan sammenfatte forskellige menneskelige lung cancer undertyper og faser. Allograft eller xenograft modeller er alsidig og aktiverer kvantificering af tumorfremkaldende kapacitet i vivo, ved hjælp af maligne celler af enten murine eller menneskelig oprindelse. Imidlertid har tidligere beskrevet metoder af lunge kræft celle engraftment udført i ikke-fysiologisk steder, såsom flanke af mus, på grund af ineffektiviteten af orthotopic transplantation af celler ind i lungerne. I denne undersøgelse beskriver vi en metode til at forbedre orthotopic lunge kræft celle engraftment ved forudgående konditionering luftvejene i mus med fibrose inducerende agent bleomycin. Som en proof-of-concept eksperiment, vi har anvendt denne fremgangsmåde for at indpode tumorceller af undertypen lunge adenocarcinom, fremstillet af enten musen eller menneskelige kilder, til forskellige stammer af mus. Vi demonstrere, at beskadige luftvejene med bleomycin før tumor celle indsprøjtning øger engraftment af tumorceller fra 0-17% til 71-100%. Denne metode forbedret betydeligt, lunge tumor forekomsten og efterfølgende udvækst ved hjælp af forskellige modeller og mus stammer. Derudover formidle aflægger lung cancerceller fra lungerne til relevante fjerntliggende organer. Dermed, vi leverer en protokol, der kan bruges til at etablere og vedligeholde nye orthotopic modeller af lungekræft med begrænse mængder af celler eller biospecimen og kvantitativt vurdere tumorfremkaldende kapaciteten af lunge kræftceller i fysiologisk relevante indstillinger .

Introduction

Lungekræft er førende årsag til cancer relaterede dødsfald på verdensplan1. Patienter med lungekræft efterhånden bukke under fra metastaser til fjerntliggende organer, navnlig til centralnervesystemet, lever, binyrer og ben2,3,4. Thorax maligniteter har traditionelt været klassificeret som småcellet lungecancer (SCLC) eller ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) kræft5. NSCLC er mest hyppigt diagnosticeret malignitet og kan opdeles i forskellige histologiske undertyper, herunder lunge adenocarcinom (LUAD) og lunge planocellulært karcinom (LUSC)6. Genomisk analyse af resektion menneskelige primære lungekræft har afsløret, at tumorer inden for en given histotype også kan udtrykke forskellige molekylære perturbationer, yderligere bidrager til deres divergerende klinisk progression og confounding patientens prognose. Den bemærkelsesværdige heterogenitet af lungekræft udgør en betydelig udfordring for rationelt design, præ-klinisk test og gennemførelsen af effektive terapeutiske strategier. Derfor er der behov for at udvide repertoiret af tractable eksperimentelle lung cancer modeller at studere forskellige cellulære oprindelse, molekylære undertyper og stadier af denne sygdom.

Forskellige tilgange ved hjælp af dyremodeller har været ansat til at studere lung cancer i vivo, hver med deres egne fordele og ulemper afhængigt af de biologiske spørgsmål af interesse. Gensplejsede musemodeller (GEMMs) kan målrette specifikke genetiske ændringer i en given stamfader celletype, hvilket resulterer i tumorer, fremskridt inden for en immunkompetente vært7. Mens ekstremt kraftfuld og klinisk relevante, kan den ventetid, variation og/eller lunge tumor sygelighed forbundet med GEMMs være uoverkommelige til visse kvantitative målinger og påvisning af sene fase metastase i fjerntliggende organer8. En supplerende strategi er brugen af allograft modeller, hvorved lunge kræftceller, fremstillet enten direkte fra en mus-svulsten eller afledt først som etablerede cellelinier i kultur, der genindsættes syngeneic værter. Analogt, er lung cancer xenografts nedsat fra menneskelige cellelinjer eller patient afledte tumor prøver. Humane celle linje xenografts eller patient afledte xenografts (PDXs) vedligeholdes normalt i immunkompromitterede mus og derfor udelukker fuldstændig immun-overvågning9. Trods denne ulempe giver de en avenue for at udbrede begrænse mængder af menneskelige biospecimens og studere grundlæggende i vivo egenskaber af menneskelige kræftceller, som koder for mere komplekse genomisk aberrationer end CLAUSS tumorer.

En nyttig egenskab af allografts og xenografts er at de er indstillet til traditionelle begrænsende celle fortynding assays, ansat til at kvantificere hyppigheden af tumor indlede celler (TICs) inden for en malign celle befolkning10. I disse eksperimenter, et defineret antal celler injiceres subkutant i flanke af dyr og hyppigheden af TICs kan skønnes baseret på tumor tage sats. Subkutane tumorer dog kan være mere hypoksiske11 og kan ikke model fysiologiske databasenøgler af lunge tumor mikromiljø. Intratrakeal levering af epitel stamceller eller stamceller i lungerne på mus er en metode til at studere pulmonal regenerering og luftvejene stamcelle biologi12. Engraftment sats fra denne teknik kan dog relativt lavt, medmindre lungerne udsættes først for fysiologiske former for skade, såsom virusinfektion13,14. Støtte fra inflammatoriske stromale celler og/eller afbrydelse af lunge basalmembranen kan forbedre fastholdelsen af transplanterede celler i relevante stamcelle nicher i distale airways15. Fibrose inducerende agenter kan også pre betingelse lungerne til at forbedre engraftment inducerede pluripotente celler16 og mesenkymale stamceller17. Om tilsvarende former for airway skade kan påvirke engraftment sats, har tumor igangsættende kapacitet og udvækst af lunge kræftceller endnu skal vurderes systematisk.

I denne undersøgelse beskriver vi en metode til at øge effektiviteten af orthotopic lunge kræft celle engraftment, ved forudgående konditionering lungerne på mus med skade. LUAD opstår i de distale airways med en væsentlig delmængde af disse kræftformer, udvikle en fibrotisk stroma18 der ofte korrelerer med dårlig prognose19. Bleomycin, en naturlig nonribosomal hybrid peptid-polyketide, har været flittigt udnyttet til at fremkalde pulmonal fibrose i mus20. Luftvejene instillation af bleomycin fremmer først epitelial nedslidning i alveolerne og rekruttering af inflammatoriske celler, herunder makrofager, neutrofile og monocytter21. Dette er efterfulgt af væv remodellering i distale airways, basalmembranen reorganisering22,23 og ekstracellulære matrix (ECM) deposition24. Virkningerne af en enkelt bleomycin injektion er forbigående, med fibrose løse efter 30 dage i de fleste undersøgelser25. Brug af både allograft og xenograft modeller, testet vi hvis forudgående konditionering luftvejene i mus med bleomycin kunne øge tage sats af LUAD celler i lungerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) ved Yale University.

1. sæt op / forberedelse af reagenser.

  1. Bleomycin
    Forsigtig: Baseret på den globalt harmoniserede System (GHS) af klassificering og mærkning af kemikalier, er bleomycin klassificeret som en GHS08-sundhedsfare.
    1. Forberede bleomycin i en kemisk hætte. Resuspend 15 U i 5 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    2. Alikvot 100-200 µL af opløsningen i glas hætteglas og fryse dem ved-20 ° C til fremtidig brug. Korrekt etiket rør med datoen for resuspension. Brug senest 6 måneder fra denne dato.
      Bemærk: Hver mus stamme har en forskellig følsomhed til bleomycin26. Teste forskellige doser af bleomycin for hver musen belastning anbefales. Musen stammer og de tilsvarende doser af bleomycin repræsentative forsøgsdyr er angivet i tabel 1.
  2. Mus
    1. Købe mus behov for eksperimentet og tillade mus 7 dage til at acclimate før injektion. Udføre infusioner i biosikkerhed hætte. Overføre dyr til huse i en ikke-BSL2 kompatibel værelse til et BSL2 rum ved hjælp af standard institutionelle procedurer før bleomycin infusion. Injicere mus på 6-8 ugens i alder.
      Forsigtig: Injicere mus efter institutionelle retningslinjer for farlige befuldmægtigede, biosikkerhed niveau 2 (BSL2) og IACUC godkendelse.
      Bemærk: Mus købt for de repræsentative forsøg er angivet i Tabel af materialer. Kun mandlige mus har været brugt.
  3. Lunge kræft cellelinjer
    1. Kultur ønskede cellelinjer i deres respektive medier. Før injektioner, udføre korte tandem repeat DNA profilering eller genetiske test for at sikre ordentlig celle nummer. For at lette i vivo og ex vivo billeddannelse, inficere cellelinjer med en lentivirus, udtrykker thymidine kinase, grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis) og luciferase fusion reporter27og sortere reporter positive celler af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) før engraftment. Teste linjer for mycoplasma hver 6 måneder.
      1. Kultur H2030 menneskelige cancer cellelinie som anbefalet af fabrikanten ved hjælp af Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) med 10% føtal bovint Serum (FBS), penicillin-streptomycin, og amphotericin B.
      2. Kultur 368T1 murine cellelinje (afledt af en KrasG12D; p53- / - mus) ved hjælp af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% FBS, penicillin-streptomycin, og amphotericin B.
      3. Kultur PC9 menneskelige cancer cellelinie ved hjælp af RPMI med 10% FBS, penicillin-streptomycin, og amphotericin B.

2. bleomycin behandling

  1. Planlæg at indsprøjtes mus intratracheally med bleomycin 14 dage før tumor celle engraftment.
  2. Tø bleomycin bestand på ice 2 h før injektion.
  3. Når optøet, fortyndes bleomycin til den ønskede arbejde koncentration (0,02 U/50 µL eller 0,005 U/50 µL), og hold det på køl.
    Bemærk: Koncentrationen af bleomycin afhænger mus stamme bruges til eksperimenter (tabel 1). Titrering af bleomycin i mus bør udføres for at bestemme optimal dosis.
  4. Forberede bedøvelse ved at fortynde ketamin og xylazin til en slutkoncentration på 10 mg/mL og 1 mg/mL, henholdsvis, ved hjælp af en 1 mL sprøjte og 27 G nål, bedøver hver musen ved at indsprøjte intraperitoneal ketamin/xylazin løsning på 100/10 mg/kg henholdsvis.
  5. Overvåge vejrtrækning af mus og ansætte en tå knivspids. Bekræfte korrekte anesthetization, når musen ikke reagerer på tå knivspids. Anvende vet salve på øjnene at forhindre tørhed under anæstesi.
  6. Sted 1 musen på et tidspunkt på en intubation platform ved at hænge sin forreste tænder med ryggen mod platformen.
  7. Belyse den øvre bryst ved hjælp af en fiber-optisk illuminator for at hjælpe med visualisering af luftrøret. Åbne munden på musen og trække tungen forsigtigt med steril flad pincet.
  8. Brug et intravenøst kateter uden nålen for at undgå blokering af åndedræt. Position kateter over det hvide lys udsendes fra åbningen af luftrøret.
  9. Indsæt kateteret ind i luftrøret, indtil toppen af kateteret når fortænderne. Bekræft korrekt placering af kateter i luftrøret ved at visualisere det hvide lys skinner gennem åbningen af kateteret i munden.
  10. Ved hjælp af en pipette, give afkald på 50 µL af bleomycin eller køretøj (PBS) direkte ind i kateteret at sikre, at hele mængden er indånding. Udføre dette trin under sterile forhold.
  11. Hvis kateteret er korrekt indsat, vil musen umiddelbart inhalere indholdet af kateteret. Vent et par sekunder, indtil hele diskenheden rejser ned kateteret. Derefter fjerne kateteret fra luftrøret og afhænde i 10% blegemiddelopløsning.
    Bemærk: Den gennemsnitlige tid per mus skridt 2,7-2.11 er omkring 5 min.
  12. Hvis musen ikke er indånde væsken, omhyggeligt overvåge vejrtrækning og justere positionen kateter. Hvis musen stopper vejrtrækning, fjerne kateteret straks og lade musen til at genoptage vejrtrækning normalt før genindføre kateteret.
  13. Sted den injicerede musen på en IACUC godkendt varmepude på ryggen på en flad overflade for recovery. Hele proceduren vil tage 10 min pr. mus. Returnere ikke et dyr, der har undergået injektion til selskab med andre dyr indtil fuldt tilbagebetalt.
  14. Placere et "Farlige kemiske i brug" kort på bur i 24 timer.

3. overvågning mus efter Intubation

  1. Overvåge mus for respiratorisk distress umiddelbart efter intubation og derefter hver 15 min, indtil mus vågne op fra anæstesi. Efterlad ikke mus uden opsyn indtil de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency.
  2. Injicere ketoprofen (5 mg/kg) intraperitoneal for at lindre smerter.
  3. Undersøge mus 24 timer post intubation og 3 gange om ugen for tegn på morbiditet.
  4. Registrere datoen for procedure, identifikation af dyr, type procedure, type af bedøvelsesmiddel, og postoperativ overvågning observationer med gange.
  5. Overvåge mus for vægttab, åndedrætsbesvær, adfærdsmæssige abnormiteter og en body condition score < 2 (segmentering af rygsøjlen tydeligt/dorsale bækken knogler er håndgribelig) bi-ugentlige efter injektion af bleomycin.
  6. Aflive mus under åndedrætsbesvær eller mus, der har oplevet 15% tab af body mass af CO2 eller af ketamin/xylazin efterfulgt af cervikal dislokation. Bekræfte eutanasi ved at foretage palpering for respiratorisk aktivitet.

4. engraftment af lunge adenocarcinom cellelinjer.

Bemærk: Udføre engraftment celler 14 dage efter injektion af bleomycin (trin 2.1).

  1. Tillad celler til at vokse i 75 cm2 kolber uforstyrret i 3 dage før dagen for injektion med tilsvarende medier som angivet i trin 1.3.
    Bemærk: De skal være 80% sammenflydende på dagen for injektion (hvilket svarer til 2-3 x 106 i hver kolbe afhængigt af linjen celle).
  2. Vaske cellerne vokser på 75 cm2 flasker med 5 mL PBS ved stuetemperatur.
  3. Opsug PBS og der tilsættes 1,5 mL trypsin til cellerne og inkuberes celler ved 37 ° C, indtil cellerne frigøre (typisk 2-5 min).
    Bemærk: Vi anbefaler kontrol hver 2 min til celle løsrivelse fra plasten af simple visualisering af bunden af kolben eller under et lysmikroskop. Overskrid ikke 5 min inkubation med trypsin.
  4. Neutralisere trypsin ved tilsætning af 4 mL af medier indeholdende 10% FBS (samme medier som skridt 4.1). Indsamle cellerne ind i en 15 mL rør og centrifugeres det ved 200 x g i 3 min. ved stuetemperatur.
  5. Opsug mediet og resuspenderes celle i 5 mL PBS at vaske cellerne. Der centrifugeres celler på 200 x g i 3 min. ved stuetemperatur at sammenpresse cellerne. Gentag denne 1 gang.
  6. Opsug PBS og resuspenderes i 1,5 mL PBS pr. flaske.
  7. Bland 50 µL af celle blanding med 50 µL af trypan blå og tælle de celler ved hjælp af en celle Counter/Hemocytometer kammer28.
  8. Forberede cellesuspension ved fortynding af celler i PBS til at injicere 1 x 105 celler (eller andre beløb er angivet) i 50 µL pr. mus. Hold celler på is inden injektionen.
    Bemærk: Forberede mindst to gange flere celler til injektion til at undgå at køre af cellesuspension.
  9. Forberede bedøvelse ved at fortynde ketamin og xylazin til en slutkoncentration på 10 mg/mL og 1 mg/mL, henholdsvis, ved hjælp af en 1 mL sprøjte og 27 G nål, bedøver hver musen ved at indsprøjte intraperitoneal ketamin/xylazin løsning på 100/10 mg/kg henholdsvis.
  10. Overvåge vejrtrækning af mus og ansætte en tå knivspids. Bekræfte korrekte anesthetization, når musen ikke reagerer på tå knivspids. Anvende vet salve på øjnene at forhindre tørhed under anæstesi.
  11. Sted 1 musen på et tidspunkt på en intubation platform ved at hænge sin forreste tænder med ryggen mod platformen.
  12. Belyse den øvre bryst ved hjælp af en fiber-optisk illuminator for at hjælpe med visualisering af luftrøret.
  13. Resuspend cellerne forsigtigt ved hjælp af en p200 pipette til Sørg for, at de ikke danner klumper. Åbne munden på musen og trække tungen forsigtigt med steril flad pincet.
  14. Bruge et intravenøst kateter med nål fjernet for at undgå blokering af åndedræt. Position kateter over det hvide lys udsendes fra åbningen af luftrøret.
  15. Indsæt kateteret ind i luftrøret, indtil toppen af kateteret når fortænderne. Bekræft korrekt placering af kateter i luftrøret ved at visualisere det hvide lys skinner gennem åbningen af kateteret i munden.
  16. Ved hjælp af en pipette, give afkald på 50 µL af celler direkte til kateter til at sikre, at hele mængden er indånding. Udføre dette trin under sterile forhold.
    Bemærk: Hvis kateteret er korrekt indsat, musen vil straks inhalere indholdet af kateteret.
  17. Vent et par sekunder, indtil hele diskenheden rejser ned kateter, og derefter fjerne kateteret fra luftrøret og afhænde i 10% blegemiddelopløsning.
  18. Hvis musen ikke er indånde væsken, omhyggeligt overvåge vejrtrækning og justere positionen kateter. Hvis musen stopper vejrtrækning, fjerne kateteret straks og lade musen til at genoptage vejrtrækning normalt før genindføre kateteret.
    Bemærk: Den gennemsnitlige tid per mus skridt 4,11-4.18 er omkring 5 min.
  19. Sted den injicerede musen på en IACUC godkendt varmepude på ryggen på en flad overflade for recovery.
    Bemærk: Hele proceduren vil tage 10 min pr. mus. Returnere ikke et dyr, der har undergået injektion til selskab med andre dyr indtil fuldt tilbagebetalt.
  20. Barbere det hele rib område både ventrally og dorsalt i B6129SF1/J og andre mus stammer med mørkt hår ved hjælp af en elektrisk barbermaskine før billeddannelse.
  21. 2-3 min efter celle indsprøjtning indsprøjtes 100 µL af luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) ved hjælp af en insulin nål. Suppleant øjet anvendes til injektion hver tænkelig session.
  22. Efter mindst 2 min, placere op til 5 mus i en animalsk bioluminescens imager i dorsal recumbency position og erhverve en ventrale billede ved hjælp af luminescence indstillinger29.
  23. Juster indstillingerne resolutionen og følsomhed for at måle luminescence af en given cellelinje under kontrolpanelet. For de fleste applikationer, start med 3 min (eller "Auto" hvis mættet), binning = Medium (4), F/Stop = 1, Field of View = D, emne højde = 1,50.
    Bemærk: Hvis injektionen er vellykket, opdages luminescence signal i området øvre bryst i én lunge eller begge lunger.
  24. Flip mus på brystbenet recumbency position og erhverve en dorsal billede som ovenfor.
    Bemærk: Hvis celle indsprøjtning ikke er udført korrekt, kan celler klynge ved indgangen af luftrøret eller i nakken.
  25. Injicere ketoprofen 5 mg/kg intraperitoneal til at lindre smerter.
  26. Flyt mus tilbage til deres bur og placere et "BSL-2 Agent i brug" kort på buret.
  27. Overvåge mus for respiratorisk distress umiddelbart efter intubation, og derefter hver 15 min, indtil mus vågne op fra anæstesi. Efterlad ikke mus uden opsyn indtil de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency.
  28. Undersøge mus 24 timer post intubation og tre gange om ugen for tegn på morbiditet.
  29. Holde post i logbogen af datoen for procedure, identifikation af dyr, type procedure, type narkose og postoperativ overvågning observationer og gange.
  30. Overvåge mus for vægttab, åndedrætsbesvær, adfærdsmæssige abnormiteter og en body condition score < 2 (segmentering af rygsøjlen tydeligt/dorsale bækken knogler er håndgribelig) bi-ugentlige efter podning af bleomycin.
    Bemærk: Mus med lungekræft tumorer kan udstille respiratorisk irritation, vægttab, kakeksi, eller død.
  31. Aflive mus under åndedrætsbesvær eller mus, der har oplevet 15% tab af body mass af CO2 eller af ketamin/xylazin efterfulgt af cervikal dislokation hvis indsamle væv. Bekræfte eutanasi ved at foretage palpering for respiratorisk aktivitet.

5. overvågning af tumorvækst af bioluminescens Imaging

  1. Gentag billeddannelse af mus på dag 3 efter engraftment og hver uge derefter.
  2. Bedøver mus ved at indsprøjte ketamin/xylazin (som beskrevet i trin 2,4-2,5) eller af inhaleret isofluran (2%). Overvåge vejrtrækning af mus og ansætte en tå knivspids at bekræfte korrekte anesthetization. Anvende vet salve på øjnene at forhindre tørhed under anæstesi.
  3. Barbere det hele rib område både ventrally og dorsalt i B6129SF1/J og andre mus stammer med mørkt hår ved hjælp af en elektrisk barbermaskine før billeddannelse.
  4. Når musene er under bedøvelse, indsprøjtes 100 µL af luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) ved hjælp af en insulin nål. Vente 2 min. suppleant øjet anvendes til injektion hver tænkelig session.
  5. Placere mus i imager og erhverve dorsal og ventral billeder som beskrevet i trin 4.22-4.24.
  6. Placere mus tilbage i buret efter imaging, på ryggen på en flad overflade for recovery.
    Bemærk: Hele proceduren vil tage 5 min pr. gruppe af 5 mus. Efterlad ikke mus uden opsyn indtil de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency.
  7. Analysere billeder ved hjælp af imager/bioluminescens analyse software.
    1. Vælg de relevante billeder og indlæse dem som en gruppe i bioluminescens analyse software.
    2. Klik på -værktøjet til Afkastningsgrad | square til at tilføje et firkantet område af interesse (ROI). Placer ROI over området øvre bryst, der dækker hele lunge billede. Gentag dette for hvert mus billede.
    3. Højreklik og vælg Kopier alle ROI funktion til at anvende den samme ROI på alle billeder i gruppen og placere dem i den øvre bryst af mus, både ventrale og dorsale udsigt.
    4. Vælg funktionen fotoner i øverste venstre hjørne af billedvinduet. Klik på funktionen foranstaltning Kontrolpanel for at måle ROIs. Kopiere og indsætte outputtabellen indeholdende samlede flux (fotoner/s) i en software valg til at analysere data yderligere.
    5. Normalisere den daglige ROI værdien af hver mus til ROI værdien målt på dag 0.

6. væv Isolation og behandling.

  1. Bedøver mus ved at indsprøjte ketamin/xylazin (som beskrevet i trin 2.4-2.5 eller af inhaleret isofluran (2%). Overvåge vejrtrækning af mus og ansætte en tå knivspids. Bekræfte korrekte anesthetization, når musen ikke reagerer på tå knivspids. Anvende vet salve på øjnene at forhindre tørhed under anæstesi.
  2. Indsprøjtes 100 µL af luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) ved hjælp af en insulin nål. Vente 2 min.
  3. Billede mus efter trin 4.22-4.24 fra denne protokol.
  4. Indsprøjtes i øjet fra trin 6.2 et andet 100 µL af luciferin retro-orbitally ved hjælp af en insulin nål forud for aktiv dødshjælp.
  5. Aflive mus ved intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin (Se trin 2.4 for detaljer) efterfulgt af cervikal dislokation, hvis musene er under dyb anæstesi efter retningslinjer fastsat af IACUC. Bekræfte eutanasi ved at foretage palpering for respiratorisk aktivitet.
  6. Ved hjælp af steril kirurgiske saks gøre en hud indsnit under brystbenet. Åbne muskel lag langs mellemgulvet ved hjælp af kirurgiske saks og pincet og udsætte brysthulen ved at skære gennem brystkassen på enten af de laterale sider at undgå interne thorax arterierne.
  7. Perfuse musen ved at lave et lille snit i højre atrium i hjertet og indsprøjtes 5 mL PBS gennem den venstre ventrikel. Farven af lungevæv vil gå fra rød til bleg lyserød-hvid Hvis blod perfusion gøres ordentligt.
  8. Punktafgifter lungerne fra brysthulen omhyggeligt ved at snuppe spiserøret eller hjerte med pincet. Forsigtigt trække væv og bruge kirurgisk saks til at forsigtigt skære forbinder væv undgå punktering af lungevæv. Bevare luftrøret så meget som muligt for inflation af lungerne airways på et senere trin.
  9. Vaske lungen ved nedsænkning og hvirvlende vævet 3 gange i en 6 godt tallerken fyldt med 3 mL PBS til at fjerne overskydende blod.
  10. Placer lunge på låget af en 6 godt plade, og låget lægges der indeholder væv i en bioluminescerende imager og erhverve en selvlysende billede30.
    Bemærk: Vi anbefaler at vælge følgende indstillinger fra "erhvervelse Kontrolpanel" "Field of view = A" og "emne højde = 0,75 cm" og derefter "automatisk eksponering" at undgå at få mættet billeder.
  11. Punktafgifter og image andre organer, som gjort i trin 6,9-6,10, hvor metastaser er blevet identificeret af luminescence, hjernen, leveren, binyrer, knogler, lymfeknuder, nyre eller milt31.
  12. Perfuse lunge med 1 mL af 4% PARAFORMALDEHYD ved at indsætte nålen ind i luftrøret af musen. Lungerne vil puste hvis godt perfused.
    Forsigtig: 4% PARAFORMALDEHYD er en giftig, en helbred hazard GHS07 og GHS08.
  13. Overføre lungerne i en 15 mL konisk med 5 mL 4% PARAFORMALDEHYD.
  14. Løse lungerne eller andre væv ved at inkubere væv med 4% PARAFORMALDEHYD natten over ved 4 ° C i en rystende enhed på 30-50 rpm.
  15. Integrere lungerne (eller andre væv) i paraffin eller optimal opskæring temperatur sammensatte afhængigt af anvendelsen32.
    Bemærk: Paraffin er den foretrukne metode til at bevare strukturen lunge og Masson Trichrome og hæmatoxylin-Eosin pletter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at øge effektiviteten af LUAD kræft celle engraftment i lungerne på mus, udviklet vi en protokol, der først pre betingelser luftvejene ved hjælp af bleomycin efterfulgt af orthotopic tumor celle indsprøjtning (figur 1). Vi bekræftede, at selv når det gives til immunkompromitterede athymiske mus, bleomycin induceret forbigående fibrose af dag 14 som det fremgår af tab af luftvejene arkitektur og øget kollagen deposition (figur 2). Brutto fibrose i disse mus løst 50 dage efter bleomycin injektion (figur 2, højre paneler) overensstemmelse med forudgående undersøgelser24.

Baseret på disse bemærkninger, vi aflægger LUAD celler af forskellig oprindelse i lungerne af forskellige mus stammer, der havde været præ aircondition med en enkelt dosis af køretøjet eller bleomycin 14 dage før. For eksempel, blev en suspension af LUAD celler fra den etablerede menneskelig LUAD cellelinje, H2030, leveret intratracheally i lungerne af athymiske mus. Efter 35 dage havde mus forbehandlet med bleomycin høje lunge tumor byrde som opdaget af bioluminescens (figur 3A). Omvendt, i køretøj-behandlede dyr, ingen tumorer blev registreret over den samme tidsramme (figur 3A). Lunge tumor byrde blev bekræftet ved histologi efter obduktion. Lungerne forbehandlet med køretøjet havde ingen tegn på tumor knuder paa bleomycin forbehandlet lungerne havde store tumor knuder (figur 3B). Ved hjælp af denne protokol, øget vi også engraftment af en anden menneskelig LUAD cellelinje til athymiske mus (PC9; Figur 3 c) og en murine LUAD-cellelinie, der blev sprøjtet ind i syngeneic immunkompetente B6129SF1/J mus (figur 3D). De tidlige læsioner observeret i bleomycin forbehandlet syngeneic mus var hovedsagelig grade 1 og 2 og var godt differentieret, der minder om tumorer opstår i situ fra KrasG12D / +; P53- / - GEMMs33. Alle aflægger LUADs voksede både i den proksimale og distale lunge (figur 3B, figur 3E, figur 3 g; asterisk (distale), star (proksimalt)). Etablering af PDXs fra lung cancer biospecimens (fra biopsier eller kirurgisk resektion) er relativt ineffektive, selv når humane celler er subkutant transplanteret ind alvorligt immundefekte dyr som hilsen scid gamma (NSG) musen stamme34. For at evaluere den potentielle anvendelse af vores metode til PDXs, vi også injiceres en yderst metastatisk celle delpopulation af linjen H2030 celle, kaldes H2030-BrM3 celler35, intratracheally i NSG mus, der havde været konditionerede med køretøjet eller Bleomycin. Vi bemærker at NSG mus kan være mere modtagelige for de giftige virkninger af bleomycin (data ikke vist) og at en lavere end 0,02 enheder pr. mus dosis er tilrådeligt, når du arbejder med denne stamme. Ikke desto mindre øget vores protokollen også markant engraftment og tumor byrde i lungerne af NSG mus (figur 3F, figur 3 g).

Vi næste anvendes denne protokol til at teste engraftment satser for at begrænse mængder af celler ved hjælp af H2030-cellelinie i athymiske mus. Mus forbehandlet med bleomycin blev sprøjtet med 5 x 105, 5 x 104eller 5 x 103 H2030 celler. 85,7-100% af mus udviklede lunge tumorer mellem 7 og 10 uger på alle fortyndinger testet (tabel 2). Vi konkludere at engraftment på et relativt lavt antal tumorceller i lungen er mulig, hvis musene er konditionerede med bleomycin. Samlet set vores protokollen kunne tilpasses flere stammer af mus og forskellige LUAD celle linje modeller til at øge engraftment kræftceller i lungerne fra 0-16,7% til 71.4-100% (tabel 2).

Endelig, for at vurdere den formodede kinetik af LUAD celle udvækst og metastatisk spredning fra bleomycin konditionerede lunger, vi karakteriseret funktionsmåden for meget metastatisk H2030-BrM3 celler ved hjælp af vores protokol. Efter orthotopic engraftment i køretøj-behandlede mus, tumor celle udmattelseskrig blev observeret af bioluminescens på dag 3 efter injektion og lunge tumorvækst ikke kunne registreres herefter eller ved slutpunktet (dag 35) (figur 4A, figur 4B). Omvendt har opdaget vi lunge tumor udvækst i mus forbehandlet med bleomycin så tidligt som i dag 7 efter injektion (figur 4A). Efter 39-57 dage af tumor ekspansion forbundet sygelighed og en bioluminescerende intensitet med høje lunge tumor byrde grænser analyse af dissemineret sygdom (data ikke vist). Derfor, vi filmede metastase i fjerntliggende organer ex vivo ved obduktion. I dyr, der havde lunge tumor byrde for 57 dage, kan små læsioner også påvises i væv som hjerne, lever, nyre, binyrerne og knogle hind lemmer ved variabel frekvenser (figur 4 c). Derfor, vi konkludere, at spontan dissemineret sygdom i klinisk relevante websteder kan genereres fra denne orthotopic metode.

Figure 1
Figur 1: metode til pre betingelse lungerne for tumor celle engraftment. Skematisk af den protokol, der bruges. Lunge skade udføres ved at indsprøjte bleomycin intratracheally. LUAD celler er derefter sprøjtet ind i luftrøret af mus 14 dage efter. Mus er derefter afbildet ugentligt for luminescence skærm tumor engraftment, vækst og fjern metastaser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Bleomycin bevirker forbigående lungefibrose og ECM remodeling. Repræsentative billeder af hæmatoxylin-Eosin (H & E) og Masson Trichrome farvning af lungerne fra køretøjet og bleomycin behandlede mus 14 dage efter injektion (peak af fibrose) og på 51 dage efter injektion (fibrose opløsning) i mangel af tumor celle injektion. Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: lunge engraftment af LUAD cellelinjer i flere musemodeller er steget i mus forbehandlet med bleomycin. A) athymiske mus forbehandlet med køretøjet eller bleomycin blev sprøjtet med 5 x 105 H2030 celler. Relative lunge tumor byrde på slutpunktet (dag 35 normaliseret til dag 0 efter injektion) er som målt ved bioluminescens afbildet. For hver gruppe, er en mus med median tumor byrde vist. n = 6-7 mus pr. gruppe. B) repræsentant H & E billeder af lungerne forbehandlet med køretøjet eller bleomycin fra A i dag 35. Stjerne = distal; Stjerne = proksimale. C) athymiske mus behandlet som i A blev sprøjtet med 1 x 105 PC9 celler. Tumor byrde og repræsentant billeder er målt og vist som i A. n = 7 mus pr. gruppe. D-E) B6129SF1/J mus forbehandlet med køretøjet eller bleomycin blev sprøjtet med 1 x 105 368T1 KrasG12D / + p53- / - (KP T-uden Met) celler. Tumor byrde, repræsentative billeder og H & Es er målt og afbildet som i A og B. n = 7 mus pr. gruppe. F-G) NSG mus forbehandlet med køretøjet eller bleomycin blev sprøjtet med 1 x 105 H2030-BrM3 celler. Tumor byrde, repræsentative billeder og H & Es (dag 9 og dag 10 Post injektion) er målt og fremgår som A og B. n = 3-6 mus pr. gruppe. Skalalinjen = 500 µm. indsatser = høj forstørrelse af tumor celle aflægger områder. Skalalinjen af mellemværker = 100 µm. p værdier beregnet ved Mann-Whitney test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: LUAD celler aflægger i bleomycin-behandlede mus metastaserer til flere fjerntliggende organer. A) athymiske mus forbehandlet med køretøjet eller bleomycin blev sprøjtet med 5 x 105 H2030-BrM3 celler. Lunge tumor byrde blev målt ugentligt bruger bioluminescens. Dorsale samlede photon flux normaliseret til dag 0 er vist. B) Tumor byrde af bioluminescens af lungerne fra A på slutpunktet (dag 35 efter injektion). For hver gruppe, er en mus med median tumor byrde vist. n = 6-7 mus pr. gruppe. C) repræsentative billeder af organer med påviselige metastaser fra samme mus på obduktion (venstre). Tabel med angivne frekvenser af mus med metastaser i fjerntliggende organer på slutpunktet (dag 39-57 efter engraftment) (højre). Ex-vivo organer med en bioluminescerende lyssignal over 1.5 x 104 fotoner / (SEK cm2 steradian) blev regnet som positive metastase. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Musen stamme Enheder/mus
Athymiske 0.02
NSG 0.02
B6129SF1/JØRGENSEN 0,005

Tabel 1: Liste over anbefalede doser af bleomycin for musen stammer testet.

Musen stamme Cellelinie Antal celler injiceres % engraftment p -værdi
Køretøj Bleomycin
Athymiske H2030 5 x 105 0% (0/7) 100% (6/6) 0.0006
Athymiske H2030 5 x 104 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Athymiske H2030 5 x 103 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Athymiske PC-9 1 x 105 0% (0/7) 85,7% (6/7) 0.0023
NSG H2030-BrM3 1 x 105 16,7% (1/6) 100% (3/3) * 0.0476
B6129SF1/JØRGENSEN 368T1 1 x 105 0% (0/7) 71.4% (5/7) * 0.0105

Tabel 2: Oversigt engraftment hyppighed (%) ved hjælp af de angivne mus stammer, cellelinjer og celle numre. Engraftment var bestemt af i vivo luminescence imaging og bekræftet af ex vivo billeddannelse med histologi af væv mellem 37 og 50 dage efter injektion. * Positive engraftment blev bekræftet af i vivo luminescence på dag 10 Post injektion.p værdier beregnet ved ensidig Fischers nøjagtige test. n.a. = ikke gældende; n.d. = ikke bestemmes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Slående kliniske paralleller er blevet dokumenteret mellem lungekræft og andre kroniske sygdomme i lungerne36. I særdeleshed patienter med idiopatisk lungefibrose (IPF) har en større forkærlighed for udvikle lungekræft, og denne forening er uafhængig af rygning historie37,38. IPF er karakteriseret ved fremadskridende ødelæggelse af lungen arkitektur og nedsat respiratoriske funktion gennem aflejring af ECM39. Også, efter kirurgisk resektion, tidlige fase NSCLC patienter med samtidige IPF har et dårligt resultat40. De fleste NSCLC tumorer indeholder en fibrotisk komponent på tidspunktet for diagnosen, og omfanget af denne stromale reaktion korrelerer med dårlig prognose18. Akut eller vedvarende vævsskader fra fibrose kan øge hyppigheden af tumordannelse på flere måder. For eksempel, efter skade, kan processen med epitelial regenerering udvide puljen af stamceller modtagelige for transformation. Alternativt, tilstrømning og funktion af forskellige immun celler kan hjælpe etablere en immunosuppressive mikromiljø, mens aktivering af myofibroblasts kan udskille vækstfaktorer eller deponere tumor-fremme ECM. Derfor vores metode til forudgående konditionering lungerne med en fibrose fremkaldende agent kan vise sig for at være særlig tilbøjelig til at studere virkningerne af lunge kræft co-morbiditet (f.eks. fibrose) og modellering NSCLC undertyper, som er rig på ekstracellulære matrix og en inflammatorisk stroma41.

Samlet set forbedret vores metode betydeligt engraftment af tumorceller injiceres airways via luftrøret. Denne bemærkning gælder for musen stammer med varierende grader af immunocompetence. Andre metoder til tumor celle indsprøjtning i lungerne omfatter hale vene injektion eller direkte injektion i lunge parenkym via brystvæggen. Specielt med henblik på at studere lunge kræft celle tumorigenisitetsforsøg, er disse metoder optimal, da den tidligere kræver tumorceller til at overleve i omløb og extravasate før udvækst (en proces mere beslægtet med metastaser i lungerne), mens sidstnævnte kan forårsage celler til at lække i pleural rummet hurtigt efter injektion (data ikke vist). Begge metoder kan forvirre loco-regional kvantificering af lunge kræft celle udvækst. Alternativt, sikrer vores protokol, at seedede tumorceller lagres først i luftvejene omgivet af lunge stroma. Afgørende for succes i denne protokol, er korrekt intubation af mus, tolerabel dosis af bleomycin, og timingen af luftvejene pre conditioning i forhold til tumor celle indsprøjtning. Vi viser også, at denne protokol tillader cellerne at efterfølgende formidle til andre væv, herunder hjernen. Selvom de sygelighed forbundet med lunge tumor byrde kan stadig begrænse omfattende karakterisering af fjerne macrometastasis, kan denne tilgang være nyttigt at kvantificere og studere cirkulerende tumorceller med oprindelse fra lungerne.

Trods fordelene ved metoden beskrevet heri, kan flere tekniske variabler påvirke den ultimative effektivitet af engraftment og overvågning af tumor progression. Først, det er veldokumenteret at bleomycin i mus fibrotisk reaktionen er stamme-afhængige. For eksempel, er C57Bl/6 mus mere tilbøjelige til fibrose i forhold til Balb/c mus42. Andet, følsomhed over for bleomycin er køn og alder afhængige. Vores erfaring er kvinder og yngre mus mere tilbøjelige til bivirkninger over den hele protokol. Dette kan begrænse tumordannelse undersøgelser der kræver direkte sammenligninger mellem mandlige og kvindelige, eller unge og gamle dyr. Derudover intratrakeal instillation af mus yngre end 7 uger er teknisk udfordrende og justeringer af kateter størrelse kan være påkrævet. For det tredje bleomycin er giftigt og kan være mutagene på grund af dens evne til at fremkalde DNA pauser. Det er vigtigt at teste den tolerable dosis af bleomycin for hver mus stamme før udførelse af eksperimenter. I dette bevis af princippet om undersøgelse giver vi anbefalede doser for mandlige mus på tværs af forskellige stammer. Desuden, er musene med mørk pels mindre egnet til en bioluminescerende imaging på grund af lav væv penetration og maskering af en bioluminescerende signalet af pels. Depilating mus kan forbedre billedet målinger, men alternative metoder kan også være ansat som magnetisk resonans og fluorescerende imaging ved hjælp af sonder af lang bølgelængde såsom TdTomato eller Katushka43. Endelig, den potentielle immunogenicitet af en given reporter protein bør overvejes, når du vælger en tumor påvisning modalitet for en given musemodel.

Bleomycin remodels distale lungerne ved første skadelige alveolaris type 2 (AT2) celler, som derefter regenererer i et forsøg på at reparere alveolerne44. Da AT2 celler er en af de store celletyper give anledning til NSCLC, kan forudgående konditionering lungerne med bleomycin også ændre indledningen og progression af tumorer opstår i situ fra GEMMs. Andre typer af skader, herunder influenza-infektion13 eller naphthalen instillation14, har vist sig at øge engraftment af menneskelige og murine lunge stem/stamceller. Navnlig, naphthalen skader stilk/stamfader celler i bronchio-alveolære vejkryds og øger potentielt tumor indledning i GEMMs45. Finjustere typen skade og luftvejene niche målrettet til aflægger celletyper kan yderligere optimere vores metode for at studere lung cancer allografts eller xenografts af forskellig oprindelse. Endelig foreslår vi, at denne metode kan være gennemført for den standard generation af lungekræft PDXs. Succesraten for oprettelse af lungekræft PDXs fra menneskelige biospecimens af subkutane transplantation i NSG mus er relativt lav (30-40%)46,47. Orthotopic vækst af PDXs kan ikke blot øge denne succesrate med begrænse mængder af prøven (fra menneskelige lunger), men også generere mere fysiologisk relevante betingelser at teste farmakokinetik og farmakodynamik af lunge kræft therapeutics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev finansieret af tilskud fra National Cancer Institute (R01CA166376 og R01CA191489 til D.X. Nguyen) og Department of Defense (W81XWH-16-1-0227 til D.X. Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair - To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. -
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) -
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , pdb prot078261 (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, Suppl 2. S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).

Tags

Medicin sag 136 lunge adenocarcinom orthotopic musemodeller intratrakeal injektion bleomycin engraftment metastaser
Forudgående konditionering luftvejene i mus med Bleomycin øger effektiviteten af Orthotopic lunge kræft celle Engraftment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stevens, L. E., Arnal-Estapé,… More

Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter