Summary
Nous présentons ici un protocole pour une évaluation non invasive de la compétence du développement ovocytes effectué au cours de leur maturation in vitro de la vésicule germinative au stade métaphase II. Cette méthode combine l’imagerie Time-lapse avec vélocimétrie par image de particules (PIV) et les analyses de réseau neuronal.
Abstract
Cliniques d’infertilité bénéficierait de la possibilité de sélectionner développemental compétente vs les ovocytes incompétent à l’aide de méthodes non effractives, afin d’améliorer le résultat global de la grossesse. Nous avons récemment mis au point une méthode de classification basée sur des observations microscopiques vivantes des ovocytes de souris au cours de leur maturation in vitro de la vésicule germinale (GV) au stade métaphase II, suivie de l’analyse des mouvements cytoplasmiques survenant au cours de cette période Time-lapse. Nous présentons ici des protocoles détaillés de cette procédure. Les ovocytes sont isolés des follicules antraux entièrement cultivés et cultivés pendant 15 h à l’intérieur d’un microscope équipé pour l’analyse de Time-lapse à 37 ° C et 5 % de CO2. Les photos sont prises à intervalles de 8 min. Les images sont analysées à l’aide de la méthode Particle Image Velocimetry (PIV) qui calcule, pour chaque ovocyte, le profil des vitesses de mouvement cytoplasmique (CMV) qui se produisent tout au long de la période de culture. Enfin, la CMV de chaque ovocyte unique est alimentés par un outil de classification mathématique (réseaux de neurones artificiels Feed-forward, FANN), qui prédit la probabilité d’un gamète développemental compétent ou incompétent avec une précision de 91.03 %. Ce protocole, mis en place pour la souris, pourrait maintenant être testé sur d’autres espèces, y compris les humains, les ovocytes.
Introduction
Infertilité féminine est une pathologie qui affecte un nombre croissant de femmes. Selon l’Organisation mondiale de la santé, environ 20 % des couples sont infertiles, avec 40 % à cause de l’infertilité féminine. En outre, un tiers des femmes subissant des traitements contre le cancer (300 000/an et 30 000/an dans les USA ou l’Italie, respectivement) développent une insuffisance ovarienne prématurée.
Une stratégie visant à prévenir l’infertilité chez les patients atteints de cancer est l’isolement et la cryoconservation des follicules ovariens avant le traitement oncologique, suivie de la maturation in vitro (MIV) d’ovocytes GV à l’étape MII (transition GV-à-MII). La disponibilité de marqueurs non-invasifs de compétence développementale d’ovocytes améliorerait la fécondation et processus de développement et le succès de grossesse globale1,2.
Selon leur configuration de chromatine observée après coloration au supravitale fluorochrome Hoechst 33342, mammifères adulte ovocytes sont classés soit comme un nucléole entouré (SN) ou un nucléole pas entouré (RSN)3. En plus de leur organisation de la chromatine différents, ces deux types d’ovocytes affichent plusieurs différences morphologiques et fonctionnelles3,4,5,6,7,8 ,9, y compris leur compétence méiotique et du développement. Lorsque isolée de l’ovaire et portées à maturation in vitro, les deux type d’ovocytes portée la scène MII et après insémination de sperme, se développent à l’étape 2-cell, mais seulement ceux avec une organisation de la chromatine SN peuvent se développer à terme9. Mais bon comme une méthode de classification pour sélectionner compétente vs incompétent ovocytes, le principal inconvénient est l’effet mutagène qui le fluorochrome lui-même et, surtout, la lumière UV utilisé pour sa détection pourraient avoir sur les cellules.
Pour toutes ces raisons, nous avons cherché des autres marqueurs non-invasifs associées à la conformation de la chromatine SN ou DSN qui pourrait remplacer l’utilisation de Hoechst, tout en conservant la même précision de classement élevé. La Time-lapse observation des vitesses de mouvement cytoplasmique (CMV) s’impose comme une caractéristique distinctive de l’état de la cellule. Par exemple, des études récentes ont démontré que l’association entre le CMV enregistré au moment de la fécondation et la capacité des souris et des zygotes humains complet préimplantatoire et nés à terme développement10,11.
Se fondant sur ces études antérieures, nous décrivons ici une plateforme pour la reconnaissance des souris développemental compétent ou incompétent ovocytes adulte5,6,7,8. La plate-forme est basée sur trois étapes principales : 1) ovocytes isolés des follicules antraux sont classés d’abord selon leur configuration de chromatine soit comme un nucléole entouré (SN) ou un nucléole n’est pas entouré (NSN) ; 2) images Time-lapse de CMV survenant lors du passage de GV-à-MII de chaque ovocyte unique sont prélevés et analysés par vélocimétrie par image de particules (PIV) ; et 3) les données obtenues avec PIV sont analysées avec un réseau neuronal artificiel de Feed-forward (FANN) pour aveugles classification12,13. Nous donnons les détails des étapes plus critiques de la procédure destinée à la souris pour le rendre prêt à être testé et utilisé pour les autres espèces de mammifères (p. ex., les bovins, singe et l’homme).
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par les institutionnels et utilisation et animalier des comités d’éthique à l’Université de Pavie. Animaux était maintenus dans des conditions de 22 ° C, humidité de l’air de 60 % et un cycle lumière/obscurité de 12:12 h.
1. isolement de l’ovaire
- Injecter par voie intrapéritonéale 2 quatre-à-onze semaines femelles souris CD1 avec 10 U d’hormone folliculo-stimulante avec une seringue à insuline stériles 1 mL.
- Attendre 46-48 h.
- Peser la souris et anesthésier avec une injection intramusculaire de 50 mg/kg de Zoletil (cloridrate Tiletamina et Zolazepan). Euthanasier par dislocation cervicale.
- Saisir la peau recouvrant la paroi abdominale à l’aide d’une paire de pinces de dissection. Couper la peau et la paroi du corps avec une paire de ciseaux et ouvrir l’incision avec une pince.
- À l’aide d’une paire de pincettes, déplacer le cran côté, repérer les cornes utérines et localiser les ovaires à leur extrémité.
- Doucement, maintenez l’ovaire à l’aide de pinces d’horloger et utiliser des ciseaux pour couper le ligament de l’utérus. Répéter l’opération avec l’autre ovaire.
- Transférer les ovaires prélevés dans un plat de Pétri de culture 35 mm cellule contenant 1 mL de milieu d’isolement M2 préchauffée à 37 ° C, 5 % de CO2 dans l’air.
- Retirez la graisse et l’oviducte à l’aide des ciseaux sous un stéréomicroscope.
2. isolement des Complexes ovocytes Cumulus
- Percer la surface ovarienne à l’aide de pinces stériles et une aiguille stérile de l’insuline de 1G jusqu'à ce que les complexes d’ovocyte antrale cumulus (COC) sont libérées passivement.
- Recueillir des COC avec plus de trois couches de cellules de cumulus à l’aide d’une bouche-contrôlés main tiré Pasteur micropipette (200 µm de diamètre) et de les transférer dans une chute de 300 µL de milieu M2 frais.
- Supprimer les cellules du cumulus qui entourent les ovocytes à l’aide d’une micropipette main tiré de Pasteur (80 µm de diamètre) en pipettant également doucement dedans et dehors pendant quelques secondes,
- Transfert à plusieurs reprises ovocytes d’une goutte de 20 µL de milieu M2 à une autre, jusqu'à ce que les cellules du cumulus sont complètement éliminés.
3. Classification ovocyte axée sur l’organisation de la chromatine
- Préparer la solution colorante Hoechst 33342 à une concentration finale de 0,05 µg/mL en M2 moyen à partir d’une solution mère de 5 mg/mL dilué dans du PBS 1 x.
- 3.5 place µL micro gouttelettes de Hoechst coloration solution au fond d’un couvercle de boîte de Pétri de 35 mm.
- Transférer chaque ovocyte unique dans un Hoechst coloration goutte, posez le plat sur une plaque de chauffage préchauffé (37 ° C) et couvrir avec un couvercle noir pour éviter l’exposition lumineuse.
- Après 10 min d’incubation à température ambiante, observer les ovocytes avec un microscope à fluorescence à un grossissement de X 10 sous lumière UV (330-385 nm), pour pas plus de 1-2 s.
- Classer des ovocytes comme un nucléole entouré (SN) (Figure 1 a), si elles présentent un anneau de chromatine Hoechst positifs entourant le nucléole.
- Classer des ovocytes comme un nucléole pas entouré (RSN), si leur nucléole n’est pas entouré de chromatine Hoechst séropositifs et spectacles dispersent hétérochromatiques taches dans le noyau (Figure 1 b).
4. neural Network-Based ovocyte Classification
- Préparer quatre 2 gouttes µL de milieu de α-MEM additionné de 5 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, taurine de 5 mM, 100 U/mL la pénicilline, 75 µg/mL de streptomycine et pyruvate 23,5 µg/µL sodium dans un verre de 35 mm le fond de boîte de Pétri et recouvrez-les avec préchauffé (37 ° C) et l’huile minérale préalablement équilibré pour éviter l’évaporation moyenne.
Remarque : Si vous utilisez un système de dépistage cell live, maintenez les gouttes à une distance spécifique en utilisant une grille dessinée de 7 x 7 mm comme ligne directrice. - Transfert de 3 - 4 ovocytes à chaque goutte.
- Placez le fond de verre plat de Pétri dans un système de dépistage cell live, équipé d’un logiciel d’enregistrement Time-lapse (voir Table des matières), qui permet l’observation de la maturation des ovocytes dans un environnement à température stable (37 ° C) et CO2 concentration (5 %).
- Ouvrez le logiciel d’enregistrement Time-lapse. Sur l’écran, une fenêtre apparaît avec un tir direct de l’ovocyte sur le côté gauche et tous les boutons de réglage sur le côté droit.
- Sélectionnez le centre de l’ovocyte à positionner au centre de l’écran. Ajuster la mise au point si nécessaire.
- Cliquez sur le bouton de Ph , puis affectez-lui la Lampe DIA 192 ; le temps d’exposition de 1/125 s; le Gain à 1.99; et la résolution de 1600 x 1200.
- Sélectionnez FL2 , puis affectez-lui la Lampe DIA 5; le temps d’exposition de 3 s; le Gain à 2,37; et la résolution de 1600 x 1200.
- Cliquez sur le bouton New point afin d’enregistrer la position de l’ovocyte dans la baisse de la culture. Répéter la même routine pour chaque ovocyte dans la baisse de la culture.
- Sélectionnez heure , puis affectez-lui le cycle d’Acquisition 8 min et le temps Total de 15 h.
- Sélectionnez Start time-lapse pour démarrer le cycle d’enregistrement.
- Ouvrez le logiciel MATLAB et écrire >>cell_piv; puis sélectionnez l' Outil PIV.
- Choisissez le dossier contenant le film enregistré, puis sélectionnez tous les fichiers .jpeg pour charger la séquence de l’ensemble de l’image. Pour chaque ovocyte, sélectionnez la région d’intérêt (ROI) en cliquant sur le Sélectionnez zone outil.
- Dans le menu fichier, sélectionnez Processus PIV . Cliquez sur le bouton de l’Outil de visualisation .
NOTE : Le programme calcule les vecteurs de vitesse dans le retour sur investissement et produit automatiquement un fichier de données, enregistré dans un fichier .mat. - Sélectionnez le fichier .mat à ouvrir. Cliquez sur le bouton outil ROI sélectionner et dessiner un cercle autour du contour de l’ovocyte. Cliquez sur Enregistrer sous du menu fichier.
Remarque : Les vecteurs de cette région sont maintenant affichés et les données de magnitude moyenne dans la fenêtre graphique mis à jour pour ce nouveau ROI. - Ouvert les données recueillies de magnitude moyenne des trames entières Time-lapse enregistrement dans un tableur, avec, sur les lignes, la séquence d’image et, sur les colonnes, chaque ovocyte unique analysé.
- Organiser les données d’ovocytes fois NNO et SN en 10 sous-groupes.
- 9 sous-groupes permet de former le réseau de neurones artificiels feed-forward par itération (FANN) et 1 sous-groupe pour le blind test.
- Répéter un autre 9 fois, changeant l’échantillon test aveugle (10 fois la validation croisée).
- Ouvrir MATLAB, exécutez le script sur mesure principale et, sur demande, insérez le nom du fichier avec les données d’apprentissage (train.txt), le nombre d’ovocytes NNO et SN, utilisé pour la formation et l’intervalle de temps-faute pour être analysé (en général, de image # 1-2 pour encadrer # 112-113).
- Appuyez sur entrer pour effectuer la formation.
- Inscrire le nom du fichier avec les données de tests (test.txt).
- Ouvrez le vecteur test_outputs_cyt dans l’espace de travail MATLAB.
NOTE : Une fenêtre s’affiche sur l’écran indiquant, dans la première rangée, la probabilité d’obtenir de vrais positifs (TP ou vrai RSN) et des faux positifs (FP ou faux NSN) pour les ovocytes NNO et SN, respectivement ; au lieu de cela, dans la deuxième rangée, la probabilité d’obtenir de faux négatifs (FN ou faux SN) et effectivement négatifs (TN ou SN vrai) pour les ovocytes NNO et SN, respectivement. - Utiliser la formule suivante : (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), pour le calcul de l’exactitude FANN, exprimée en pourcentage.
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Representative Results
La figure 2 illustre un ovocyte représentatif de développemental compétent et incompétent, respectivement au début (GV) et à la fin (MII), de la procédure de l’IVM. IVM d’ovocytes de souris adulte se produit au cours de la culture de 15 h. L’observation de Time-lapse enregistre la progression de la méiose et détecte les événements méiotiques majeurs, y compris la GVBD et l’extrusion du premier corps polaire.
L’analyse et la comparaison de plus de deux cents développemental compétente vs incompétent ovocytes présentent des différences de temps dans la progression de la méiose. Plus précisément, dans des ovocytes de NSN, administrées sont considérablement retardée de 1-2 cadres Time-lapse, de tandis que l’extrusion de PB1 se produit avec un retard de 15 images. Malgré ces différences, la variabilité est trop élevée pour permettre un classement unique-ovocyte. Pour cette raison, la procédure a été mis en place un outil de classification mathématique.
La figure 3 montre un schéma de l’outil de classification mathématique utilisé, Feed-forward nommé réseau neuronal du artificiel (FANN). Pour chaque ovocyte repiqué, FANN donne simultanément la probabilité que le gamète est un développemental compétent et la probabilité qu’il soit un ovocyte incompétent. Dans nos expériences, la FANN a classé les ovocytes de souris avec une précision moyenne de 91.03 %.
Figure 1 . Ovocytes représentatifs de SN et NSN colorées avec Hoechst 33342. Après isolement et coloration au fluorochrome Hoechst 33342, entièrement cultivés ovocytes sont classés soit comme entouré de nucléole (SN) (A) ou pas entouré nucléole (NSN) (B), selon la présence (flèche) ou non, respectivement, d’un anneau de Hétérochromatine Hoechst positifs entourant le nucléole. Barre d’échelle : 5 µm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Analyse de vélocimétrie par Image de particules d’images Time-lapse. Les résultats de l’analyse PIV figurent ci-dessous l’image du champ lumineux pour chacun des cadres Time-lapse 113 analysés. La figure montre le début (GV) et fin (MII) le processus d’enregistrement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Représentation schématique du réseau neuronal artificiel Feed-forward. FANN est l’outil mathématique utilisé pour classer les ovocytes comme développemental compétent ou incompétent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il y a plusieurs étapes critiques, on s’occupe de tout en effectuant ce protocole avec les ovocytes de souris ainsi qu’avec celles d’autres espèces. Une fois isolés de leurs follicules, ovocytes doivent être immédiatement transférés dans les gouttes de l’enregistrement, comme la séparation d'avec le cumulus compagnon cellules déclenche le début de la transition de GV-à-MII. Une modification éventuelle du présent protocole pourrait être l’ajout de la 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) au milieu de M2 utilisé pour isoler les COC. IBMX empêche le déclenchement immédiat de la transition de GV-à-MII et permet une synchronisation du groupe ensemble expérimental d’ovocytes.
Le système live de cellule-dépistage utilisé dans nos expériences (voir Table des matières) limite le nombre de gouttes de maturation pour 4 avec 4 ovocytes par goutte d’eau, donc à un total de 16 ovocytes par expérience. Cette limitation pourrait être surmontée à l’aide d’autres systèmes cellulaires-projection live Time-lapse, commercialement disponibles et équipés de plusieurs chambres de culture.
Selon notre expérience, l’intervalle d’enregistrement entre un cadre et de ce qui suit est un point critique. Après quelques expériences préliminaires, nous avons pris des images toutes les 8 min parce qu’il s’agissait de la fenêtre de temps minimal qui ont permis l’observation claire des événements majeurs qui se produisent pendant la transition de GV-à-MII, telles que la ventilation vescicle germinal et l’extrusion du premier corps polaire. Cette fenêtre de temps devrez peut-être être réévaluée lors de l’observation d’autres espèces, les ovocytes.
L’inconvénient de cette méthode est la culture des ovocytes en l’absence de leurs cellules du cumulus environnantes, car ces derniers sont connus pour améliorer la transition de GV-à-MII. À cet égard, notre laboratoire teste maintenant une légère modification du protocole signalés en incluant la culture des ovocytes exempt de cumulus sur une couche de conducteur de cellules de cumulus.
Par sa nature, le FANN a un nombre fixe de fois d’entrée (le nombre de modules de CMV analysées) et les neurones de sortie (que ce soit un ovocyte développemental compétent ou incompétent), mais le nombre de neurones cachés est choisi par l’investigateur à travers un procès et de la correction démarche pour obtenir les meilleures performances de prévision. Dans notre cas, nous avons expérimenté avec différents nombres de neurones cachés et trouvé que trois ont donné les meilleurs résultats. Aussi, les analyses FANN nécessitent un grand nombre de données d’entrée (dans nos modules de CMV 112 expériences) pour obtenir une statistique robuste. Une amélioration possible qui pourrait réduire le nombre de données d’entrée nécessaires est l’utilisation d’outils de classement de rechange, tels que Machine de vecteur de soutien, arbre-sac ou classificateurs KNN. Lorsque l’analyse FANN démontre sa robustesse, étape 1 pourrait être éliminé de la procédure.
Ce protocole, mis en place pour la souris, pourrait être testé sur d’autres espèces, y compris les humains, les ovocytes. En outre, la combinaison de Time-lapse enregistrement avec PIV et le réseau neuronal analyses pourraient être exploitées pour l’observation de CMV chez zygotes10,11 en embryons préimplantatoires pour l’évaluation de leurs nouvelles potentiel de développement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été rendu possible grâce au soutien de : l’Université de Pavie RFA 2016 ; Université de Parme FIL 2014, 2016 ; et Kinesis pour alimenter les contenants de plastique nécessaire pour réaliser cette étude. Nous remercions le Dr Shane Windsor (Faculté de génie, Université de Bristol, Royaume-Uni) pour fournir le logiciel Cell_PIV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
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