Summary
Здесь мы представляем протокол для неинвазивной оценки развития компетенции ооцитов осуществляется во время их в vitro созревания от Жерминаль везикул на стадии метафазы II. Этот метод сочетает в себе покадровой изображений с Велосиметрия изображение частиц (PIV) и нейросетевого анализа.
Abstract
Бесплодие клиники выиграют от возможность выбора развивающих компетентным против некомпетентных яйцеклеток с помощью неинвазивных процедур, тем самым повышая общий исход беременности. Мы недавно разработали классификацию метод, основанный на микроскопические прямом наблюдений ооцитов мыши во время их в vitro созревания из везикул Жерминаль (GV) до метафазы II стадии, затем анализ движения цитоплазмы происходящие в этот промежуток времени период. Здесь мы представляем подробные протоколы этой процедуры. Ооциты изолированы от взрослой полостная фолликулов и культивировали для 15 h внутри микроскопом, оборудованных для покадровой анализа при 37 ° C и 5% CO2. Снимки делаются в интервалах 8 мин. Изображения, анализируются с помощью метода Велосиметрия изображение частиц (PIV), который вычисляет для каждой ооцитов, профиль цитоплазматических скоростей движения (мезошкала), происходящие на протяжении всего периода культуры. Наконец мезошкала каждого одной яйцеклетки подаются через инструмент математических классификации (Feed вперед искусственные нейронные сети, ФЭНН), который предсказывает вероятность гамет развивающих компетентным или некомпетентных с точностью 91.03%. Этот протокол, для мыши, теперь может быть проверена на ооциты других видов, включая человека.
Introduction
Женское бесплодие является патологией, которая затрагивает все большее число женщин. По данным Всемирной организации здравоохранения около 20% супружеских пар являются бесплодными, с 40% за счет женского бесплодия. Кроме того, одна треть женщин, проходящих лечение рака (300 000 в год и 30 000 человек в год в США или Италии, соответственно) разработать преждевременное угасание функции яичников.
Стратегия по предотвращению бесплодия у больных раком является изоляции и криоконсервацию фолликулы до лечения онкологических заболеваний, следуют в vitro созревания (IVM) GV яйцеклеток до стадии MII (GV-MII переход). Наличие Неинвазивные маркеры ооцитов развития компетенции позволит улучшить оплодотворение и процессов развития и общей беременность успех1,2.
На основе конфигурации их хроматина, наблюдается после окрашивания с supravital флюрохром Hoechst 33342, млекопитающих взрослой ооциты классифицируются либо как окружили ядрышко (SN) или не окружили ядрышко (NSN)3. Помимо их организации различных хроматина эти два типа ооциты отображения многих Морфологические и функциональные различия3,4,5,6,7,8 ,9, включая их meiotic и развития компетенции. Когда изолированный от яичника и созрела в пробирке, оба типа ооциты достигают стадии MII и после осеменения спермы, разработки к стадии 2-клеток, но только те, с Организацией хроматина SN может развиться в срок9. Хотя хорошо, как метод классификации для выбора компетентного против некомпетентных ооцитов, главным недостатком является мутагенным эффект, который флюрохром, сам и, прежде всего, УФ света, используемого для его обнаружения может иметь на клетки.
По всем этим причинам мы искали другие Неинвазивные маркеры, связанные с SN или NSN хроматина конформации, что может заменить использование Hoechst при сохранении высокой классификации точности. Промежуток времени наблюдения цитоплазматических скоростей движения (мезошкала) функция становится отличительной ячейки статуса. Например недавние исследования показали, что связь между мезошкала записан в момент оплодотворения и способность мыши и человека зигот полный предимплантационной и развития доношенных10,11.
Основываясь на этих более ранних исследований, мы опишем здесь платформу для признания развивающих компетентным или некомпетентных мыши взрослой ооциты5,6,,78. Платформа базируется на трех основных шагов: 1) ооцитов, изолированных от полостная фолликулов сначала классифицируются на основе их хроматина конфигурации либо как окружении ядрышко (SN) или не окружении ядрышко (NSN); 2) промежуток времени изображения мезошкала, происходящих во время GV-MII перехода каждого одной яйцеклетки берутся и проанализированы с частиц изображения Велосиметрия (PIV); и 3) данные, полученные с PIV анализируются с канал вперед искусственной нейронной сети (FANN) для слепых классификации12,13. Мы предоставляем подробную информацию о наиболее важных этапов процедуры, предназначенные для мыши, чтобы сделать его готовы для быть протестированы и использованы для других видов млекопитающих (например, говядину, обезьян и людей).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных были утверждены институциональный уход животных и использования и этические комитетам в университете Павии. Животные были сохранены в условиях 22 ° C, влажность воздуха 60% и свет/темно цикл 12:12 ч.
1. яичник изоляции
- Придать внутрибрюшинно 2 четырех до одиннадцати недельных CD1 самок мышей с 10 U фолликулостимулирующего гормона с шприц 1 мл стерильного раствора инсулина.
- Подождите, 46-48 ч.
- Весят мыши и анестезировать с внутримышечной инъекции 50 мг/кг Zoletil (Tiletamina и Zolazepan cloridrate). Усыпить шейки матки дислокации.
- Возьмите кожи, охватывающих брюшной стенки с помощью пары рассечение щипцов. Вырезать кожу и тело стены с ножницами и тянуть разрез с щипцами.
- Используя пинцет, переместите кишки сторону, выявить маточные рожки и локализовать яичников на их конечности.
- Аккуратно провести яичника, используя пинцет часовщик и используйте ножницы, чтобы вырезать его связки матки. Повторите с другой яичник.
- Перенесите собранные яичников в 35-мм ячейку культуры Петри содержащие 1 мл м2 изоляции среды предварительно нагревают при 37 ° C, 5% CO2 в воздухе.
- Удалите жир и маточных труб, с помощью тонкой ножницы под стереомикроскопом.
2. изоляция Cumulus ооцитов комплексов
- Пункции яичников поверхности с помощью стерильных пинцетов и иглы стерильные инсулина 1G пока пассивно выпускаются полостная кучевые ооцитов комплексы (КОК).
- Собирать Кок с более чем тремя слоями клеток кучевые, используя контролируемые рот вытащил руку Пастер микропипеткой (200 мкм в диаметре) и перенести их в 300 мкл капли свежего м2 средний.
- Удалите кучевые клеток, окружающих ооцитов, используя руку потянул микропипеткой Пастера (80 мкм в диаметре), осторожно закупорить и выходить за несколько секунд,
- Неоднократно передачи ооциты от 20 мкл капли среднего м2 на другой, пока кучевые клетки полностью устранены.
3. chromatin классификация на основе Организации ооцитов
- Подготовьте Hoechst 33342 окрашивание раствора в конечной концентрации 0,05 мкг/мл в м2 средний начиная с маточный раствор 5 мг/мл разбавленной в однократном ПБС.
- 3.5 место мкл микро каплями Hoechst, окрашивание раствора в нижней части крышки Петри 35 мм.
- Перевести каждый одной яйцеклетки в Hoechst, окрашивание падение, поместите блюдо на тарелку Отопление подогретым (37 ° C) и накрыть темной крышкой, чтобы избежать света экспозиции.
- После 10 минут инкубации при комнатной температуре наблюдать яйцеклеток с флуоресцентным микроскопом при 10-кратном под УФ света (330-385 Нм), не более 1-2 секунд.
- Ооциты можно отнести окружении ядрышко (SN) (рис. 1а), если они представляют кольцо Хехст положительных хроматина, окружающих ядрышка.
- Ооциты можно отнести не окружены ядрышко (NSN), если их ядрышко не окружен Хехст позитивных хроматина и показывает разогнать гетерохроматиновые пятна в ядре (рис. 1B).
4. нейронные сети ооцитов классификации
- Подготовить четыре 2 мкл капельки α-MEM среды дополнены с 5% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным, 2 мм L-глютамином, таурином 5 мм, 100 ед/мл пенициллин, 75 мкг/мл стрептомицина и пируват натрия 23,5 мкг/мкл в 35-мм стекла дно Петри и покрыть их с подогретым (37 ° C) и предварительно уравновешенной минерального масла, чтобы избежать средних испарения.
Примечание: При использовании живой клетки скрининг системы, держите капли на определенном расстоянии, используя сетку Рисованные 7 мм × 7 мм в качестве ориентира. - Ооциты передачи 3 - 4 для каждой капли.
- Поместите дно стекла Петри в живой клетки скрининг системы, оборудованные с покадровой записи программного обеспечения (см. Таблицу материалы), которая позволяет наблюдать созревание яйцеклетки в среде с стабильная температура (37 ° C) и CO2 концентрация (5%).
- Откройте покадровой записи программного обеспечения. На экране появляется окно с живой выстрел из яйцеклетки на левой стороне и все настройки кнопки на правой стороне.
- Выберите центр яйцеклетки для его размещения в центре экрана. При необходимости отрегулируйте фокус.
- Выберите кнопку Ph и задайте Диаметр лампа 192; время экспозиции для 1/125 s; получить до 1.99; и резолюцию 1600 x1200.
- Выберите FL2 и задайте Диаметр лампа 5; время экспозиции 3 s; получить до 2.37; и резолюцию 1600 x1200.
- Выберите кнопку Новая точка для того чтобы записать ооцитов позицию внутри падение культуры. Повторите такое же обычное дело для каждого яйцеклетки в падение культуры.
- Выберите время и установите приобретение цикла Общее время до 15 ч.и 8 мин .
- Выберите начать промежуток времени для запуска цикла записи.
- Откройте программное обеспечение MATLAB и писать >>cell_piv; и выберите Инструмент PIV.
- Выберите папку, содержащую записанный фильм и выберите любой из файлов .jpeg для загрузки последовательности всей изображений. Для каждого ооцитов выберите регион интерес (ROI), нажав кнопку, выберите инструмент «область».
- В меню Файл выберите Процесс PIV . Выберите кнопку панели Инструментов просмотра .
Примечание: Программа будет вычислить векторов скорости в пределах ROI и автоматически создает файл данных, сохраненный как файл .mat. - Выберите файл .mat, чтобы открыть. Выберите кнопку ROI, выберите инструмент и нарисуйте круг вокруг наброски ооцитов. Нажмите кнопку Сохранить в меню файл.
Примечание: Теперь отображаются векторов в этом регионе и звёздной данных в окне Диаграмма обновляется для этой новой ROI. - Открытой собранных звёздной весь промежуток времени кадров записаны данные в электронную таблицу, с, в строках, последовательность кадров и на столбцы, каждая одной яйцеклетки проанализированы.
- Организуйте данные NSN и SN яйцеклеток на 10 подгруппы.
- Используйте 9 подгрупп итеративно обучить корма вперед искусственных нейронных сетей (FANN) и 1 подгруппа для слепого тестирования.
- Повторить еще 9 раз, изменяя слепого тестирования образца (десятикратного перекрестной проверки).
- Откройте MATLAB, запустить заказные сценарий основных и, по запросу, вставьте имя файла с обучающих данных (train.txt), количество NSN и SN ооцитов, используемых для подготовки и промежуток времени интервала для анализа (как правило, от кадр # 1-2 кадр # 112-113).
- Нажмите Ввод для выполнения подготовки.
- Вставьте имя файла с проверочными данными (test.txt).
- Откройте вектор test_outputs_cyt в пространстве МАТЛАБА.
Примечание: Окно появляется на экране показаны в первой строке, вероятность получить истинное срабатываний (ТП или True NSN) и ложных срабатываний (FP или ложных NSN) для NSN и SN ооцитов, соответственно; Вместо этого во втором ряду, вероятность получения ложных негативы (FN или ложных SN) и истинный негативы (TN или True SN) для NSN и SN ооцитов, соответственно. - По формуле: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), для вычисления ФЭНН точность, выраженное в процентах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 показывает представитель развивающих компетентным и некомпетентных ооцитов, соответственно в начале (GV) и в конце (MII) процедуры КБПБ. IVM взрослой мыши яйцеклеток происходит во время 15 h культуры. Промежуток времени наблюдения записывает прогрессирование мейоз и обнаруживает крупных meiotic мероприятий, включая GVBD и экструзии первого полярного тельца.
Анализ и сравнение более чем двести развивающих компетентным против некомпетентных ооциты показал время различия в прогрессировании мейоз. В частности в NSN ооцитов, GVBD значительно задерживается покадровой кадров 1-2, тогда как PB1 экструзии происходит с задержкой 15 кадров. Несмотря на эти различия изменчивость слишком высоки, чтобы позволить одной яйцеклетки классификации. По этой причине процедура осуществлялась с помощью математической классификации.
Рисунок 3 показывает, использована схема математической классификации инструмента, именованные корма вперед искусственной нейронной сети (FANN). Для каждого ооцитов, кормили через ФЭНН одновременно дает вероятность того, что гамет развивающих компетентным и вероятность того, что это некомпетентность ооцитов. В наших экспериментах ФЭНН классифицированы ооцитов мыши со средней точностью 91.03%.
Рисунок 1 . Представитель SN и NSN ооциты витражи с Hoechst 33342. После изоляции и пятнать с флюрохром Hoechst 33342, взрослой ооциты классифицируются либо как окружили ядрышко (SN) (A) или не окружили ядрышко (NSN) (B), в зависимости от наличия (стрелка) или отсутствия, соответственно, кольца Гетерохроматин Хехст позитивных, окружающих ядрышка. Линейки: 5 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Анализ изображения Велосиметрия частиц покадровой изображений. Результаты анализа PIV приведены ниже изображение ярко поля для каждого из 113 покадровой кадров проанализированы. На рисунке показано начало (GV) и конец (MII) процесса записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Схематическое представление канала вперед искусственные нейронные сети. ФАНСКИЕ является математической инструмент, используемый для классификации яйцеклеток как развивающих компетентным или некомпетентности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует несколько важных шагов, которые одно должно заботиться о при выполнении настоящего Протокола с ооцитов мыши, а также с представителями других видов. После изолированы от их фолликулов, ооциты должны быть немедленно переданы в записи капли, как разъединение от компаньон кучевые клетки триггеры начало перехода GV-MII. Возможные изменения к настоящему Протоколу может быть добавлением 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) средний м2, используется для изоляции Кок. IBMX предотвращает немедленного запуска GV-MII перехода и позволяет синхронизацию всей экспериментальной группы яйцеклеток.
Живой клетки скрининг система, используемая в наших экспериментах (см. Таблицу материалы) ограничивает количество капель созревания до 4 с 4 яйцеклеток на каплю, таким образом, чтобы в общей сложности 16 яйцеклеток на эксперимент. Это ограничение можно преодолеть с помощью других покадровой живой клетки Скрининг систем, коммерчески доступных и оснащены несколькими камерами культуры.
Основываясь на нашем опыте, запись интервал между рамой и ниже является критической точкой. После ряда предварительных экспериментов мы взяли изображения каждые 8 минут потому что это было минимальное время окно, что позволило четкое наблюдение основных событий, происходящих во время перехода GV-мии, как разбивка Жерминаль vescicle и экструзии из первого полярного тельца. Это время окно может потребоваться быть переоцениваются при наблюдении ооциты других видов.
Недостатком этого метода является культура яйцеклеток в отсутствие их окружающих клеток кучевые, как последние известны для дальнейшего улучшения GV-MII перехода. В этой связи наша лаборатория в теперь тестирования незначительное изменение протокола сообщил, включая культуру cumulus бесплатно яйцеклеток после кучевые слой клетки фидера.
По своей природе ФЭНН имеет фиксированное количество ввода (количество анализируемых ЦМВ модулей) и выходного (либо развивающих компетентным или некомпетентных ооцитов) нейронов, но количество скрытых нейронов выбирается следователем через суд и коррекция подход для получения лучших результатов прогноза. В нашем случае мы экспериментировали с разным количеством скрытых нейронов и обнаружил, что три дает наилучшие результаты. Кроме того ФЭНН анализы требуют большое количество входных данных (в наших экспериментах 112 ЦМВ модулей) для получения надежных статистических данных. Возможные улучшения, которая могла бы уменьшить количество необходимых исходных данных является использование альтернативных классификации инструменты, такие как поддержка векторных машина, дерево мешок, или KNN классификаторов. Когда ФЭНН анализ свидетельствует о его надежности, шаг 1 может быть исключены из процедуры.
Этот протокол, для мыши, могут быть проверены на ооциты других видов, включая человека. Кроме того сочетание покадровой записи с PIV и нейронные сети, анализ может использоваться для наблюдения за мезошкала в зигот10,11 и предимплантационная эмбрионов для оценки их дальнейшего потенциал развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа стала возможной благодаря для поддержки: Университет Павии ФРГ 2016; Пармский университет филь 2014, 2016; и движение за предоставление пластик, необходимые для проведения этого исследования. Мы благодарим д-р Шейн Виндзор (инженерный факультет, Бристольский университет, Великобритания) за предоставление программного обеспечения Cell_PIV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
