Summary
यहाँ, हम कीटाणु पुटिका से metaphase द्वितीय चरण के लिए अपने में इन विट्रो परिपक्वता के दौरान प्रदर्शन किया oocyte विकासात्मक क्षमता के गैर इनवेसिव मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. इस विधि समय-चूक इमेजिंग कण छवि velocimetry (PIV) और तंत्रिका नेटवर्क विश्लेषण के साथ जोड़ती है ।
Abstract
बांझपन क्लीनिक गैर इनवेसिव प्रक्रियाओं का उपयोग कर, इस प्रकार समग्र गर्भावस्था के परिणाम में सुधार करने के लिए अक्षम अंडाणुओं के विकास के लिए सक्षम बनाम चयन करने की क्षमता से लाभ होगा । हम हाल ही में एक वर्गीकरण माउस अंडाणुओं के सूक्ष्म रहते टिप्पणियों के आधार पर विधि विकसित अपने इन विट्रो परिपक्वता के दौरान कीटाणु पुटिका (जी. वी.) से metaphase द्वितीय चरण के लिए, cytoplasmic आंदोलनों के विश्लेषण के बाद इस समय चूक अवधि के दौरान होने वाली । यहां, हम इस प्रक्रिया के विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । अंडाणुओं पूरी तरह से अलग कर रहे है कोटरीय रोम और एक समय के लिए सुसज्जित माइक्रोस्कोप के अंदर 15 घंटे के लिए-चूक विश्लेषण में ३७ ° c और 5% CO2। चित्र 8 मिनट के अंतराल पर लिया जाता है । छवियों कण छवि Velocimetry (PIV) विधि है कि गणना करता है का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं, प्रत्येक oocyte के लिए, Cytoplasmic आंदोलन वेग (CMVs) के प्रोफ़ाइल संस्कृति अवधि के दौरान होने वाली । अंत में, प्रत्येक एकल oocyte के CMVs एक गणितीय वर्गीकरण उपकरण के माध्यम से खिलाया जाता है (फ़ीड-आगे कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क, फैंन), जो एक gamete की संभावना की भविष्यवाणी के लिए विकास सक्षम या ९१.०३% की एक सटीकता के साथ अक्षम है । इस प्रोटोकॉल, माउस के लिए स्थापित है, अब मानव सहित अंय प्रजातियों के अंडाणुओं पर परीक्षण किया जा सकता है ।
Introduction
महिला बांझपन एक विकृति है कि महिलाओं की बढ़ती संख्या को प्रभावित करता है । विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, जोड़ों के लगभग 20% ऊसर हैं, एक ४० महिला बांझपन के कारण% के साथ । इसके अलावा, एक तिहाई महिलाओं के कैंसर के उपचार के दौर से गुजर (300000/वर्ष और 30000/वर्ष संयुक्त राज्य अमेरिका या इटली में, क्रमशः) समयपूर्व डिम्बग्रंथि विफलता का विकास ।
एक रणनीति कैंसर रोगियों में बांझपन को रोकने के लिए अलगाव और आंकलोजिकल उपचार से पहले डिम्बग्रंथि कूप के cryopreservation है, इसके बाद इन विट्रो परिपक्वता (IVM) जीवी अंडाणुओं के लिए मिि चरण (जीवी-to-मिि संक्रमण) । oocyte विकासात्मक क्षमता के गैर इनवेसिव मार्कर की उपलब्धता निषेचन और विकासात्मक प्रक्रियाओं और समग्र गर्भावस्था सफलता1,2में सुधार होगा ।
उनके क्रोमेटिन विंयास के आधार पर supravital fluorochrome Hoechst ३३३४२ के साथ धुंधला के बाद मनाया, स्तनधारी पूरी तरह से उगाया अंडाणुओं या तो एक घेर Nucleolus (SN) या एक नहीं घिरा Nucleolus (NSN)3के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं । उनके अलग क्रोमेटिन संगठन के अलावा, इन दो प्रकार के अंडाणुओं प्रदर्शित कई रूपात्मक और कार्यात्मक मतभेद3,4,5,6,7,8 ,9, उनके meiotic और विकासात्मक क्षमता सहित । जब अंडाशय से अलग और इन विट्रो मेंपरिपक्व, अंडाणुओं के दोनों प्रकार के मिि चरण तक पहुंचने, और शुक्राणु गर्भाधान के बाद, 2-सेल चरण के लिए विकसित है, लेकिन केवल एक SN क्रोमेटिन संगठन के साथ उन के लिए विकसित कर सकते है अवधि 9। हालांकि सक्षम बनाम अक्षम अंडाणुओं के चयन के लिए एक वर्गीकरण विधि के रूप में अच्छा है, मुख्य दोष mutagenic प्रभाव है कि fluorochrome ही है और, सब से ऊपर, इसकी पहचान के लिए इस्तेमाल किया यूवी प्रकाश कोशिकाओं पर हो सकता है ।
इन सभी कारणों के लिए, हम एक ही उच्च वर्गीकरण सटीकता को बनाए रखते हुए Hoechst का उपयोग स्थानापन्न सकता है कि SN या NSN क्रोमेटिन अनुरूपता के साथ जुड़े अन्य गैर इनवेसिव मार्करों के लिए खोज की. Cytoplasmic मूवमेंट वेग (CMVs) का समय-चूक अवलोकन कोशिका स्थिति की एक विशेषता ौली के रूप में उभर रहा है. उदाहरण के लिए, हाल के अध्ययनों से निषेचन के समय में दर्ज CMVs के बीच सहयोग और माउस और मानव zygotes की क्षमता को पूरा करने के लिए पूर्ण और पूर्ण अवधि के विकास10,11प्रदर्शन किया ।
इन अध्ययनों के पहले के आधार पर, हम यहां का वर्णन विकास के लिए सक्षम या अक्षम माउस की मांयता के लिए एक मंच पूरी तरह से विकसित अंडाणुओं5,6,7,8। मंच तीन मुख्य चरणों पर आधारित है: 1) कोटरीय रोम से पृथक अंडाणुओं पहले अपने क्रोमेटिन विंयास के आधार पर या तो एक घेर nucleolus (SN) या एक नहीं घिरा nucleolus (NSN) के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं; 2) CMVs के समय-चूक छवियों जीवी-करने के लिए प्रत्येक एकल oocyte के मिि संक्रमण लिया और कण छवि velocimetry (PIV) के साथ विश्लेषण कर रहे हैं; और 3) PIV के साथ प्राप्त डेटा एक फ़ीड के साथ विश्लेषण कर रहे है आगे कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क (फैंन) ब्लाइंड वर्गीकरण के लिए12,13। हम माउस के लिए तैयार की प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण कदम का ब्यौरा देने के लिए यह परीक्षण करने के लिए उपलब्ध है और अंय स्तनधारी प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया (जैसे, गोजातीय, बंदर और मनुष्य) ।
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Protocol
सभी पशुओं को शामिल प्रक्रियाओं पविया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग और नैतिक समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया । जानवरों की शर्तों के तहत बनाए रखा गया था 22 ° c, ६०% हवा आर्द्रता और एक प्रकाश/
1. अंडाशय अलगाव
- intraperitoneally २ ४-to-ग्यारह सप्ताह पुराने CD1 मादा चूहों के साथ 10 कूप के साथ एक बाँझ 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज हार्मोन उत्तेजक सुई.
- प्रतीक्षा 46-48 ज.
- Zoletil (Tiletamina और Zolazepan cloridrate) के ५० मिलीग्राम/kg के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ माउस और anesthetize तौलना । ग्रीवा विस्थापन द्वारा Euthanize ।
- पेट की दीवार विच्छेदन संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर कवर त्वचा को पकड़ । कैंची की एक जोड़ी के साथ त्वचा और शरीर की दीवार में कटौती और संदंश के साथ चीरा खुला खींचो ।
- चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करना, एक तरफ हिम्मत कदम, गर्भाशय सींग तुच्छ और उनके चरम पर अंडाशय स्थानीयकृत ।
- धीरे घड़ीसाज़ संदंश का उपयोग कर अंडाशय पकड़ और कैंची का उपयोग करने के लिए गर्भाशय के बंधन में कटौती । अंय अंडाशय के साथ दोहराएं ।
- एक ३५-mm सेल कल्चर पेट्री डिश में एकत्र अंडाशय स्थानांतरण 1 मिलीलीटर के अलगाव मध्यम पूर्व के ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह हवा में2 मिलीग्राम से युक्त ।
- वसा और एक stereomicroscope के तहत ठीक कैंची का उपयोग कर ओवीडक्ट निकालें ।
2. मेघपुंज Oocyte परिसरों का अलगाव
- कोटरीय मेघपुंज oocyte परिसरों (COCs) निष्क्रिय जारी कर रहे हैं जब तक कि बाँझ चिमटी और एक 1G बाँझ इंसुलिन सुई का उपयोग कर डिम्बग्रंथि सतह पंचर.
- मेघपुंज कोशिकाओं के तीन से अधिक परतों के साथ COCs लीजिए एक मुंह नियंत्रित हाथ से खींचा पाश्चर micropipette (व्यास में २०० µm) का उपयोग कर और उंहें ताजा M2 मध्यम के एक ३०० µ एल ड्रॉप में स्थानांतरण ।
- एक हाथ का उपयोग कर अंडाणुओं आसपास के मेघपुंज कोशिकाओं को दूर-खींच पाश्चर micropipette (व्यास में ८० µm) धीरे से pipetting और कुछ सेकंड के लिए,
- जब तक मेघपुंज कोशिकाओं को पूरी तरह से समाप्त कर रहे हैं, M2 मध्यम के एक 20 µ एल ड्रॉप से अंडाणुओं एक और एक करने के लिए स्थानांतरण बार ।
3. क्रोमेटिन संगठन-आधारित Oocyte वर्गीकरण
- ३३३४२ M2 मध्यम में ०.०५ µ g/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में धुंधला समाधान Hoechst तैयार 5 मिलीग्राम/एमएल 1x पंजाब में पतला के एक मां समाधान से शुरू ।
- प्लेस ३.५ µ एल एक ३५ mm पेट्री डिश ढक्कन के तल पर Hoechst धुंधला समाधान के माइक्रो बूंदें ।
- एक Hoechst धुंधला छोड़ने में प्रत्येक एकल oocyte स्थानांतरण, एक पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) हीटिंग प्लेट पर पकवान जगह और प्रकाश प्रदर्शनी से बचने के लिए एक काले ढक्कन के साथ कवर किया ।
- कमरे के तापमान पर मशीन के 10 मिनट के बाद, कोई 1-2 से अधिक के लिए यूवी प्रकाश (330-385 एनएम) के तहत 10x आवर्धन पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ अंडाणुओं का पालन, ।
- अंडाणुओं को एक घेरी nucleolus (SN) (चित्र 1a) के रूप में वर्गीकृत करें, यदि वे nucleolus आसपास के Hoechst-धनात्मक क्रोमेटिन की एक रिंग प्रस्तुत करते हैं ।
- वर्गीकृत अंडाणुओं के रूप में एक नहीं घिरा nucleolus (NSN), अगर उनके nucleolus Hoechst-सकारात्मक क्रोमेटिन से घिरा हुआ नहीं है और नाभिक के भीतर heterochromatic धब्बे फैलाने से पता चलता है (चित्र 1b) ।
4. तंत्रिका नेटवर्क आधारित Oocyte वर्गीकरण
- α-मेम मध्यम के चार 2 µ एल बूंदें तैयार 5% गर्मी के साथ पूरक-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल-glutamine, 5 मिमी taurine, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, ७५ µ जी/एमएल streptomycin और २३.५ µ g/µ एल सोडियम पाइरूवेट में ३५ मिमी ग्लास नीचे पेट्री डिश और उन्हें कवर के साथ पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) और पूर्व equilibrated खनिज तेल मध्यम वाष्पीकरण से बचने के लिए ।
नोट: लाइव सेल-स्क्रीनिंग सिस्टम का उपयोग करते हैं, तो एक दिशानिर्देश के रूप में 7 मिमी x 7 मिमी का एक आरेखित ग्रिड का उपयोग करके एक विशिष्ट दूरी पर बूँदें रखें । - प्रत्येक ड्रॉप करने के लिए 3-4 अंडाणुओं स्थानांतरण ।
- एक जीवित कोशिका स्क्रीनिंग प्रणाली में ग्लास नीचे पेट्री पकवान प्लेस, समय चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित ( सामग्री की तालिकादेखें), जो स्थिर तापमान (३७ डिग्री सेल्सियस) और सह के साथ एक वातावरण में oocyte परिपक्वता के अवलोकन की अनुमति देता है2 एकाग्रता (5%) ।
- समय चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलें । स्क्रीन पर एक खिड़की के बाईं ओर oocyte के एक जीवित शॉट के साथ प्रकट होता है और दाहिने हाथ की ओर सभी सेटिंग बटन ।
- स्क्रीन केंद्र पर स्थिति के लिए oocyte के केंद्र का चयन करें । यदि आवश्यक हो तो फ़ोकस समायोजित करें ।
- पीएच बटन का चयन करें और १९२ के लिए व्यास दीपक सेट; 1/125 sकरने के लिए एक्सपोज़र समय ; १.९९को लाभ ; और संकल्प को १६०० x १२००।
- FL2 का चयन करें और 5करने के लिए व्यास दीपक सेट; 3 एसकरने के लिए जोखिम समय ; २.३७को लाभ ; और संकल्प को १६०० x १२००।
- संस्कृति ड्रॉप के भीतर oocyte स्थिति रिकॉर्ड करने के लिए नया बिंदु बटन का चयन करें । संस्कृति छोड़ के भीतर प्रत्येक oocyte के लिए एक ही दिनचर्या दोहराएं ।
- समय का चयन करें और 8 मिनट और कुल समय के लिए 15 एचकरने के लिए अधिग्रहण चक्र सेट ।
- रिकॉर्डिंग चक्र प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ समय-चूक का चयन करें ।
- MATLAB सॉफ्टवेयर खोलें और लिखें > >cell_piv; और फिर PIV उपकरणका चयन करें ।
- रिकॉर्ड की गई चलचित्र वाला फ़ोल्डर चुनें और संपूर्ण छवि अनुक्रम लोड करने के लिए. jpeg फ़ाइलों में से किसी का चयन करें । प्रत्येक oocyte के लिए, क्षेत्र चुनें टूलक्लिक करके ब्याज के क्षेत्र (ROI) का चयन करें ।
- फ़ाइल मेनू में प्रक्रिया PIV का चयन करें । व्यूअर उपकरण बटन का चयन करें ।
नोट: कार्यक्रम रॉय के भीतर वेग वैक्टर गणना और स्वचालित रूप से एक डेटा फ़ाइल का उत्पादन, एक. mat फ़ाइल के रूप में सहेजा जाएगा । - खोलने के लिए. mat फ़ाइल का चयन करें । ROI टूल का चयन करें बटन का चयन करें और oocyte की बाह्यरेखा के आस-पास एक वृत्त बनाएं । फ़ाइल मेनू के अंतर्गत सहेजें क्लिक करें ।
नोट: इस क्षेत्र में वैक्टर अब प्रदर्शित कर रहे है और इस नए रॉय के लिए अद्यतन ग्राफ विंडो में मतलब परिमाण डेटा । - एक स्प्रेडशीट में दर्ज पूरे समय चूक फ्रेम का एकत्र मतलब परिमाण डेटा खोलें, के साथ, पंक्तियों पर, फ्रेम अनुक्रम और, कॉलम पर, प्रत्येक एकल oocyte विश्लेषण किया ।
- NSN और SN अंडाणुओं दोनों के डेटा को 10 उपसमूहों में व्यवस्थित करें ।
- उपयोग 9 उपसमूहों को प्रशिक्षित करने के लिए फ़ीड-आगे कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क iteratively (फैंन) और 1 उपसमूह ब्लाइंड परीक्षण के लिए ।
- एक और 9 बार दोहराएं, ब्लाइंड परीक्षण नमूना बदलने (10 गुना पार मांयता) ।
- MATLAB खोलें, कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट चलाएं मुख्य और, अनुरोध पर, प्रशिक्षण डेटा (train. txt) के साथ फ़ाइल का नाम संमिलित करें, NSN और SN अंडाणुओं की संख्या और प्रशिक्षण के लिए उपयोग किया गया समय-चूक अंतराल का विश्लेषण किया जा करने के लिए (सामांयतया, से फ़्रेम # 1-2 # 112-113 फ्रेम करने के लिए) ।
- प्रशिक्षण निष्पादित करने के लिए enter दबाएं ।
- परीक्षण डेटा (test. txt) के साथ फ़ाइल का नाम संमिलित करें ।
- MATLAB कार्यक्षेत्र में वेक्टर test_outputs_cyt खोलें ।
नोट: एक विंडो प्रदर्शित स्क्रीन पर दिखाई देता है, पहली पंक्ति में, NSN और SN अंडाणुओं के लिए ट्रू धनात्मक (TP या true NSN) और false धनात्मकता (FP या false NSN) को क्रमशः प्राप्त करने की संभाव्यता; इसके बजाय, दूसरी पंक्ति में, NSN और SN अंडाणुओं के लिए false नकारात्मक (एफ एन या गलत sn) और ट्रू निगेटिव (तमिलनाडु या ट्रू sn) प्राप्त करने की संभाव्यता क्रमशः । - प्रतिशत के रूप में व्यक्त फैंन सटीकता की गणना करने के लिए सूत्र: (tp + तमिलनाडु)/(tp + FP + एफ एन + तमिलनाडु), का उपयोग करें ।
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Representative Results
चित्रा 2 एक प्रतिनिधि के विकास से पता चलता है और सक्षम अक्षम oocyte, क्रमशः शुरुआत में (जी. वी.) और IVM प्रक्रिया के अंत (मिि) पर । पूरी तरह से बढ़ी माउस अंडाणुओं के IVM 15 ज संस्कृति के दौरान होता है । समय चूक अवलोकन अर्धसूत्रीविभाजन की प्रगति को रिकॉर्ड और GVBD और पहले ध्रुवीय शरीर के बाहर निकालना सहित प्रमुख meiotic घटनाओं का पता लगाता है ।
विश्लेषण और अधिक से अधिक की तुलना २०० विकास सक्षम बनाम अक्षम अंडाणुओं अर्धसूत्रीविभाजन की प्रगति में समय मतभेद दिखाया । विशेष रूप से, NSN अंडाणुओं में, GVBD 1-2 समय-चूक फ्रेम की काफी देरी है, जबकि PB1 बाहर निकालना एक 15 फ्रेम देरी के साथ होता है । इन मतभेदों के बावजूद, परिवर्तनशीलता एकल-oocyte वर्गीकरण की अनुमति देने के लिए बहुत अधिक है । इस कारण के लिए, प्रक्रिया एक गणितीय वर्गीकरण उपकरण के साथ लागू किया गया था ।
चित्रा 3 गणितीय वर्गीकरण उपकरण का इस्तेमाल किया, नाम फ़ीड आगे कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क (फैंन) की एक योजना से पता चलता है । के माध्यम से खिलाया प्रत्येक oocyte के लिए, फैंन एक साथ संभावना है कि gamete एक विकास सक्षम और संभावना है कि यह एक अक्षम oocyte है देता है । हमारे प्रयोगों में, फैंन ९१.०३% का एक मतलब सटीकता के साथ वर्गीकृत माउस अंडाणुओं ।
चित्र 1 . प्रतिनिधि SN और NSN अंडाणुओं Hoechst ३३३४२ के साथ दाग । अलगाव और fluorochrome Hoechst ३३३४२ के साथ धुंधला के बाद, पूरी तरह से विकसित अंडाणुओं या तो घिरा के रूप में वर्गीकृत nucleolus (SN) (एक) या नहीं घिरा nucleolus (NSN) (ख), उपस्थिति (तीर) या अनुपस्थिति पर निर्भर करता है, क्रमशः, की एक अंगूठी की Hoechst-positive heterochromatin आसपास nucleolus. स्केल बार: 5 µm कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . समय-चूक छवियों के कण छवि Velocimetry विश्लेषण । PIV विश्लेषण के परिणाम ११३ समय चूक फ्रेम का विश्लेषण के प्रत्येक के लिए उज्ज्वल क्षेत्र छवि नीचे दिखाए जाते हैं । यह आंकड़ा शुरुआत (जी. वी.) और रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के अंत (मिि) से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . फ़ीड के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व आगे कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क । फैंन के लिए विकास के रूप में सक्षम या अक्षम अंडाणुओं वर्गीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया गणितीय उपकरण है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
वहां कई महत्वपूर्ण कदम एक का ध्यान रखना चाहिए, जबकि माउस अंडाणुओं के साथ इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंय प्रजातियों के लोगों के साथ कर रहे हैं । एक बार उनके रोम से अलग, अंडाणुओं तुरंत रिकॉर्डिंग बूंदों में स्थानांतरित किया जाना चाहिए, साथी मेघपुंज कोशिकाओं से जुदाई के रूप में जीवी-को-मिि संक्रमण की शुरुआत चलाता है । वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए एक संभव संशोधन COCs अलगाव के लिए इस्तेमाल किया M2 माध्यम के लिए 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) के अलावा हो सकता है । IBMX जीवी-to-मिि संक्रमण के तत्काल ट्रिगर रोकता है और अंडाणुओं के पूरे प्रयोगात्मक समूह के तुल्यकालन की अनुमति देता है ।
हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया लाइव सेल स्क्रीनिंग प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) 4 अंडाणुओं के साथ परिपक्वता बूंदों की संख्या को सीमित करता है, इस प्रकार प्रति प्रयोग 16 अंडाणुओं की कुल करने के लिए. इस सीमा के अंय समय चूक लाइव सेल स्क्रीनिंग सिस्टम, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और कई संस्कृति मंडलों से सुसज्जित का उपयोग कर दूर किया जा सकता है ।
हमारे अनुभव के आधार पर, एक फ्रेम और निंनलिखित के बीच रिकॉर्डिंग अंतराल एक महत्वपूर्ण मुद्दा है । प्रारंभिक प्रयोगों की एक संख्या के बाद, हम हर 8 मिनट छवियों लिया है, क्योंकि यह ंयूनतम समय खिड़की है कि प्रमुख जीवी के दौरान होने वाली घटनाओं की स्पष्ट अवलोकन की अनुमति थी-को मिि संक्रमण, जैसे कीटाणु vescicle टूटने और बाहर निकालना पहले ध्रुवीय शरीर की । इस समय खिड़की revaluated जब अंय प्रजातियों के अंडाणुओं देख सकता है की जरूरत हो सकती है ।
इस विधि की एक खामी उनके आस-पास के मेघपुंज कोशिकाओं के अभाव में अंडाणुओं की संस्कृति है, जैसा कि बाद में आगे जीवी-to-मिि संक्रमण में सुधार करने के लिए जाना जाता है । इस संबंध में, हमारी प्रयोगशाला अब मेघपुंज की संस्कृति सहित एक मेघपुंज कोशिकाओं फीडर परत पर मुक्त अंडाणुओं द्वारा रिपोर्ट प्रोटोकॉल के लिए एक मामूली संशोधन का परीक्षण कर रहा है ।
अपने स्वभाव से, फैंन दोनों इनपुट की एक निश्चित संख्या है (विश्लेषित सीएमवी मॉड्यूल की संख्या) और उत्पादन (या तो एक विकासात्मक सक्षम या अक्षम oocyte) ंयूरॉंस, लेकिन छिपा ंयूरॉंस की संख्या में एक परीक्षण और सुधार के माध्यम से अंवेषक द्वारा चुना है सबसे अच्छा पूर्वानुमान प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए दृष्टिकोण । हमारे मामले में, हम छिपा ंयूरॉंस की विभिंन संख्याओं के साथ प्रयोग किया और पाया कि तीन सबसे अच्छा परिणाम दिया । इसके अलावा, फैंन विश्लेषण एक मजबूत आँकड़े प्राप्त करने के लिए (हमारे प्रयोगों ११२ सीएमवी मॉड्यूल में) इनपुट डेटा की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है. एक संभव सुधार है कि आवश्यक इनपुट डेटा की संख्या कम कर सकता है वैकल्पिक वर्गीकरण उपकरण का उपयोग करें, जैसे कि समर्थन वेक्टर मशीन, पेड़-बैग, या KNN classifiers । जब फैंन विश्लेषण अपनी मजबूती को दर्शाता है, तो चरण 1 को प्रक्रिया से समाप्त किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल, माउस के लिए स्थापित, मानव सहित अंय प्रजातियों के अंडाणुओं पर परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, PIV और तंत्रिका नेटवर्क विश्लेषण के साथ समय चूक रिकॉर्डिंग का संयोजन zygotes में CMVs के अवलोकन के लिए शोषण किया जा सकता है10,11 और प्रत्यारोपण भ्रूण में उनके आगे के मूल्यांकन के लिए विकासात्मक क्षमता ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम संभव धन्यवाद द्वारा समर्थन करने के लिए बनाया गया था: पविया FRG २०१६ के विश्वविद्यालय; परमा FIL २०१४, २०१६ के विश्वविद्यालय; और इस अध्ययन को पूरा करने के लिए आवश्यक plasticware की आपूर्ति के लिए Kinesis । हम Dr. शेन विंडसर (इंजीनियरिंग के संकाय, ब्रिस्टल विश्वविद्यालय, यूके) Cell_PIV सॉफ्टवेयर प्रदान करने के लिए धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
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