Summary
Vi beskriver en metode for å betydelig forbedre orthotopic engraftment av lungekreft cellene inn i murine lungene ved pre condition luftveiene med skade. Denne tilnærmingen kan også brukes for å studere stromal interaksjoner i lunge microenvironment, metastatisk formidling, lunge kreft Co-morbidities, og for å generere mer effektivt pasienten avledet xenografts.
Abstract
Lungekreft er en dødelig behandling ildfaste sykdom som er biologisk heterogene. For å forstå og effektivt behandle full klinisk spekteret av thorax malignitet, kreves det flere dyr modeller som kan recapitulate ulike menneskelige lunge kreft subtyper og stadier. Allograft eller xenograft modeller er allsidig og aktiverer kvantifiseringen tumorigenic kapasitet i vivo, bruke ondartede celler murine eller menneskelige opprinnelse. Imidlertid har beskrevet tidligere metoder for lunge kreft celle engraftment utført i ikke-fysiologiske steder som flanken av mus, på grunn av ineffektiviteten i orthotopic transplantasjon av celler i lungene. I denne studien beskriver vi en metode for å forbedre orthotopic lunge kreft celle engraftment ved pre condition luftveiene mus med fibrose inducing agent bleomycin. Som et proof-of-concept eksperiment brukt vi denne tilnærmingen å engraft kreftceller av lunge adenocarcinoma undertypen, innhentet fra musen eller menneskelig kilder, i ulike stammer mus. Vi viser at skadet luftveiene med bleomycin før svulst celle injeksjon øker engraftment av kreftceller fra 0-17% til 71-100%. Betydelig, denne metoden forbedret lunge svulst forekomsten og senere utvekst bruker ulike modeller og musen stammer. I tillegg spre engrafted lungekreft cellene fra lungene til relevante fjerne organer. Derfor gir vi en protokoll som kan brukes til å opprette og vedlikeholde nye orthotopic modeller av lungekreft med begrense mengder celler eller biospecimen og kvantitativt vurdere tumorigenic kapasitet av lunge kreftceller i fysiologisk relevante innstillinger .
Introduction
Lungekreft er ledende årsak til kreft relaterte dødsfall verden1. Pasienter med lungekreft bukke til slutt fra metastase å fjerne organer, særlig i det sentrale nervesystemet, lever, binyrene og bein2,3,4. Thorax malignitet er tradisjonelt klassifisert som småcellet lungekreft (SCLC) eller ikke-småcellet lungekreft kreft (NSCLC)5. NSCLC er mest vanlige diagnosen kreft og kan deles inn i ulike histologiske subtyper, inkludert lunge adenocarcinoma (LUAD) og lunge squamous celle carcinoma (LUSC)6. Genomic analyse av resected menneskelige primære lunge kreft har avdekket at svulster i en gitt histotype kan også uttrykke ulike molekylær forstyrrelser, ytterligere bidrar til deres forskjellige kliniske progresjon og forvirrer pasienten prognose. Den bemerkelsesverdige heterogeniteten av lunge kreft representerer en betydelig utfordring for rasjonell design, pre-klinisk testing og gjennomføring av effektive strategier. Derfor er det behov for å utvide repertoaret medgjørlig eksperimentelle lunge kreft modeller å studere ulike mobilnettet opprinnelse, molekylær subtyper, og stadier av denne sykdommen.
Ulike tilnærminger med dyr modeller har vært ansatt å studere lunge kreft i vivo, hver med sine egne fordeler og ulemper avhengig av på biologiske spørsmålene rundt. Genmodifiserte musen modeller (GEMMs) kan målrette bestemte genetiske endringer i en gitt stamfar celle type, som fører til svulster at fremgangen innen en immunkompetente vert7. Mens svært kraftig og klinisk relevante, være ventetid, variasjon eller lunge svulst sykelighet knyttet GEMMs uoverkommelige visse kvantitative mål og gjenkjenning av sent stadium metastasering i fjerne organer8. En utfyllende tilnærming er bruk av allograft modeller, der lunge kreftceller, hentes direkte fra en mus svulst eller avledet først som etablerte cellelinjer i kultur, er re-introdusert i syngeneic verter. Analogt, opprettes lunge kreft xenografts fra humane cellelinjer eller pasienten avledede svulst prøver. Human celle linje xenografts eller pasienten avledede xenografts (PDXs) er vanligvis opprettholdt i immunsupprimerte mus og derfor utelukke fullstendig immun-overvåking9. Til tross for denne ulempen gir de en avenue overføres begrense mengder av menneskelig biospecimens og studere grunnleggende i vivo egenskapene for menneskelig kreftceller, som kode for mer komplekse genomisk avvik enn GEMM svulster.
En nyttig egenskap av allografts og xenografts er at de er mottakelig for tradisjonelle begrensende celle fortynning analyser, ansatt å kvantifisere frekvensen av svulst starte celler (TICs) innenfor en ondartet celle befolkningen10. I disse eksperimentene, et definert antall celler er subcutaneously injiseres i flanken av dyr og hyppigheten av TICs kan beregnes basert på svulst ta rate. Subkutan svulster men kan være mer hypoxic11 og kan ikke modell fysiologiske begrensninger av lunge svulst microenvironment. Intratracheal levering av epitelial stammen eller progenitor celler inn i lungene of mus er en lunge regenerasjon og luftveier stamcelleforskningen biologi12. Men kan engraftment prisen fra denne teknikken være relativt lav, med mindre lungene er første utsatt for fysiologiske former for skader, virusinfeksjon13,14. Støtte fra stromal betennelsesceller og/eller avbrudd i lunge kjelleren membranen kan forbedre oppbevaring av transplantert celler i relevante stamcelleforskningen nisjer i distale airways15. Fibrose inducing agenter kan også pre tilstand lungene å forbedre engraftment av indusert pluripotent celler16 og mesenchymal stamceller17. Om lignende typer airway skade kan påvirke engraftment prisen, ennå svulst initiering kapasitet og utvekst av lungekreft cellene vurderes systematisk.
I denne studien beskriver vi en metode for å øke effektiviteten i orthotopic lunge kreft celle engraftment, ved pre condition lungene mus med skade. LUAD oppstår i distale luftveiene med en stor undergruppe av disse kreft utvikle en fibrotiske stroma18 som ofte samsvarer med dårlig prognose19. Bleomycin, en naturlig polypeptid hybrid peptid-polyketide, har blitt mye utnyttet for å indusere lungefibrose i mus20. Airway instillasjon av bleomycin fremmer først epithelial slitasje i alveoler og rekruttering av inflammatoriske celler, inkludert makrofager, nøytrofile og monocytter21. Dette etterfølges av vev remodeling i distale airways, kjelleren membran omorganisering22,23 og ekstracellulær matrix (EFM) deponering24. Effektene av en enkelt bleomycin injeksjon er forbigående, med fibrose løse etter 30 dager i de fleste studier25. Bruker både allograft og xenograft modeller, testet vi hvis pre condition luftveiene mus med bleomycin kan øke betydelig ta frekvensen av LUAD celler i lungene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble utført i henhold til protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Yale University.
1. Sett opp / forberedelse av reagenser.
-
Bleomycin
Forsiktig: Basert på den globalt harmoniserte System (GHS) for klassifisering og merking av kjemikalier, er bleomycin klassifisert som helsefarlig GHS08.- Forberede bleomycin i kjemisk hette. Resuspend 15 U i 5 mL steril fosfat bufret saltoppløsning (PBS).
- Aliquot 100-200 µL av løsningen i glass ampuller og fryse dem på 20 ° C for fremtidig bruk. Riktig merke rør der rørets. Bruk innen 6 måneder fra denne datoen.
Merk: Hver musen stamme har en annen følsomheten til bleomycin26. Teste ulike doser av bleomycin for hver musen stamme anbefales. Musen stammer og den tilsvarende doser av bleomycin representant forsøk er oppført i tabell 1.
-
Mus
- Kjøpe mus kreves for eksperimentet og la mus 7 dager å acclimate før injeksjon. Utføre infusjoner i biosikkerhet hette. Overføre dyr i et ikke-BSL2 kompatibel rom til et BSL2 ved hjelp av standard institusjonelle prosedyrer før bleomycin infusjon. Injisere mus for 6-8 ukens av alderen.
Forsiktig: Injisere mus etter institusjonelle retningslinjer for farlige agenter, biosafety nivå 2 (BSL2) og IACUC godkjenning.
Merk: Mus kjøpt for representant eksperimenter er oppført i Tabellen for materiale. Bare mannlige mus har blitt brukt.
- Kjøpe mus kreves for eksperimentet og la mus 7 dager å acclimate før injeksjon. Utføre infusjoner i biosikkerhet hette. Overføre dyr i et ikke-BSL2 kompatibel rom til et BSL2 ved hjelp av standard institusjonelle prosedyrer før bleomycin infusjon. Injisere mus for 6-8 ukens av alderen.
-
Lunge kreftcelle linjer
- Kultur ønsket cellelinjer i sine respektive medier. Før injeksjoner, utføre kort tandem gjenta genetisk fingeravtrykk eller genetisk testing for å sikre riktig celle identifikasjon. For å lette i vivo og ex vivo imaging, infisere linjer med en lentivirus uttrykke thymidine kinase, grønne fluorescerende protein (GFP) og luciferase fusion reporter27og sorterer reporter positiv celler ved fluorescens aktivert celle sortering (FACS) før engraftment. Teste linjer for mycoplasma hver 6 måneder.
- Kultur H2030 menneskelige kreft cellen linje som anbefalt av produsenten med 10% Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) Fetal Bovine Serum (FBS), penicillin-streptomycin og amfotericin B.
- Kultur 368T1 murint celle linje (avledet fra KrasG12D, p53- / - mus) ved hjelp av Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 10% FBS, penicillin-streptomycin og amfotericin B.
- Kultur PC9 menneskelige kreft celle linje med RPMI med 10% FBS, penicillin-streptomycin og amfotericin B.
- Kultur ønsket cellelinjer i sine respektive medier. Før injeksjoner, utføre kort tandem gjenta genetisk fingeravtrykk eller genetisk testing for å sikre riktig celle identifikasjon. For å lette i vivo og ex vivo imaging, infisere linjer med en lentivirus uttrykke thymidine kinase, grønne fluorescerende protein (GFP) og luciferase fusion reporter27og sorterer reporter positiv celler ved fluorescens aktivert celle sortering (FACS) før engraftment. Teste linjer for mycoplasma hver 6 måneder.
2. bleomycin behandling
- Planlegg å injisere mus intratracheally med bleomycin 14 dager før svulst celle engraftment.
- Tine bleomycin lager på is 2t før injeksjon.
- Når tint, fortynne bleomycin til ønsket arbeider konsentrasjonen (0.02 U/50 µL eller 0.005 U/50 µL) og holde den på is.
Merk: Konsentrasjonen av bleomycin, avhenger av musen påkjenningen brukes for eksperimenter (tabell 1). Titrering av bleomycin i mus skal utføres for å bestemme optimale dosen. - Forberede anestesi fortynne ketamin og xylazine til en siste konsentrasjon av 10 mg/mL og 1 mg/mL, henholdsvis, bruker en 1 mL sprøyte og 27 G nål, bedøve hver musen ved å injisere intraperitoneally ketamin/xylazine løsning på 100/10 mg/kg henholdsvis.
- Overvåke pust av mus og ansette en tå knipe. Bekrefte riktig anesthetization når musen ikke svarer til tå knipe. Bruk vet salve øyne å hindre tørrhet under anestesi.
- Sted 1 musen samtidig på en intubasjon plattform ved henging foran tenner med ryggen mot plattformen.
- Belyse øvre del av brystet med en fiberoptisk illuminator for å hjelpe til med visualisering av trachea. Åpne munnen av musen og trekke tungen ut forsiktig med sterilt flat tang.
- Bruke en intravenøs kateter uten nålen for å unngå blokkering puste. Posisjon kateter over hvitt lys ut fra åpningen av trachea.
- Sett inn kateter inn i luftrøret til toppen av kateter når foran tennene. Kontrollere riktig plassering av kateter i luftrøret ved å visualisere hvitt lys skinner gjennom åpningen av kateter i munnen.
- Bruker en pipette, dispensere 50 µL av bleomycin eller kjøretøy (PBS) direkte i kateter for å sikre at hele volumet er inhalert. Utføre dette trinnet under sterile forhold.
- Hvis kateter settes riktig, vil musen umiddelbart inhalerer innholdet i kateter. Vent noen sekunder til hele volumet reiser ned kateter. Deretter fjerne kateter fra luftrøret og kast i 10% bleike løsning.
Merk: Gjennomsnittstiden per musen trinn 2.7-2.11 er rundt 5 minutter. - Hvis musen ikke er inhaling væsken, nøye overvåke puste og Juster kateter posisjon. Hvis musen slutter å puste, fjerne kateter umiddelbart og la musen for å fortsette puste normalt før re-sette kateter.
- Sted injisert musen på en IACUC godkjent varmeputen på ryggen på flatt underlag for utvinning. Hele prosedyren tar 10 min per musen. Returner ikke et dyr som har gjennomgått injeksjon til selskapet av andre dyr til helt frisk.
- Plass en "Farlige kjemiske i bruk" kort på buret for 24 timer.
3. overvåking mus etter intubasjon
- Overvåke mus for luftveissykdom umiddelbart etter intubasjon og deretter hver 15 minutter til mus våkne bedøvelsen. Ikke la mus uovervåket før de har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
- Injisere ketoprofen (5 mg/kg) intraperitoneally for å lindre smerte.
- Undersøke mus 24 h innlegget intubasjon og 3 ganger i uken for tegn på sykelighet.
- Holde oversikt av prosedyren, dyr identifikasjon, typen prosedyre, type anestesi og postoperativ overvåking observasjoner med ganger.
- Overvåke mus for vekttap, luftveissykdom, atferdsmessige abnormiteter og kroppen tilstand poengsummen < 2 (segmentering av virvelsøylen tydelig/dorsal bekkenet bein er håndgripelig) bi-ukentlige etter injeksjon av bleomycin.
- Euthanize mus under luftveissykdom eller mus som har opplevd 15% tap av kroppsmasseindeks CO2 eller ketamin/xylazine etterfulgt av cervical forvridning. Bekreft euthanasia ved å gjennomføre palpasjon i luftveiene aktivitet.
4. engraftment av lunge Adenocarcinoma linjer.
Merk: Utfør engraftment celler 14 dager etter injeksjon av bleomycin (trinn 2.1).
- Tillate at celler vokse i 75 cm2 flasker uforstyrret i 3 dager før dagen for injeksjon med tilhørende medier som nevnt i trinn 1.3.
Merk: De bør være 80% confluent på dagen for injeksjon (som tilsvarer 2-3 x 106 i hver kolbe avhengig av den celle linjen). - Vask cellene vokser på 75 cm2 flasker med 5 mL PBS ved romtemperatur.
- Sug opp PBS og legge til 1,5 mL av trypsin i cellene og ruge cellene på 37 ° C til cellene koble (vanligvis 2-5 min).
Merk: Vi anbefaler å sjekke hver 2 min for cellen løsgjøring fra plast ved enkel visualisering av bunnen av flasken eller under en lys mikroskop. Ikke overstige 5 min med inkubering med trypsin. - Nøytralisere trypsin ved å legge 4 mL av mediet som inneholder 10% FBS (samme media som skritt 4.1). Samle cellene i en 15 mL tube og sentrifuge det 200 x g for 3 min ved romtemperatur.
- Sug opp media og resuspend celle pellet i 5 mL av PBS å vaske celler. Sentrifuge cellene på 200 x g for 3 min ved romtemperatur å pellets celler. Gjenta denne 1 gang.
- Sug opp PBS og resuspend pellet i 1,5 mL PBS per kolbe.
- Bland 50 µL av cellen blanding med 50 µL trypan blå og telle celler ved hjelp av en celle Counter/Hemocytometer kammeret28.
- Forberede celle suspensjon fortynne cellene i PBS å injisere 1 x 105 cellene (eller andre beløp angitt) i 50 µL per musen. Holde cellene på is før injeksjon.
Merk: Forberede minst to ganger mer celler for injeksjon for å unngå å kjøre av cellen suspensjon. - Forberede anestesi fortynne ketamin og xylazine til en siste konsentrasjon av 10 mg/mL og 1 mg/mL, henholdsvis, bruker en 1 mL sprøyte og 27 G nål, bedøve hver musen ved å injisere intraperitoneally ketamin/xylazine løsning på 100/10 mg/kg henholdsvis.
- Overvåke pust av mus og ansette en tå knipe. Bekrefte riktig anesthetization når musen ikke svarer til tå knipe. Bruk vet salve øyne å hindre tørrhet under anestesi.
- Sted 1 musen samtidig på en intubasjon plattform ved henging foran tenner med ryggen mot plattformen.
- Belyse øvre del av brystet med en fiberoptisk illuminator for å hjelpe til med visualisering av trachea.
- Resuspend cellene forsiktig bruke en p200 pipette for å sikre de ikke danner klumper. Åpne munnen av musen og trekke tungen ut forsiktig med sterilt flat tang.
- Bruk en intravenøs kateter med nålen fjernes for å unngå blokkerer puste. Posisjon kateter over hvitt lys ut fra åpningen av trachea.
- Sett inn kateter inn i luftrøret til toppen av kateter når foran tennene. Kontrollere riktig plassering av kateter i luftrøret ved å visualisere hvitt lys skinner gjennom åpningen av kateter i munnen.
- Bruker en pipette, dispensere 50 µL av celler direkte inn kateter for å sikre at hele volumet er inhalert. Utføre dette trinnet under sterile forhold.
Merk: Hvis kateter settes riktig, musen vil umiddelbart inhalerer innholdet i kateter. - Vent noen sekunder til hele volumet reiser ned kateter, og deretter fjerne kateter fra luftrøret og kast i 10% bleike løsning.
- Hvis musen ikke er inhaling væsken, nøye overvåke puste og Juster kateter posisjon. Hvis musen slutter å puste, fjerne kateter umiddelbart og la musen for å fortsette puste normalt før re-sette kateter.
Merk: Gjennomsnittstiden per musen trinn 4.11-4.18 er rundt 5 minutter. - Sted injisert musen på en IACUC godkjent varmeputen på ryggen på flatt underlag for utvinning.
Merk: Hele prosedyren tar 10 min per musen. Returner ikke et dyr som har gjennomgått injeksjon til selskapet av andre dyr til helt frisk. - Barbere hele vrbord området både ventrally og ytterst B6129SF1/J og andre musen stammer med mørkt hår bruker en elektrisk barbermaskin før bildebehandling.
- 2-3 minutter etter celle injeksjon, injisere 100 µL av luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) bruker en insulin nål. Alternative øyet brukes for injeksjon hver tenkelig økt.
- Etter minst 2 min, plassere opptil 5 mus i en dyr bioluminescens imager i dorsal recumbency posisjon og få en ventrale bildet med luminescence innstillinger29.
- Justere oppløsning og følsomhet for å måle luminescence av en gitt celle linje under kontrollpanelet. De fleste programmer starter med 3 min (eller "Auto" Hvis mettet), binning = middels (4), F/stopp = 1, synsfelt = D, emnet høyde = 1.50.
Merk: Hvis injeksjon er vellykket, luminescence signal er oppdaget i øvre del av brystet området, i en lunge eller begge lungene. - Vend mus på sternal recumbency posisjon og få et dorsal bilde som ovenfor.
Merk: Hvis celle injeksjon ikke utføres riktig, celler kan klynge ved inngangen av trachea eller i nakken. - Injisere ketoprofen 5 mg/kg intraperitoneally å lindre smerte.
- Flytt mus tilbake til deres buret og plassere en "BSL-2 Agent i bruk" kortet på buret.
- Overvåke mus for luftveissykdom umiddelbart etter intubasjon og deretter hvert 15 min til mus våkne bedøvelsen. Ikke la mus uovervåket før de har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
- Undersøke mus 24 h innlegget intubasjon og tre ganger i uken for tegn på sykelighet.
- Holde posten i loggboken av prosedyren, dyr identifikasjon, typen prosedyre, type anestesi og postoperativ overvåking observasjoner og ganger.
- Overvåke mus for vekttap, luftveissykdom, atferdsmessige abnormiteter og kroppen tilstand poengsummen < 2 (segmentering av virvelsøylen tydelig/dorsal bekkenet bein er håndgripelig) bi-ukentlige etter vaksinasjon av bleomycin.
Merk: Mus med lunge svulst kan utvise luftveier, vekttap, cachexia og død. - Euthanize mus under luftveissykdom eller mus som har opplevd 15% tap av kroppsmasseindeks CO2 eller ketamin/xylazine etterfulgt av cervical forvridning hvis samle vev. Bekreft euthanasia ved å gjennomføre palpasjon i luftveiene aktivitet.
5. overvåking av Tumor vekst av bioluminescens tenkelig
- Gjenta bildebehandling av musene på dag 3 etter engraftment og ukentlige etterpå.
- Bedøve mus ved å injisere ketamin/xylazine (som beskrevet i trinn 2.4-2.5) eller inhalert isoflurane (2%). Overvåke puste av mus og ansette en tå-knipe for å bekrefte riktig anesthetization. Bruk vet salve øyne å hindre tørrhet under anestesi.
- Barbere hele vrbord området både ventrally og ytterst B6129SF1/J og andre musen stammer med mørkt hår bruker en elektrisk barbermaskin før bildebehandling.
- Når mus er under narkose, injisere 100 µL av luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) bruker en insulin nål. Vente 2 min. alternativ øyet brukes for injeksjon hver tenkelig økt.
- Plasser mus i imager og hente dorsal og ventrale bilder som beskrevet i trinnene 4.22-4,24.
- Plasser mus tilbake til buret etter bildebehandling, på ryggen på flatt underlag for utvinning.
Merk: Hele prosedyren tar 5 minutter per gruppe 5 mus. Ikke la mus uovervåket før de har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. - Analysere bildene benytter imager/bioluminescens analyseprogramvare.
- Velg de aktuelle bildene og laste dem som en gruppe i bioluminescens analyseprogramvare.
- Klikk ROI verktøyet | square legge til en firkantet region av interesse (ROI). Plasser Avkastningen over øvre brystkassen, dekker hele lunge bildet. Gjenta dette for hvert musen bilde.
- Høyreklikk og velg Kopier alle avkastning funksjon bruke samme Avkastningen på alle bilder i gruppen og plassere dem i øvre del av brystet av mus, både ventrale og dorsal.
- I øvre venstre hjørne av biletvindauget, velger du funksjonen fotoner . Klikk funksjonen mål Kontrollpanel for å måle ROIs. Kopiere og lime inn utdatatabellen som inneholder totalt flux (fotoner/s) i en programvare av valget å analysere dataene ytterligere.
- Normalisere daglige Avkastningen verdien av hver musen til Avkastningen verdi målt på dag 0.
6. vev isolering og behandling.
- Bedøve mus ved å injisere ketamin/xylazine (som beskrevet i trinn 2.4-2.5 eller inhalert isoflurane (2%). Overvåke puste av mus og ansette en tå knipe. Bekrefte riktig anesthetization når musen ikke svarer til tå knipe. Bruk vet salve øyne å hindre tørrhet under anestesi.
- Injisere 100 µL av luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) bruker en insulin nål. Vente 2 min.
- Bildet mus etter trinn 4.22-4,24 fra denne protokollen.
- Injisere i andre øyet fra trinn 6.2 en annen 100 µL av luciferin retro-orbitally bruker en insulin nål før euthanasia.
- Euthanize mus ved intraperitoneal injeksjon av ketamin/xylazine (se trinn 2.4 for detaljer) etterfulgt av cervical forvridning hvis mus er under dyp anestesi retningslinjer gitt av IACUC. Bekreft euthanasia ved å gjennomføre palpasjon i luftveiene aktivitet.
- Bruke sterilt kirurgisk saks gjør en huden snitt under sternum. Åpne muskel laget langs membranen ved hjelp av tang og kirurgisk saks og utsette bryst hulrom ved å kutte gjennom ribbe buret på en av lateral sidene unngå interne thorax arteriene.
- Perfuse musen ved å gjøre et lite innsnitt i høyre atrium av hjertet og injisere 5 mL PBS gjennom venstre ventrikkel. Fargen på lungevev går fra rødt til blek rosa-hvitt hvis blodperfusjon gjøres riktig.
- Avgiftsdirektoratet lungene fra bryst hulrom nøye ved å flytte esophagus eller hjertet med tang. Forsiktig trekk vevet og bruke kirurgisk saks til å klippe tilkobling vev unngå punktering av lungevev. Bevare luftrøret som mulig for inflasjonen i lunge luftveiene i et senere trinn.
- Vaske lungene av submerging og virvlende vevet 3 ganger i en 6 godt plate fylles med 3 mL PBS å fjerne overflødig blod.
- Plasser lungene på lokket på en 6 godt plate, og sett lokket som inneholder vevet i bioluminescent imager og skaffe en selvlysende bilde30.
Merk: Vi anbefaler å velge følgende innstillinger "oppkjøpet kontrollpanelet" "synsfelt = en" og "Subject høyde = 0,75 cm" og deretter "Auto eksponering" å unngå å få mettede bilder. - Avgiftsdirektoratet og image andre organer, som i trinn 6,9-6.10, der metastasering har blitt identifisert ved luminescence, som hjerne, lever, adrenalin, bein, lymfeknuter, nyre eller milt31.
- Perfuse lunge med 1 mL av 4% paraformaldehyde ved å sette inn nålen inn i luftrøret museklikk. Lungene vil blåse opp hvis godt perfused.
Forsiktig: 4% paraformaldehyde er en giftig, en helse fare GHS07 og GHS08. - Overføre lungene til en 15 mL konisk med 5 mL 4% paraformaldehyde.
- Fastsette lungene eller andre vev av rugende vevet med 4% paraformaldehyde overnatting på 4 ° C i en risting enhet på 30-50 rpm.
- Bygge lungene (eller andre vev) i parafin eller optimal kutte temperatur sammensatte avhengig av programmet-32.
Merk: Parafinen er den foretrukne metoden å bevare lunge strukturen og Masson Trichrome og Hematoxylin-Eosin flekker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å øke effektiviteten i LUAD kreft celle engraftment inn i lungene mus, utviklet vi en protokoll som først pre forhold luftveiene med bleomycin etterfulgt av orthotopic svulst celle injeksjon (figur 1). Vi bekreftet at selv når det gis i immunsupprimerte athymic mus, bleomycin indusert forbigående fibrose dag 14 som gjenspeiles av tap av luftveiene arkitektur og økt kollagen avsetning (figur 2). Brutto fibrosis disse musene løst 50 dager legge bleomycin injeksjon (figur 2, høyre paneler) samsvar med tidligere studier24.
Basert på disse observasjonene, engrafted vi LUAD celler av ulike opphav i lungene til ulike musen stammer som hadde vært pre betinget med en enkelt dose av kjøretøy eller bleomycin 14 dager før. For eksempel ble en suspensjon av LUAD celler fra etablerte menneskelige LUAD celle linje, H2030, levert intratracheally inn i lungene of athymic mus. Etter 35 dager hadde mus forbehandlet med bleomycin høy lunge svulst byrden som oppdages av bioluminescens (figur 3A). Derimot i kjøretøy-behandlede dyr oppdaget ingen tumorer over samme tidsrom (figur 3A). Lunge svulst byrden bekrefter histology etter obduksjon. Lungene forbehandlet med bilen hadde bevis for svulst knuter mens bleomycin pre-behandlet lungene hadde stor svulst knuter (figur 3B). Bruker denne protokollen, økt vi også engraftment av en annen menneskelig LUAD celle linje i athymic mus (PC9; Figur 3 c) og en murine LUAD celle linje som ble injisert i syngeneic immunkompetente B6129SF1/J mus (figur 3D). Tidlig lesjoner i bleomycin pre-behandlet syngeneic mus var hovedsakelig klasse 1 og 2 og var godt differensiert, ligner svulster som oppstår i situ fra KrasG12D / +; p53- / - GEMMs33. Alle engrafted LUADs vokste i proksimale og distale lungene (figur 3B, figur 3E, Figur 3 g; stjerne (distale), star (proksimale)). Etablering av PDXs fra lunge kreft biospecimens (fra biopsier eller kirurgisk resections) er relativt ineffektiv, selv når menneskelige celler er subcutaneously transplantert inn i alvorlig immunodeficient dyr som hilsen scid gamma (NSG) musen belastning34. For å vurdere potensielle anvendelsen av vår metode til PDXs, vi også injisert en svært metastatisk celle sub-populasjon av H2030 celle linje, kalt H2030-BrM3 celler35, intratracheally i NSG musene som hadde vært pre betinget med kjøretøy eller bleomycin. Vi registrerer at NSG mus kan være mer utsatt for toksiske effekter av bleomycin (data ikke vist) og at en dose lavere enn 0.02 enheter per musen anbefales når du arbeider med denne belastningen. Likevel, vår protokollen også betydelig økte engraftment og svulst byrden i lungene NSG mus (figur 3F, Figur 3 g).
Vi brukte neste denne protokollen til å teste engraftment prisene begrense mengder celler med H2030 celle linjen i athymic mus. Mus pre-behandlet med bleomycin ble injisert med 5 x 105, 5 x 104eller 5 x 103 H2030 celler. 85.7-100% av musene utviklet lunge svulst mellom 7 og 10 uker på alle fortynninger testet (tabell 2). Vi konkludere med at engraftment av en relativt lav kreftceller i lungene er mulig hvis mus er pre betinget med bleomycin. Samlet våre protokollen kan skreddersys til flere stammer mus og ulike LUAD celle modeller å øke engraftment frekvensen av kreftceller i lungene fra 0-16,7% 71.4-100% (tabell 2).
Til slutt, for å evaluere den antatte kinetics av LUAD celle utvekst og metastatisk formidling fra bleomycin pre betinget lungene, vi preget virkemåten til svært metastatisk H2030-BrM3-celler med våre protokollen. Etter orthotopic engraftment i bilen-behandlet mus, svulst celle slitasje ble observert av bioluminescens dag 3 etter injeksjon og lunge tumorveksten kan ikke oppdages etterpå eller på endepunktet (dag 35) (figur 4A, figur 4B). Derimot fant vi lunge svulst utvekst i mus pre-behandlet med bleomycin så tidlig som i dag 7 etter injeksjon (figur 4A). Etter 39-57 dager av svulst ekspansjon forbundet sykelighet og bioluminescent intensitet med høy lunge svulst byrden grenser analyse av disseminert sykdom (data ikke vist). Derfor fotografert vi metastasering i fjerne organer ex vivo på obduksjon. I dyr som hadde lunge svulst byrden for 57 dager, kan små lesjoner også registreres i vev som hjerne, lever, nyre, binyrene og bein bakbeina på variabel frekvenser (figur 4C). Derfor vi konkludere med at spontan disseminert sykdom i klinisk relevante nettsteder kan genereres fra denne orthotopic-metoden.
Figur 1: metoden å pre tilstand lungene for svulst celle engraftment. Skjematisk av protokollen som brukes. Lunge skade er utført ved å injisere bleomycin intratracheally. LUAD celler er deretter sprøytes inn i luftrøret mus 14 dager etter. Mus er deretter fotografert ukentlig for luminescence skjermen svulst engraftment, vekst og fjern metastasering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Bleomycin forårsaker forbigående lunge fibrosis og ECM remodeling. Representant bilder av Hematoxylin-Eosin (H & E) og Masson Trichrome farging av lungene fra kjøretøy og bleomycin behandlet mus 14 dager etter injeksjon (peak på fibrose) og 51 dager etter injeksjon (fibrosis oppløsning) i fravær av svulst celle injeksjon. Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: lunge engraftment for LUAD linjer i flere musen modeller er økt i mus pre-behandlet med bleomycin. A) Athymic mus pre-behandlet med kjøretøy eller bleomycin ble injisert med 5 x 105 H2030 celler. Relativ lunge svulst byrden på endepunktet (dag 35 normalisert for dag 0 etter injeksjon) tegnes målt ved bioluminescens. For hver gruppe vises en mus med median svulst byrden. n = 6-7 mus per gruppe. B) representant H & E bilder av lungene pre-behandlet med kjøretøy eller bleomycin fra A på dag 35. Stjerne = distale; Star = proksimale. C) Athymic mus behandlet som i A ble injisert med 1 x 105 PC9 celler. Svulst byrden og representant bilder måles og vist i A. n = 7 mus per gruppe. D-E) B6129SF1/J mus pre-behandlet med kjøretøy eller bleomycin ble injisert med 1 x 105 368T1 KrasG12D / + p53- / - (KP T-ikke Met) celler. Svulst byrden, representant bilder og H & Es måles og avbildet som A og B. n = 7 mus per gruppe. F-G) NSG mus pre-behandlet med kjøretøy eller bleomycin ble injisert med 1 x 105 H2030-BrM3 celler. Svulst byrden, representant bilder og H & Es (dag 9 og dag 10 etter injeksjon) måles og vises som A og B. n = 3-6 mus per gruppe. Skala bar = 500 µm. innfelt = forstørring av svulst celle engrafted områder. Skala bar insets = 100 µm. p verdiene beregnes av Mann-Whitney testen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: LUAD celler engrafted i bleomycin-behandlet mus metastase å flere fjerne organer. A) Athymic mus pre-behandlet med kjøretøy eller bleomycin ble injisert med 5 x 105 H2030-BrM3 celler. Lunge svulst byrden ble målt med ukentlig bioluminescens. Dorsal totale Foton flux normalisert dag 0 vises. B) svulst byrden av bioluminesens av lungene fra A på endepunktet (dag 35 etter injeksjon). For hver gruppe vises en mus med median svulst byrden. n = 6-7 mus per gruppe. C) representant bilder av organer med synlig metastasering fra samme musen obduksjon (venstre). Tabell med angitt frekvenser for mus metastasering i fjerne organer på endepunktet (dag 39 til 57 etter engraftment) (høyre). Ex-vivo organer med visuelle bioluminescent signalet over 1,5 x 104 fotoner / (sek cm2 steradian) ble regnet som positive metastasering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Musen belastning | Enheter/mus |
| Athymic | 0,02 |
| NSG | 0,02 |
| B6129SF1/J | 0.005 |
Tabell 1: Liste over anbefalte doser av bleomycin for musen stammer testet.
| Musen belastning | Cellen linje | Antall celler injisert | % engraftment | p -verdi | |
| Kjøretøy | Bleomycin | ||||
| Athymic | H2030 | 5 x 105 | 0% (0/7) | 100% (6/6) | 0.0006 |
| Athymic | H2030 | 5 x 104 | nd | 85.7% (6/7) | na |
| Athymic | H2030 | 5 x 103 | nd | 85.7% (6/7) | na |
| Athymic | PC-9 | 1 x 105 | 0% (0/7) | 85.7% (6/7) | 0.0023 |
| NSG | H2030-BrM3 | 1 x 105 | 16,7% (1/6) | 100% (3/3) * | 0.0476 |
| B6129SF1/J | 368T1 | 1 x 105 | 0% (0/7) | 71.4% (5/7) * | 0.0105 |
Tabell 2: Sammendragstabellen av engraftment frekvensen (%) bruker angitt musen stammer, linjer og celle tall. Engraftment var bestemt av i vivo luminescence bildebehandling og bekreftet av ex vivo bildebehandling med histology av vev mellom 37 og 50 dager etter injeksjon. * Positive engraftment bekrefter i vivo luminescence på dag 10 etter injeksjonvil verdier beregnet av ensidig Fischer eksakt test. na = ikke tilgjengelig; nd = ikke bestemt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Slående klinisk paralleller dokumentert mellom lungekreft og andre kroniske sykdommer i lungene36. Spesielt pasienter med idiopatisk lungefibrose (IPF) har en økt forkjærlighet for utvikle lungekreft, og denne tilknytningen er uavhengig av røyking historie37,38. IPF er preget av progressiv ødeleggelse av lunge arkitektur og svekket lungefunksjon gjennom deponering av ECM39. Også etter kirurgisk resection har tidlig stadium NSCLC pasienter med samtidige IPF et dårlig resultat40. De fleste NSCLC svulster inneholder en fibrotiske komponent på diagnosetidspunktet, og omfanget av denne stromal reaksjonen korrelerer med dårlig prognose18. Akutt eller vedvarende vevsskade fra fibrose kan øke forekomsten av tumorigenesis på flere måter. For eksempel, etter skader, kan prosessen med epithelial gjenfødelse utvide utvalget av progenitor celler utsatt for transformasjon. Alternativt, strøm og funksjon av ulike immunceller kan hjelpe etablere en suppressive microenvironment, mens aktivering av myofibroblasts kan skille ut vekstfaktorer eller innskudd svulst-fremme ECM. Følgelig vår metode for pre condition lungene med en fibrose inducing agent kan vise seg for å være spesielt passende studerer effekten av lunge kreft Co-morbidities (f.eks fibrosis) og modellering NSCLC subtyper, som er rik på ekstracellulær matrix og inflammatorisk stroma41.
Overall, vår metode betydelig forbedret engraftment av kreftceller injisert i luftveiene via luftrøret. Denne observasjonen gjelder for musen stammer med varierende grad av immunkompetanse. Andre metoder for svulst celle injeksjon i lungene inkluderer halen blodåre injeksjon eller direkte injeksjon i lunge parenchyma via brystveggen. For den spesifikke formålet å studere lunge kreft celle tumorigenicity, er disse metodene sub-optimale, som tidligere krever kreftceller overleve i sirkulasjon og extravasate før utvekst (en prosess mer beslektet metastasering inn i lungene), mens sistnevnte kan forårsake celler å lekke ut i pleural plass snart etter injeksjon (data ikke vist). Begge metodene kan forvirre loco-regionale kvantifisering av lunge kreft cellen utvekst. Alternativt, våre protokollen sikrer at seeded kreftceller beholdes først i luftveiene omgitt av lunge stroma. Avgjørende for suksessen til denne protokollen, er riktig intubasjon av mus, tålelig dose av bleomycin, og tidspunktet for airway før condition i forhold til svulst celle injeksjon. Vi viser også denne protokollen at cellene å senere spre til andre vev, inkludert hjernen. Selv om sykelighet forbundet med lunge svulst byrden kan fortsatt begrense omfattende karakteristikk av fjernt macrometastasis, kan denne tilnærmingen være nyttig å kvantifisere og studere sirkulerende kreftceller som stammer fra lungene.
Til tross for fordelene med metoden beskrevet heri, kan flere tekniske variabler påvirke ultimate effektiviteten av engraftment og overvåking av svulst progresjon. Først, det er godt dokumentert at bleomycin i mus fibrotiske svaret er belastning-avhengige. For eksempel er C57Bl/6 mus mer utsatt for fibrose sammenlignet med Balb/c mus42. Andre er følsomhet for bleomycin kjønn og alder avhengig. I vår erfaring er kvinner og yngre mus mer utsatt for bivirkninger over hele protokollen. Dette kan begrense tumorigenesis studier krever direkte sammenligninger mellom mannlige og kvinnelige og unge og gamle dyr. Videre intratracheal instillasjon mus yngre enn 7 uker er teknisk utfordrende og kateter størrelsen justeringer kan være nødvendig. Tredje bleomycin er giftig og kan være mutagene på grunn av sin evne til å indusere DNA pauser. Det er viktig å teste tålelig dosen av bleomycin for hver musen stamme før du utfører eksperimenter. I dette bevis på prinsippet studie gir vi foreslått doser for mannlige mus over ulike stammer. I tillegg er mus med mørk pels mindre egnet for bioluminescent imaging på grunn av lav vev gjennomtrenging og maskering av bioluminescent av pelsen. Depilating mus kan forbedre bildet målinger, men alternative metoder kan også brukes som magnetisk resonans Imaging og fluorescerende bildevisning sonder av lang bølgelengde som TdTomato eller Katushka43. Til slutt, den potensielle immunogenisitet en gitt reporter protein bør vurderes når du velger en svulst oppdagelsen modaliteten for en gitt musemodell.
Bleomycin remodels distale lungene ved første skadelige alveolar type 2 (AT2) celler som deretter Regenerer forsøke å reparere alveoler44. Siden AT2 celler er en av de store celletyper å gi opphav til NSCLC, kan pre condition lungene med bleomycin også endre initiering og utviklingen av svulster som oppstår i situ GEMMs. Andre typer skader, inkludert influensa infeksjon13 eller naphthalene instillasjon14, har vist seg å øke engraftment av menneskelige og murine lunge stammen/stamfar celler. Spesielt naphthalene skader stem/stamfar celler i bronchio-alveolar veikryss og øker potensielt svulst innvielse i GEMMs45. Finjustering skade og luftveier nisje målrettet mot de engrafted celletyper kan videre optimere vår metode for å studere lunge kreft allografts eller xenografts av ulike opphav. Til slutt, foreslår vi at denne metoden kan implementeres for standard generasjon av lungekreft PDXs. Suksessrate på å etablere lungekreft PDXs fra menneskelige biospecimens ved subkutan transplantasjon i NSG mus er relativt lav (30-40%)46,47. Orthotopic vekst av PDXs kan ikke bare øke denne suksessrate med begrense mengder prøven (fra menneskelige lungen), men også generere mer fysiologisk relevante forhold å teste farmakokinetikken og pharmacodynamics av lung cancer therapeutics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av tilskudd fra National Cancer Institute (R01CA166376 og R01CA191489 å D.X. Nguyen) og Department of Defense (W81XWH-16-1-0227 til D.X. Nguyen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
| Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
| Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
| Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
| Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
| D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
| Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
| Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
| Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
| Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | - | To shave mice |
| Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
| Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
| Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
| IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
| Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
| BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
| Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
| 26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
| Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
| Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
| Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
| 6 well plate | Corning | C3516 | |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
| OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
| Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
| Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | - | |
| Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
| B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
| NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | - | |
| PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | - | |
| H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | - |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
- Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
- Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
- Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
- Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
- Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
- Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
- Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
- Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
- Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
- Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
- Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
- Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
- Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
- Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
- Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
- Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , pdb prot078261 (2015).
- Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
- Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
- Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, Suppl 2. S3-S10 (2004).
- Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
- Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
- Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
- Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
- Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
- Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
- Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
- Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
- Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).
