Dissektion och Explant kultur av murina Allantois för In vitro- analys av allantoiska fastsättning

Summary

Vi beskriver ett in vitro- test till modell chorioallantoic fastsättning, det första steget i moderkakan bildas. Protokollet visar murina allantoides på immobiliserade α4β1-integrin dissektion och explant kultur. Allantois fastsättning utvärderas mikroskopiskt vid förutbestämda tidpunkter.

Abstract

Moderkakan är viktigt för tillväxten och utvecklingen av däggdjur embryon. Av denna anledning, kan många genetiska förändringar och sannolikt också miljömässiga förolämpningar som stör moderkakan utveckling eller funktion orsaka tidiga missfall i möss och människor. Dock saknas enkelt in vitro- analyser till skärmen för potentiella effekter på moderkakan bildandet. Här fokuserar vi på modellering det första och avgörande steget i moderkakan formation, som består av tillbehöret av allantois till chorion. Vi beskriver en metod för att snabbt bedöma fastsättning av allantoiska bladsticklingar på immobiliserade α4β1-integrin, som fungerar som ett chorio-mimetiska substrat. Detta in vitro -metod möjliggör en kvalitativ bedömning av den bifogade filen och sprida uppförandet av flera allantois bladsticklingar vid olika på varandra följande tidpunkter. Protokollet kan användas för att undersöka effekten av målinriktade mus mutationer, droger eller olika miljömässiga faktorer som har kopplats till graviditetskomplikationer eller missfall på allantois fastsättning ex vivo.

Introduction

Moderkakan är oumbärlig för embryonal tillväxt och utveckling i livmodern miljön. Det utgör gränssnittet för syre, metabolit och näringsämnen utbyte mellan fetal och maternell cirkulation, och också funktioner som en endokrin och immunologiska organ. Alla endogena eller exogena förolämpning som försämrar placenta utveckling kan leda till intrauterin tillväxthämning, fetal förlust eller komplikationer under graviditeten, både möss och människor¹. Medan antalet riktade mus mutationer som orsakar onormal placenta fysiologi fortsätter att öka², 219 genotyper som visas på webbplatsen mus genomet informatik (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), många av dessa fenotyper är inte förstått från en mekanistisk synvinkel. Förutom genetiska förändringar, småmolekylära läkemedel, monoklonala antikroppar, toxiner, kan patogener, överskott metaboliter eller olika miljöfaktorer påverka moderkakan utveckling och funktion^{3,4,5 , 6 , 7}. ännu, enkel in vitro- analyser att modell kritiska steg i moderkakan utveckling är knappa.

Murina placenta utveckling startas i tidiga midgestation, när allantois (developmental föregångare av navelsträngen) dyker upp från den bakre änden av embryot som en knopp som växer mot den chorion⁸. Chorioadhesive celler i det yttre lagret av den allantoiska knoppen medla den bifogade filen och fördelningen av allantois på ytan av chorion (chorioallantoic ”fusion”). Chorion viker därefter in villi som växer i kärlsystemet av allantois att bilda labyrinten, det inre placenta lagret där näringsämnen och syre utbyts mellan tätt bredvid moderns blod sinusoider och embryonala fartyg^{9 ,10}.

Fastsättning av allantois till chorion är det första och avgörande steget i labyrint bildandet, och brister i denna process är bland de vanligaste orsakerna till embryonal dödlighet i midgestation¹. Även om ett antal mus mutanter har beskrivits där chorioallantoic fastsättning misslyckas inträffar¹⁰och MGI databasen innehåller för närvarande 108 mus mutanter som kännetecknas av onormal chorioallantoic fusion (http:// www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), intercellulära samspelet mellan vaskulär celladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1, uttryckt på allantoiska mesoderm) och α4β1-integrin (uttryckt på chorionic mesothelium, vilket är härlett från embryoniskt mesoderm) verkar vara oumbärlig för chorioallantoic fastsättning och fusion^11,12,13. Immunhistokemisk färgning av hela-mount vildtyp embryon har visat att VCAM-1 uttrycks inom den distala tredjedelen av allantoiska stjälken ca embryonala dag (E) 7,5¹³ (1-4 somite Stadium), och att dess uttryck är fortsatt hög under chorioallantoic fastsättning och -fusion^11,12. Fel allantoiska fastsättning chorion upptäcks vanligen av histologiska analyser av livmodern knoppar. Dock allantois storlekar är fysiologiskt mycket varierande i mellan och även inom kullar av samma utvecklingsstadier¹⁴, och allantois kan endast koppla till chorion när det har nått en tillräcklig storlek för att fysisk kontakt. Återspeglar detta naturliga variationer, chorioallantoic tillbehöret äger rum någon gång mellan ~ E 8.0 och E 9.0 i livmodernoch en statistiskt tillförlitlig utvärdering av denna process med histologi är därför beroende av analysen av ett stort antal negativt att erhålla tillräckligt exemplar på lämpliga utvecklingsstadiet.

Här, beskriver vi en metod för att bedöma allantoiska fastsättning ex utero som är mindre beroende av allantois storlek. Vi påvisa dissektion av musembryon och deras allantoides från livmödrarna av dräktiga möss ~ 8 dagar post intravenösa (dpc; dpc 0,5 designerar detektion av en vaginal plugg), och den efterföljande kulturen av allantois explants på immobiliserade α4β1 integriner. Denna metod möjliggör en snabb, funktionell utvärdering av den bifogade filen och sprida uppförandet av flera allantois bladsticklingar parallellt och olika efterföljande tidpunkter. Protokollet kan användas till skärmen för effekterna av riktade mutationer, droger eller olika miljöfaktorer på allantois fastsättning ex vivo.

Protocol

Mus avel godkändes av den Regierung Unterfranken, och alla analyser utfördes i strikt överensstämmelse med alla tyska och Europeiska unionens lagar och förordningar om skötsel och användning av försöksdjur.

1. beläggning av mikrotiter plattor med α4β1-Integrin för Ex Utero Allantois Explant kultur

1. Bered det frystorkade murina α4β1-integrin på 200 µg/mL i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Späd till en slutlig koncentration på 10 µg/mL i förväg värmde (37 ° C) PBS. Överför med pipett 20 µL per brunn av utspädda α4β1-integrin lösningen till det nödvändiga antalet brunnar i en mikrotiterplattan (1 allantois per brunn).
   Obs: Undvik bildandet av luftbubblor när beläggning brunnarna på mikrotiterplattan.
2. Inkubera i mikrotiter plattor under 60 minuter vid 37 ° C genom att placera dem i en fuktad vävnadsodling inkubator.
3. Noggrant Aspirera supernatanten med en pipett. Använd skonsam sugkraft och luta plattan att undvika att vidröra väl botten med pipettspetsen. Tvätta brunnarna två gånger genom att lägga till 50 µL av pre värmde (37 ° C) odlingssubstrat såsom Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) och ta bort tvätt medlet genom skonsam sugkraft.
4. Kritiska steg: Block gratis bindande platser genom att lägga till 50 µL per brunn av 0,1% (w/v) bovint serum albumin (BSA) / DMEM och inkubera i ≥ 30 minuter vid 37 ° C genom att placera de mikrotiter plattorna i en fuktad vävnadsodling inkubator.
   Obs: Allantois bladsticklingar kan koppla till olika ytor i närvaro av serum. Det är därför absolut nödvändigt att blockera icke-specifik bindning platser, efter beläggning explant brunnarna med integrin, och innan du lägger den dissekerade allantois för kultur i serum-innehållande medium (se punkt 4.4).
5. Hålla de belagda brunnarna i blockerande lösningen vid 37 ° C tills det behövs i steg 4,4.

2. livmodern dissektion från en gravid mus på Dpc 8

Obs: Minska falskt positiva graviditet priser genom vikt vinst diskriminering¹⁵.

1. Offra musen av cervikal dislokation. Desinficera pälsen i buken genom besprutning med 70% (v/v) etanol.
   Obs: Använd handskar vid hantering av möss. Eutanasi av cervikal dislokation utan bedövningsmedel förhindrar kemisk kontaminering av den allantois, som kan störa allantois fastsättning.
2. Öppna magen huden genom att göra ett litet snitt vid mittlinjen med sax. Använd behandskade fingrar för att hålla huden ovanför och nedanför snittet och dra huden isär mot bröstet och svans av musen.
3. Greppa bukhinnan med pincett. Med den andra handen, göra ett V-shaped snitt från främre mot bakre med sax och flytta vävnaden bort att exponera bukhålan. Använd tången för att driva tarmarna till ena sidan för att få tillgång till livmodern.
4. Leta upp de två livmoderns hornsna. Håller livmoderhalsen (det kaudala segmentet) med pincett och skär ligament med fina sax. Sedan lossa båda livmoderns horn av bryta oviducts med sax.
5. Använd tången att överföra livmodern i en steril 10 cm maträtt som innehåller steril, rumstemperatur (RT) PBS. Ta bort den fettvävnad, fartyg och nerver kring livmoderns horn med fin pincett och sax (figur 1A).

3. embryot dissektion

Obs: Utför följande steg under ett stereomikroskop utrustad med en 8:1 zoomomfång.

1. Separata embryon genom att skära mellan implantationsställen med sax. Ta tag muskulös livmoderslemhinnan av livmodern knopparna med pincett och dra isär för att exponera decidua (figur 1B).
2. Med pincett, över livmodern knopparna till en ny 10 cm maträtt som innehåller steril, RT PBS.
3. Fixa decidua runt embryot med tips av tången.
4. Gör ett snitt på anti-mesometrial sida av decidua med fin pincett (figur 1 c) och skala decidua bort med pincett att exponera embryot (figur 1 d).
   Obs: Mesometrial Polen för decidua är högt vaskulariserad och kan vara bredare vid basen än den anti-mesometrial delen, som innehåller embryot och ser blekare.
5. Dissekera embryot med pincett (figur 1E, F).
6. Med en mikro-sked, över embryot till en droppe steril fosfatbuffrad Koksaltlösning som ingår i en steril 3,5 cm maträtt.
7. Överför embryot till en färsk droppe PBS i samma 3,5 cm skålen med en mikro-sked, och dissekera embryot från gulesäcken använder tången (figur 1 g, H).
8. Alternativt om det behövs (t.ex., för genotypning av polymeraskedjereaktion), överför gulesäcken till ett sterilt rör genom att aspirera med ~ 5 µL PBS i en stor öppning 200 µL pipettspetsen. Förvaras vid-20 ° C.
   Obs: Moderns vävnad (dvs, parietala gulesäcken inklusive Reicherts membran och ectoplacental konen) som kan förorena gulesäcken preparatet kan leda till felaktig genotypningsresultat. Borttagning av dessa vävnader är lättaste innan embryot dissektion från gulesäcken.

4. allantois dissektion och Ex Utero kultur på immobiliserade α4β1-Integrin

1. Skär allantois från dess basala insticksstället bakre slutet av embryot med fin pincett (figur 1 H).
2. Alternativt om utvecklingstoxicitet iscensättning krävs, räknas somite parar av embryot genom okulärbesiktning med Mikroskop utrustat med fas kontrast optik och en 5 × och 10 × mål.
   Obs: Embryot kan förlängas med peang att underlätta somite räknar. Chorioallantoic fastsättning och fusion inträffa mellan E 8.0 och E 9.0 i embryon med ≥ 6 somite par. Roterande börjar i embryon med 6-8 somite par.
3. Pipettera 40 µL per brunn av DMEM kompletteras med 10% (v/v) fetalt bovint serum, L-glutamin och antibiotika i erforderligt antal pre belagda platta mikrotiterbrunnarna (se avsnitt 1).
4. Samla den flytande allantois genom att aspirera med ~ 5 µL PBS i en stor öppning av en 200 µL pipettspetsen. Överföra 1 allantois per brunn.
5. Inkubera i allantoides genom att placera de mikrotiter plattorna i en fuktad vävnadsodling inkubator (37 ° C, 5% CO₂) för t.ex., 6, 12 och 24 h. För att förhindra störningar med allantois fastsättning, flytta inte mikrotiter plattorna mellan dessa tidpunkter.
6. Vid varje tidpunkt, Poäng allantois fastsättning (t.ex., ingen fastsättning/flytande allantois, helt eller delvis bifogade allantois, fullt spridning allantois) med Mikroskop utrustat med fas kontrast eller differentialdelad störningar kontrast optik och en 5 × eller 10 × mål (figur 2).
   Obs: Representativa exempel på nyligen isolerade och fullt bifogade allantoides visas i figur 2. Ex utero, fäster den distala spetsen på allantoides isolerade från vildtyp C57BL/6J möss inom 4-6 h (Detta kallas partiell fastsättning av allantois), och full fastsättning av den hela allantois uppnås inom ~ 12 h av kultur. Av 18-24 h, har explant tillplattade och antog en cirkulär form (som avses som fullt sprida allantois) med en CD31-positiv vaskulär plexus^9,16.

5. bekräftande färgning av den explanterad Allantois för den endotelceller markör CD31

1. Aspirera odlingssubstratet av fullt spridning bladsticklingar och fixa cellerna genom att lägga till 40 µL per brunn 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD/PBS.
   Obs: PARAFORMALDEHYD är giftiga. Använd skyddshandskar och skyddsglasögon att undvika hud- och ögonkontakt.
2. Inkubera i 10 min vid RT, sedan Aspirera supernatanten. Tvätta tre gånger genom att lägga till 40 µL per brunn PBS och ta bort tvätt medlet genom skonsam sugkraft.
3. Permeabilize cellerna och blockera icke-specifik bindning webbplatser genom att lägga till 40 µL per brunn av 0,1% (v/v) Triton X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) normala get serum i PBS för 30 min vid RT. Wash två gånger genom att lägga till 40 µL per brunn PBS och ta bort tvätt medlet genom skonsam sugkraft.
   Obs: Protokollet kan pausas under natten på denna punkt.
4. Färga celler genom att lägga till 20 µL per brunn av primära anti-CD31 antikroppar utspädd 1:50 i 0,1% (w/v) BSA/PBS över natten vid 4 ° C. Tvätta tre gånger genom att lägga till 40 µL per brunn PBS och ta bort tvätt medlet genom skonsam sugkraft.
5. Detektera bundna primära antikroppar genom att lägga till 20 µL per brunn av fluorescently-märkta sekundära get anti råtta antikroppar utspädd 1: 200 i 0,1% (w/v) BSA/PBS för 1 h på RT. Protect mikrotiter plattor från ljus av inslagning i aluminiumfolie eller genom att placera i en mörk kammare. Tvätta tre gånger genom att lägga till 40 µL per brunn PBS och ta bort tvätt medlet genom skonsam sugkraft.
6. Bädda in celler genom att lägga till 20 µL per brunn av monteringsmedium. Inkubera i ~ 1 h på RT tills monteringsmedium har hårdnat. Lagra mikrotiter plattor på RT eller vid 4 ° C, skyddas från ljus.
7. Bild i vaskulär plexus av allantois explants i fluorescens Mikroskop utrustat med en 5 × eller 10 × mål och lämpliga fluorescens filter.
   Obs: Representativa bilder av CD31-positiv vaskulär plexus av ett helt uppslag allantois visas i figur 3. Andra markörer för vaskulär plexus, såsom antikroppar riktade mot Flk-1, Flt, Tie-1 eller Tie-2 kan användas som väl¹⁶.

Representative Results

Detta protokoll beskriver en metod att isolera och explant murina allantoides ex vivo, och detaljer den kvalitativa utvärderingen av allantois fastsättning till α4β1-integrin, en kritisk process under i vivo chorioallantoic fusion. De representativa resultat som visas i figur 1A–H visar de successiva steg av allantois isolering från gravida livmodern. Moderns vävnader som omger den livmoderns hornen, till exempel fettvävnad och fartyg (figur 1A) avlägsnas och embryon är dissekeras från endometriet i en stegvis sätt efter öppnandet den muskulösa uterina lagret (figur 1B- E). Därefter andra moderns vävnader såsom parietala gulesäcken och ectoplacental konen tas bort (figur 1E, F). Figur 1 g - H visar att tekniken består av dissektion av den embryoniskt allantois från gulesäcken, en annan embryoniskt och högt vaskulariserad vävnad. Således är allantoides som isolerats enligt detta protokoll gratis på kontaminerande maternell eller (extra) embryonala vävnader än allantois.

Figur 2 visar att storleken och formen av allantoides från färska dissekerade embryon i en enda kull kan variera avsevärt¹⁴. Allantoides av C57BL/6J vildtyp embryon dissekeras E 8,5 hade en långsträckt morfologi i 74% av fallen (45 61 analyserade embryon), som visas i figur 2 och figur 1 H. Emellertid i 15% (9/61) av embryon, allantoides var betydligt mindre och mer rundade (se referens¹⁴) och 11% (7/61) av embryon hade ännu inte bildat en synlig allantois vid tidpunkten för dissektion. Trots olikartade former och storlekar på tid startpunkten av allantois explant kultur (figur 2, paneler en–h), allantois fastsättning och full spridning på immobiliserade α4β1-integrin observerades inom 12 h i alla av de 54 nymalen isolerade allantoides dissekeras från embryon av sju kullar. Ändå, former och storlekar av bladsticklingar efter 12 h kultur var något heterogena (figur 2), vilket återspeglar de olika allantoiska morfologier på utgångspunkten för analysen.

Figur 3 visar en immunocytochemical färgning för CD31-positiv endotelceller i fullt bifogade allantoides efter 24 h explant kultur, vilket bekräftar att bladsticklingar hade utarbetat en vaskulär plexus genom denna tidpunkt, som beräknade^{9 , 16}. så vidhäftande allantois kulturer kan användas för att studera blodkärl bildas i vitro⁹. Därför publicerade de presenterade metoden avkastning allantois bladsticklingar som kan vara enkelt odlade ex vivo, i samförstånd med tidigare experimentella studier^9,16.

I protokollet fastställs ramen för mikroskopi-baserad bedömning av allantois fastsättning vid förutbestämda tidpunkter, som efter 12 h eller 24 h explant kultur. Resultatet kan utvärderas på ett kvalitativt sätt (delvis full fastsättning eller full spridning vid en given tidpunkt – Ja/Nej). Eftersom den samma explant kan visualiseras upprepade gånger och gjorde, återspeglar denna analys egenskaperna hos enskilda allantois explant kulturer över tid. Dessutom bildandet av en vaskulär plexus i fasta och färgade bladsticklingar kan bedömas (figur 3).

Figur 1: representant steg i allantois dissektion. (A) detalj Visa av en isolerad livmoderns horn. Livmodern knoppar som innehåller embryon är markerade med stjärnor; fettvävnad och fartyg kring livmoderns horn ses på vänster sida. (B) vy över decidua (endometriet) efter borttagning av den muskulösa lagret av livmodern. Den högt vaskulariserad, mesometrial Polen av decidua är orienterad till vänster, det anti-mesometrial (markerade med en stjärna) som innehåller embryot är orienterad till höger. (C) Side Visa av dissekerade anti-mesometrial Polen för den decidua (markerade med en stjärna). Pilen anger placeringen av embryot. (D) ovanifrån av den conceptus (pil) omgiven av parietala gulesäcken efter partiellt avlägsnande av den omgivande decidua. (E, F) Representativa utsikt över efterföljande steg i dissektion av embryot (pil). Pilspetsen visar gulesäcken. I (E) är ectoplacental konen (epc) synlig till höger. (G) delvis dissekering av embryot (pil) från gulesäcken (pilspetsar). Allantois är markerad med en röd stjärna. (H) isolerade embryo (pil) med allantois (röda stjärnan). Positionen där allantois kommer att minska från dess basala insticksstället bakre slutet av embryot indikeras med en röd streckad linje. Bilder togs på ett stereomikroskop med en 8:1 zoomomfång. Alla skala barer är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 2: heterogen former och storlekar av allantoides. Åtta allantoides (en–h) isolerades från embryon från en enda kull. Vänster panel, allantoides omedelbart efter dissektion (0 h). Högra panelen, de samma allantoides efter 12 h explant kultur. Bladsticklingar är ordentligt fastsatt och mesenkymala celler har spridit. Bladsticklingar är inringad om du vill visualisera explant storlekar. Bilder togs på Mikroskop utrustade med fas kontrast optik och en 5 × (till vänster) eller en 10 × mål (högra panelen). Alla skala barer är 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 3: vaskulär plexus bildning i allantois explant kulturer. Allantoides var dissekeras och explanterad på immobiliserade α4β1-integrin som beskrivs i detta protokoll. Bladsticklingar odlades för 24 h och endotelceller i vaskulär plexus var målat med anti-CD31 primära antikroppar och fluorescently märkt sekundära antikroppar. Endothelial celler visas i grönt. Övre bilden visar hela vaskulär plexus i den centrala delen av en representativ allantois explant. Bilden togs på Mikroskop utrustat med fluorescens optik och ett 5 × mål. Skalstapeln, 500 µm. De två nedersta panelerna är högre förstoring bilder av en annan allantois explant dissekeras och odlade på samma villkor. Fartyg-liknande strukturer och individuella endotelceller kan ses. Bilder togs på en confocal Mikroskop; skala barer, 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

I närvaro av serum, som är en rik källa av Pro självhäftande extracellulär matrix molekyler såsom Fibronektin, fäster allantois bladsticklingar lätt vid olika plast, glas eller filter ytor^9,16. Således, om utförs analysen syftar till specifikt undersöka effekten av en genetisk modifiering eller någon annan behandling på allantois fastsättning orörlig α4β1, är det kritiskt att blockera icke-specifik bindning platser (t.ex., med bovint serum albumin) efter beläggning ytorna med integrin och innan inkubation med serum-innehållande media.

Inledande fastsättning av allantois bladsticklingar till immobiliserade α4β1-integrin är mycket känsliga för rörelse och vävnadsodling plattorna bör därför lämnas ostört under en förutbestämd tidsperiod (t.ex., för 12 h) före scoring allantois bifogad fil. Observera att den tid som krävs för stabil kontakt med substratet kan variera beroende på analyserade mus stammen eller koncentrationen av immobiliserade α4β1-integrin.

Kravet i den intercellulära VCAM-1/α4β1-interaktionen för framgångsrika chorioallantoic fusion är etablerad^11,12,13. Dessutom kan extracellulär matrix molekyler såsom Fibronektin, kollagen och andra molekyler av intresse också orörlig och användas som ”chorio-mimetiska” substrat.

Chorioallantoic fastsättning är beroende av intercellulära samspelet mellan VCAM-1 och dess bindande partner integrin α4β1. In utero, chorioallantoic fastsättning och efterföljande fusion kan endast ske när allantois har tillräckligt utsträckt för att göra kontakt med chorion. Med tanke på fysiologiska variabiliteten i allantois storlekar på en viss utvecklingsfas, chorioallantoic fastsättning och fusion äga rum någon gång mellan E 8.0 och E 9.0 (intervall, E 7,5-E 9.25)^14,16. Metoder för att specifikt studera övergående processen allantois fastsättning av koriongonadotropin plattan i livmodern i levande musen inte är lätt tillgängliga på presenterar. Snarare, analyser är främst inriktad på den mödosamma bestämningen av chorioallantoic fusion av histologisk bedömning av t.ex., allantoiska sprids på ytan av chorion och utvecklingen av lagrets labyrint på en enda, förutbestämda tid punkt^11,12,13,16. Denna endpoint analys inte kan diskriminera defekter som specifikt beror på nedsatt fastsättning av allantois chorion och chorion-beroende effekter, och är begränsade av det inneboende variabilitet i embryots utvecklingsstadier och allantoiska storlekar. Som diskuterades under Representativa resultat, fysiologiska variabiliteten i allantois storlekar kan resultera i en relativ fördröjning i chorioallantoic fusion i ~ 26% av C57BL/6J vildtyp embryon. Statistiskt sett hade nästan två i sju dräktiga möss därför varit offrade för tidigt (61 embryon från sju kullar, genomsnittlig kullstorlek 8,7), vilket leder till nödvändigheten av en betydande avel överflödig för storskaliga studier. Intressant nog har mikrokirurgisk experiment visade att chorion redan är behöriga till säkring med allantois skede 1 somite par, och att allantois uppvisar maximal fusion kapacitet i embryon med 3-5 somite par¹⁴. Därför är chorioadhesive celler i allantois bildade och funktionellt behöriga före den faktiska chorioallantoic fastsättning i vivo. Ex utero analysen av allantois koppling till immobiliserade ligander, är som presenteras här, därför relativt oberoende av en viss allantois storlek. Därför är en fördel med denna metod det kringgår defekter i allantois töjning, som fokuserar på nästa steg i moderkakan bildande, dvs, chorioallantois fastsättning. Detta tillvägagångssätt kan således användas för att skilja defekter i allantois töjning och chorioallantois fastsättning i genetiska mus mutanter.

I motsats till den traditionella metoden av allantois aspiration från sin fästpunkt embryon med en mun pipett¹⁶, det nuvarande protokollet använder en manuell skärning tillvägagångssätt, och allantois hanteras därefter med stor öppning pipettspetsar . En viktig fördel av allantois ambition är att den här metoden undviker direkta vävnad hantering. Styckning och manipulera allantois kan skada de chorioadhesive cellerna i det yttre höljet av allantoiska mesothelium. Dock skära allantois med tången har framgångsrikt använts innan i ex vivo kulturer pre-placental vävnader¹⁷, och kineticsen av allantoiska explant fastsättning och morfologi av explant kulturer beskrivs i den föreliggande studie liknar publicerade data baserat på allantois isolering av aspiration¹⁶. Dessa rön tyder chorioadhesive celler är tillräckligt väl bevarade vid manuell tillskärning av allantois, som att explant differentiering är inte grovt oroade, indikerat av bildandet av CD31-positiva endothelia. Direkt kapning av allantois också erbjuder möjligheten att dissekera bara den övre två tredjedelen av allantois som uttrycker VCAM-1¹³, och det garanterar mindre nedsmutsning med gulesäcken-derived celler, som kan behöva trimmas bort från basen av den Allantois efter allantois aspiration¹⁸.

Ex utero analysen av allantoiska explant vidhäftning till orörlig, rekombinant α4β1-integrin ger en kvalitativ avläsning av ett viktigt, inledande steg som krävs för chorioallantoic fusion, dvs, den intercellulära interaktionen mellan VCAM-1 uttrycks på allantois och α4β1-integrin lokaliserade koriongonadotropin mesothelium, som härrör från embryoniskt mesoderm. Ändå, även om dessa två adhesionsmolekyler redovisas som princip spelare i chorioallantoic fusion, ~ 50% av embryon med homozygot knockout mutationer i VCAM-1 eller α4-integrin genomgår chorioallantoic fusion i vivo^{11 ,12,13}. På grund av denna ofullständig penetrans kanske ex vivo metoden som beskrivs i detta protokoll inte tillräcklig för att utesluta ett krav för dessa två adhesionsmolekyler i genetiska modeller med ett misslyckande av chorioallantoic fusion.

Under fysiologiska betingelser, α4β1 integriner är inbäddade i plasmamembranet av koriongonadotropin trofoblaster, och ingår i ett intrikat nätverk av strukturella och signalering proteiner som samverkar för att reglera cell-cell (och cell-matrix) vidhäftning ¹⁹. som med de flesta reduktionistiska in vitro- metoder, komplexiteten i gränssnittet bindande koriongonadotropin VCAM-1 modelleras endast i mycket begränsad utsträckning av immobiliserade α4β1-integrin. Förutom den potentiella bristen på andra viktiga strukturella eller signalering insatsvaror som härrör från intakt chorion i detta system, är det sannolikt att endast en bråkdel av den integriner som immobilizeds på en styv, tvådimensionell yta finns i aktiva, bindning-behöriga, ”öppna” konformation.

Den presenterade metoden approximerar tidiga kvarstad och sprida steg i allantois till chorion och kan även rapportera om utvecklingen av den allantoiska vaskulära plexus i kombination med analys av fartyget bildandet⁹. Dock den nuvarande strategin inte modellen invasionen av chorion genom groning angiogenes medieras av allantoiska endothelial celler, inte heller förgrenade morfogenes av chorion, som är en viktig process för chorioallantoic fusion och en framtida utveckling av placenta labyrint¹⁰.

Med faskontrast eller differentiell störningar mikroskopi kombineras med (semi-) automatiserad bildanalys, den presenterade metoden skulle kunna tillämpas i större skala skärmar för inledande analys av försenade eller misslyckade allantoiska fastsättning in vitro. Utöver analysen av mus mutanter, kan metoden vara av intresse att Visa effekterna av droger, patogener, metaboliter eller miljömässiga agenter på allantoiska fastsättning.

I talrika mus mutanter misslyckas chorioallantoic fastsättning förekommer, även om allantois och chorion verkar ha utvecklats normalt. Dessutom visar mutanter som visar chorioallantoic fastsättning defekter oftast ofullständig penetrans^1,2,10. Det är viktigt att undersöka huruvida dessa funktionellt tydligen mycket olika gener påverkar gemensamma molekylära vägar eller cellulära processer. Levande avbildning av allantois bladsticklingar härrör från mus mutanter har potential att belysa sådana mekanismer. Till exempel celler i yttre höljet av den dissekerade allantois kunde märkas med vitala fluorescerande färgämnen (såsom DiI eller DiO lipofila carbocyanine spårämnen^16,18) bild vidhäftning och sprida händelser, eller spåra cell migration i realtid. Dessutom kan fluorescerande journalisterna att visualiserar cytoskelettet eller vidhäftning proteinerna visa sig vara informativ.

Nyligen, ett ex vivo samtidig kultur system för före fastsättning murina allantoides och chorions har beskrivits, och detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts för att undersöka händelser som inträffar efter chorioallantoic bilaga, exempelvis labyrint lager bildandet¹⁷. Analysen av allantois fastsättning effektivitet på immobiliserade chorions isolerade från olika (t.ex., genetiskt modifierade) musmodeller kan ge nya insikter i molekylär spelare och vägar som styr tidiga steg i utvecklingen av den murina moderkakan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
α4β1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
α-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.