Summary
Vi beskriver i vitro analysen modell chorioallantoic vedlegget, det første trinnet i morkaken formasjonen. Protokoll viser murine allantoides på immobilisert α4β1 integrin disseksjon og explant kultur. Allantois vedlegg evalueres mikroskopisk på bestemt tidspunkt.
Abstract
Morkaken er viktig for vekst og utvikling av pattedyr embryo. Av denne grunn kan mange genetiske endringer og trolig også miljømessige fornærmelser som forstyrrer morkaken utvikling eller funksjon forårsake tidlig Graviditet i mus og mennesker. Likevel mangler enkel i vitro analyser til skjermen for potensielle virkninger på morkaken formasjon. Her fokusere vi på modellering det første og avgjørende skrittet i morkaken formasjon, som består av feste allantois å plasmocitara. Vi beskriver en metode for å raskt vurdere feste allantoic explants på immobilisert α4β1 Integra som fungerer som en chorio-mimetic substrat. Dette i vitro gir en kvalitativ vurdering av vedlegget og spre virkemåten for flere allantois explants på ulike påfølgende tidspunkt. Protokollen kan brukes å undersøke effekten av målrettet musen mutasjoner, narkotika eller forskjellige miljøfaktorer som har vært knyttet til graviditet komplikasjoner eller fosterets tap på allantois vedlegg ex vivo.
Introduction
Morkaken er uunnværlig for embryonale vekst og utvikling i livmor miljøet. Det utgjør grensesnittet for oksygen, metabolitten og næringsstoffer utveksling mellom fosterets og mors sirkulasjon og også funksjoner som en immunologiske og endokrine organ. Alle endogene eller eksogene krenke som svekker placental utvikling kan føre til intrauterine vekst retardasjon, fosterets tap eller graviditet komplikasjoner, både mus og mennesker1. Mens antall målrettet musen mutasjoner som forårsaker unormale placental fysiologi fortsetter å øke2, med 219 genotyper som er oppført på webområdet musen genomet informatikk (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), mange av disse fenotyper er ikke godt forstått fra en mekanistisk synspunkt. I tillegg til genetiske endringer, små molekyl narkotika, monoklonale antistoffer, toksiner, kan patogener, overflødig metabolitter eller ulike miljømessige agenter påvirke morkaken utvikling og funksjon3,4,5 , 6 , 7. ennå, enkel i vitro søk at modellen avgjørende skritt i morkaken utvikling er knappe.
Murine placental utvikling startes i tidlig midgestation, når allantois (utviklingspsykologi forløperen til navlestrengen) kommer fra den bakre enden av embryoet som en knopp som vokser mot plasmocitara8. Chorioadhesive celler i det ytterste laget av allantoic bud megle vedlegget og spredning av allantois på overflaten av plasmocitara (chorioallantoic "fusion"). Plasmocitara kaster deretter inn villi som er blodkar av allantois vokser til labyrinten, det indre placental laget der næringsstoffer og oksygen utveksles mellom tett juxtaposed mors blod sinusoids og embryonale fartøy9 ,10.
Feste allantois til plasmocitara er første og avgjørende skritt i labyrinten formasjon defekter i denne prosessen er blant de vanligste årsakene til embryonale dødelighet i midgestation1. Selv om en rekke musen mutanter har blitt beskrevet der chorioallantoic vedlegg mislykkes oppstår10, og MGI databasen for tiden viser 108 musen mutanter som er preget av unormal chorioallantoic fusion (http:// www.Informatics.JAX.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), intercellulære samspillet mellom vascular celle vedheft molekyl-1 (VCAM-1, på den allantoic mesoderm) og α4β1 integrin (uttrykt på chorion mesothelium, som er avledet fra extraembryonic mesoderm) synes å være uunnværlig for chorioallantoic vedlegg og fusion11,12,13. Immunohistochemical farging av hele-mount vill-type embryo har vist at VCAM-1 er uttrykt i den distale to tredjedeler av allantoic stilken på ca embryonale dag (E) 7.513 (1-4 somite scenen), og at uttrykket er fortsatt høy under chorioallantoic vedlegg og -fusion11,12. Feil på allantoic tilknytning til plasmocitara oppdages vanligvis av histologiske analyser av livmor knopper. Men allantois størrelser er fysiologisk svært variabel i mellom og innenfor søppel av den samme utviklingsstadiet14, og allantois kan bare legge til plasmocitara når den har nådd en tilstrekkelig størrelse å fysisk kontakt. Reflekterer denne naturlige variasjoner, chorioallantoic vedlegg finner sted en gang mellom ~ E 8.0 og E 9.0 i uteroog en statistisk pålitelig evaluering av denne prosessen av histology er derfor avhengig av analyse av et stort antall conceptuses å få nok eksemplarer på den aktuelle utviklingsstadiet.
Her beskriver vi en metode for å vurdere allantoic vedlegg ex utero som er mindre avhengig av allantois størrelse. Vi viser Disseksjon av mouse embryoer og deres allantoides fra uteri gravid mus ~ 8 dager legge coitum (dpc; dpc 0,5 angir deteksjon av en vaginal plugg), og den påfølgende kulturen i allantois explants på immobilisert α4β1 integrins. Denne metoden gjør det mulig for en rask, funksjonelle evaluering av vedlegget og spre virkemåten for flere allantois explants parallelt og påfølgende annen poeng. Protokollen kan brukes til skjermen for effekten av målrettet mutasjoner, narkotika eller ulike miljømessige faktorer på allantois vedlegg ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musen avl ble godkjent av Regierung Unterfranken, og alle analyser ble utført i strengt samsvar med alle tyske og EUs gjeldende lover og forskrifter om omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. coating av være ferdig innen plater med α4β1 Integrin for Ex Utero Allantois Explant Culture
- Rekonstituer lyofilisert murine α4β1 integrin på 200 µg/mL i sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS). Fortynne til en siste konsentrasjon av 10 µg/mL forvarmes 37 ° c PBS. Pipetter 20 µL/vel av fortynnet α4β1 integrin løsningen i antall brønner av en være ferdig innen plate (1 allantois/vel).
Merk: Unngå dannelse av luftbobler når belegg brønnene av være ferdig innen plate. - Inkuber være ferdig innen platene for 60 min på 37 ° C ved å plassere dem i en fuktet vev kultur inkubator.
- Nøye Sug opp nedbryting med en pipette. Bruke skånsom og helle platen til unngå å berøre frisk bunnen med Pipetter spissen. Vask brønner to ganger ved å legge til 50 µL av forvarmes (37 ° C) kultur medium som Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM), og fjern vask mediet av skånsom.
- Kritisk trinn: blokk gratis bindende områder ved å legge til 50 µL/godt av 0,1% (w/v) bovin serum albumin (BSA) / DMEM og Inkuber for ≥ 30 min på 37 ° C ved å være ferdig innen platene for en fuktet vev kultur inkubator.
Merk: Allantois explants kan knytte til ulike overflater i nærvær av serum. Det er derfor viktig å blokkere ikke-spesifikk bindende, etter belegg brønnene integrin og før du legger den dissekert allantois for explant kultur i serum inneholder medium (se trinn 4.4). - Hold belagt brønnene i blokkering løsning på 37 ° C til nødvendig i trinn 4.4.
2. livmoren disseksjon fra en gravid mus på Dpc 8
Merk: Redusere falske positive svangerskap priser vekt gevinst diskriminering15.
- Ofre musen for cervical forvridning. Desinfiser pelsen i mageområdet ved å spraye den med 70% (v/v) etanol.
Merk: Bruk hansker når du håndterer mus. Eutanasi av cervical forvridning uten bedøvelse hindrer kjemisk forurensning av allantois, som kan forstyrre allantois vedlegg. - Åpne abdominal huden ved å gjøre et lite innsnitt på midtlinjen med saks. Bruk hansker fingrene til å holde huden over og under innsnitt, og trekke huden fra hverandre mot brystet og halen av musen.
- Forstå peritoneum med tang. Med den andre hånden, gjør en V-formet snitt fra fremre mot bakre med saks, og Flytt vevet unna å avsløre bukhulen. Bruk tang til å presse tarmen til side for å få tilgang til livmoren.
- Finn to livmor hornene. Hold livmorhalsen (caudal segmentet) med tang og kuttet båndene med fine saks. Deretter koble både livmor horn ved severing av oviducts med saks.
- Bruk tang til å overføre livmor inn en bakteriefri 10 cm parabolen inneholder sterilt, romtemperatur (RT) PBS. Fjerne fettvev, fartøy og nervene rundt livmor hornene med fine pinsett og/eller saks (figur 1A).
3. embryo disseksjon
Merk: Gjør du følgende under et stereomicroscope utstyrt med en 8:1 zoomområdet.
- Skille embryoene ved å kutte mellom webområdene implantering med saks. Forstå muskel livmor slimhinnen i livmoren knopper med tang og trekke det fra hverandre for å avsløre decidua (figur 1B).
- Ved hjelp av pinsett, overføre livmoren knoppene i en ny 10 cm rett som inneholder sterilt, RT PBS.
- Fastsette decidua rundt embryoet med tips av tang.
- Gjør en snitt på anti-mesometrial siden av decidua med fine tang (figur 1 c), og løsner decidua med tang å avsløre embryoet (figur 1 d).
Merk: Den mesometrial Polen på decidua er svært Stangeriaceae og kan være bredere på sin base enn delen anti-mesometrial, som inneholder embryoet vises blekere. - Dissekere embryoet med tang (figur 1E, F).
- Bruke en mikro-skje, overføre embryoet til en dråpe sterilt PBS i et sterilt 3,5 cm fat.
- Overføre embryoet til en frisk dråpe PBS i samme 3,5 cm parabolen bruke en mikro-skje og dissekere embryoet fra plommesekken ved hjelp av pinsett (figur 1G, H).
- Eventuelt, hvis nødvendig (f.eksfor genotyperingteknologi av polymerasekjedereaksjons), overføre plommesekken inn i et sterilt rør av aspirating med ~ 5 µL PBS i et stort orifice 200 µL pipette tips. Butikken på 20 ° C.
Merk: Mors vev (dvs., parietal plommesekken inkludert Reicherts membranen og ectoplacental membran) som kan forurense eggeplomme sac utarbeidelse kan føre til feilaktige genotyperingteknologi resultater. Fjerning av disse vev er enkleste før embryoet dissection fra plommesekken.
4. allantois disseksjon og Ex Utero kultur på immobilisert α4β1 Integrin
- Klipp allantois fra det basale innsetting området på bakre slutten av fosteret ved hjelp av fine pinsett (figur 1 H).
- Eventuelt hvis utviklingsmessige regi, telle somite par av embryoet visuell inspeksjon ved hjelp av et mikroskop utstyrt med fase kontrast optikk og en 5 × 10 × mål.
Merk: Fosteret kan utvides med tang å lette somite teller. Chorioallantoic vedlegg og fusion oppstår mellom E 8.0 og E 9.0 i embryoer med ≥ 6 somite par. Snu begynner i embryo med 6-8 somite par. - Pipetter 40 µL/godt av DMEM med 10% (v/v) fetal bovin serum, L-glutamin og antibiotika i antall pre belagt mikrotiterbrønnene med plate som er (se del 1).
- Samle flytende allantois av aspirating med ~ 5 µL PBS i en stor orifice et 200 µL pipette tips. Overføre 1 allantois/godt.
- Ruge på allantoides ved å plassere være ferdig innen platene i en fuktet vev kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) for eksempel, 6, 12 og 24 timer. For å hindre interferens med allantois vedlegg, ikke flytte være ferdig innen platene mellom disse tidspunkt.
- På hvert punkt, scorer allantois vedlegg (f.eks, ingen vedlegg/flytende allantois, helt eller delvis vedlagte allantois, fullt spre allantois) ved hjelp av et mikroskop utstyrt med fase kontrast og differensielle forstyrrelser kontrast optikk og en 5 × eller 10 × mål (figur 2).
Merk: Representative eksempler på fersk isolert og fullstendig tilknyttede allantoides er vist i figur 2. Ex utero, festes den distale tuppen på allantoides isolert fra wildtype C57BL/6J mus innen 4-6 timer (Dette kalles delvis vedlegg av allantois) og full feste hele allantois oppnås innen ~ 12 h kultur. 18-24 h, har explant flat og antatt en sirkulær form (kalt som fullt spre allantois) med en CD31-positive vaskulær plexus9,16.
5. bekreftende farging av den Explanted Allantois for Endothelial celle markør CD31
- Sug opp kultur medium for fullt spre explants og fikse cellene ved å legge til 40 µL/godt av 4% (w/v) paraformaldehyde/PBS.
Merk: Paraformaldehyde er giftige. Bruke hansker og vernebriller å unngå hud- og øyekontakt. - Inkuber i 10 min på RT og Sug opp nedbryting. Vask tre ganger ved å legge til 40 µL/godt av PBS og fjerner vask medium ved skånsom.
- Permeabilize cellene blokkere ikke-spesifikk bindende ved å legge til 40 µL/godt på 0,1% (v/v) Triton X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) normal geit serum i PBS i 30 min på RT. Wash to ganger ved å legge 40 µL/godt av PBS og fjerne vask medium ved skånsom.
Merk: Protokollen kan pauses natten på dette punktet. - Stain celler ved å legge til 20 µL/vel av primære anti-CD31 antistoffer utvannet 1:50 på 0,1% (w/v) BSA/PBS natten på 4 ° C. Vask tre ganger ved å legge til 40 µL/godt av PBS og fjerner vask medium ved skånsom.
- Oppdage bundet primære antistoffer ved å legge til 20 µL/godt av fluorescently-merket sekundære geit anti-rotte antistoffer utvannet 1:200 på 0,1% (w/v) BSA/PBS 1t på RT. beskytte microtiter plater fra lys tekstbryting i aluminiumsfolie eller plassere i en mørk kammer. Vask tre ganger ved å legge til 40 µL/godt av PBS og fjerner vask medium ved skånsom.
- Bygge inn cellene ved å legge til 20 µL/vel av montering medium. Inkuber ~ 1 h på RT til montering mediet har styrket. Lagre microtiter plater på RT eller 4 ° C, beskyttet mot lyset.
- Bilde av vaskulær plexus av allantois explants under fluorescens mikroskop utstyrt med en 5 × eller 10 × mål og egnet fluorescens filtre.
Merk: Representant bilder av CD31-positive vaskulær plexus av en fullt spre allantois er vist i Figur 3. Andre markører for vaskulær plexus, som antistoffer rettet mot Flk-1, Flt, uavgjort-1 eller Tie-2 kan brukes godt16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver en metode for å isolere og explant murine allantoides ex vivoog detaljer kvalitativ vurdering av allantois vedlegg til α4β1 integrin, en kritisk prosess under i vivo chorioallantoic fusion. Representant resultatene som vises i figur 1A--H viser de påfølgende trinnene i allantois isolasjon fra gravid livmor. Mors vev som omgir livmor hornene, som fettvev og fartøy (figur 1A) er fjernet og embryo er dissekert fra endometrium på en step-wise måte etter åpning opp muskel livmor laget (figur 1B- E). Deretter andre mors vev som parietal plommesekken og ectoplacental membran fjernes (figur 1E, F). Figur 1G - H viser at teknikken består av Disseksjon av det extraembryonic allantois fra plommesekken, en extraembryonic og svært Stangeriaceae vev. Dermed er allantoides isolert i henhold til denne protokollen stort sett uten forurensende mors eller (ekstra) embryonale vev enn allantois.
Figur 2 viser at størrelsen og formen på allantoides fra ferske dissekert embryo i ett enkelt kull kan variere betydelig14. Allantoides av C57BL/6J wildtype embryo dissekert på E 8.5 hadde en langstrakt morfologi 74% av tilfellene (45 av 61 analysert embryo), som vist i figur 2 og figur 1 H. Men i 15% (9/61) av embryo, allantoides var betydelig mindre og mer avrundet (se referanse14) og 11% (7/61) av embryoene hadde ikke ennå dannet en synlig allantois ved disseksjon. Til tross for ulike former og størrelser på tid utgangspunktet for allantois explant kultur (figur 2, paneler en-h), allantois vedlegg og full spredning på immobilisert α4β1 integrin ble observert i 12 h i alle av de 54 fersk isolert allantoides dissekert fra embryo av syv søppel. Likevel, former og størrelser av explants etter 12 timer med kultur var noe heterogene (figur 2), som reflekterer de forskjellige allantoic morphologies på startpunktet for analysen.
Figur 3 viser en immunocytochemical flekk for CD31-positive endotelceller i fullt vedlagte allantoides etter 24 timer for explant kultur, som bekrefter at explants hadde utarbeidet en vaskulær plexus av dette punkt, som forventet9 , 16. slik tilhenger allantois kulturer kan brukes til å studere blodkar formasjonen i vitro9. Derfor publisert presentert metodikken gir allantois explants som kan lett kultivert ex vivo, overholder tidligere eksperimentelle studier9,16.
Protokollen angir rammeverket for mikroskopi-basert vurdering av allantois vedlegg på forhåndsbestemte tidspunktet poeng, som etter 12 h eller 24 h explant kultur. Resultatene kan evalueres på en kvalitativ måte (delvis/fullstendig vedlegg eller full spredning på et gitt tidspunkt-Ja/nei). Siden den samme explant kan visualisere og scoret gjentatte ganger, gjenspeiler denne analysen karakteristikkene av personlige allantois explant kulturer over tid. I tillegg dannelsen av en vaskulær plexus i faste og farget explants kan være vurdert (Figur 3).
Figur 1: representant trinn i allantois disseksjon. (A) detaljert visning av en isolert livmor horn. Livmor knopper som inneholder embryoene er markert med stjerner; fettvev og fartøy rundt livmor Hornet vises på venstre side. (B) visning av decidua (endometrium) etter fjerning av muskel laget av livmor. Den svært Stangeriaceae, mesometrial Polen på decidua er innrettet til venstre, anti-mesometrial del (merket med en stjerne) som inneholder embryoet er orientert mot høyre. (C) Side utsikt over den dissekert anti-mesometrial Polen på decidua (merket med en stjerne). Pilen viser plasseringen av fosteret. (D) ovenifra conceptus (pil) omgitt av parietal plommesekken etter delvis fjerning av det omkringliggende decidua. (E, F) Representant utsikt over påfølgende trinnene i Disseksjon av embryoet (pil). Pilspissen angir plommesekken. I (E) vises ectoplacental membran (epc) til høyre. (G) delvis Disseksjon av embryoet (pil) fra plommesekken (pilspisser). Allantois er merket med en rød stjerne. (H) isolert embryo (pil) med allantois (røde stjerne). Posisjonen der allantois vil bli kuttet fra det basale innsetting området i den bakre enden av embryoet angis med en rød, stiplet linje. Bildene ble tatt på en stereomicroscope med en 8:1 zoomområdet. Alle skala barer er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ulike former og størrelser på allantoides. Åtte allantoides (en-h) ble isolert fra embryoene til ett enkelt kull. Venstre panelet, allantoides umiddelbart etter disseksjon (0 h). Høyre panelpå samme allantoides etter 12 h explant kultur. Explants er godt festet, og mesenchymal celler har spredt. Explants er sirklet for å visualisere explant størrelser. Bildene ble tatt på et mikroskop utstyrt med fase kontrast optikk og en 5 × (venstre panel) eller et 10 × mål (høyre side). Alle skala barer er 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: vaskulær plexus formasjonen i allantois explant kulturer. Allantoides var dissekert og explanted på immobilisert α4β1 integrin som beskrevet i stede protokollen. Explants ble kultivert 24 h, og endotelceller i vaskulær plexus var farget med anti-CD31 primære antistoffer og fluorescently merket sekundære antistoffer. Endotelceller vises i grønt. Øverste bildet viser hele vaskulær plexus i det sentrale området av en representant allantois explant. Bildet ble tatt på et mikroskop fluorescens optikk og en 5 × målsetting. Skala bar, 500 µm. To lavere panelene er høyere forstørrelse bilder av en annen allantois explant dissekert og kultivert under like forhold. Fartøyet-lignende strukturer og personlige endotelceller kan sees. Bildene ble tatt på AC confocal mikroskop; skalere barer, 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I nærvær av serum, som er en rik kilde av Pro lim ekstracellulær matrix molekyler som fibronectin, vil allantois explants lett legge til ulike plast, glass eller filter overflater9,16. Dermed, hvis målet med utført analysen er spesielt undersøke effekten av en genetisk modifisering eller noen andre behandling allantois vedlegg til immobilisert α4β1, er det viktig å blokkere ikke-spesifikk bindende områder (f.eksmed bovin serum albumin) etter belegg overflater med integrin og før rugende med serum inneholder medier.
Allantois explants første feste til immobilisert α4β1 integrin er svært følsom for bevegelser og vev kultur platene bør derfor være igjen uforstyrret for en forhåndsbestemt tidsperiode (f.eks12 h) før scoring allantois vedlegg. Merk at tiden det tar for stabil kontakt formasjon med underlaget kan variere avhengig av belastningen analysert musen eller konsentrasjonen av immobilisert α4β1 integrin.
Kravet til intercellulære VCAM-1/α4β1-samhandlingen for vellykket chorioallantoic fusion er fast etablert11,12,13. Ekstracellulær matrix molekyler som fibronectin, collagens og andre molekyler rundt kan i tillegg immobilisert også og brukt som "chorio-mimetic" underlag.
Chorioallantoic er avhengig av intercellulære samspillet mellom VCAM-1 og dens bindende partner integrin α4β1. In utero, chorioallantoic vedlegg og påfølgende fusion kan bare oppstå når allantois har tilstrekkelig utvidet å kontakt med plasmocitara. Gitt fysiologiske variasjon i allantois størrelser på en bestemt utviklingsstadiet, chorioallantoic vedlegg og fusion finner sted en gang mellom E 8.0 og E 9.0 (range, E 7.5-E 9,25)14,16. Metoder spesielt studie forbigående prosessen med allantois vedlegg chorion plate i utero i levende mus ikke er lett tilgjengelig i dag. Snarere analyser er hovedsakelig fokusert på arbeidskrevende fastsettelse av chorioallantoic blanding av histologiske vurdering av f.eks, allantoic sprer seg på overflaten av plasmocitara og utvikling av labyrint laget på en enkelt, forhåndsbestemt tid punkt11,12,13,16. Analyseresultatene endepunktet kan ikke forskjellsbehandle som spesielt skyldes nedsatt vedlegg av allantois plasmocitara og plasmocitara-avhengige effekter, og er begrenset av den iboende variasjonen i fosteret utviklingsstadier og allantoic størrelser. Som diskutert under Representant resultater, fysiologiske variasjon i allantois størrelser kan resultere i en relativ forsinkelse i chorioallantoic fusjon i ~ 26% av C57BL/6J wildtype embryoer. Statistisk sett ville nesten to i sju gravid mus derfor blitt ofret for tidlig (61 embryoer fra syv kull, gjennomsnittlig søppel størrelse 8,7), som oversetter til nødvendigheten av en betydelig avl overflødig for større skala studier. Interessant, har Mikrokirurgiske eksperimenter avslørt at plasmocitara er allerede kompetent å fusjonere med allantois på 1 somite par scenen, og at allantois viser maksimal smelting kapasitet i embryoer med 3-5 somite par14. Derfor er chorioadhesive cellene i allantois dannet og funksjonelt kompetent før den faktiske chorioallantoic vedlegg i vivo. Ex utero analyse av allantois vedlegg til immobilisert ligander, er som presenteres her, derfor relativt uavhengig av en gitt allantois størrelse. Derfor er en fordel med denne metoden at det omgår mangler i allantois forlengelse, og fokuserer på neste trinn i morkaken formasjon, dvs, chorioallantois vedlegg. Denne tilnærmingen kan dermed brukes til å skille mellom feil i allantois forlengelse og chorioallantois vedlegg i genetisk musen mutanter.
I motsetning til den tradisjonelle metoden for allantois aspirasjon fra sin festepunkt til fosteret ved hjelp av en munn pipette16, gjeldende protokollen bruker en manuell skjæring tilnærming, og allantois behandles deretter med store orifice pipette-spisser . En viktig fordel med allantois aspirasjon er at denne metoden unngår direkte vev håndtering. Skjæring og manipulere allantois skade chorioadhesive cellene i ytre skjede av allantoic mesothelium. Likevel klippe allantois med tang har blitt brukt før i ex vivo kulturer pre-placental vev17, og the kinetics av allantoic explant vedlegg og morfologi av explant kulturer beskrevet i det Denne studien er like publiserte data basert på allantois isolasjon av aspirasjon16. Disse funnene tyder på at chorioadhesive celler er tilstrekkelig godt bevart ved manuell kutting av allantois, og at explant differensiering er ikke grovt perturbed, som indikert av dannelsen av CD31-positive endothelia. Direkte kutting av allantois også tilbyr muligheten til å analysere bare de øverste to tredjedeler av allantois som uttrykker VCAM-113, og sikrer mindre forurensning med eggeplomme sac-avledet celler, som må trimmes fra bunnen av den allantois etter allantois aspirasjon18.
Ex utero -analyse av allantoic explant vedheft til immobilisert rekombinant α4β1 integrin gir en kvalitativ presentasjon av en viktig, første trinn som kreves for chorioallantoic fusion, dvs, intercellulære samspillet mellom VCAM-1 uttrykt på allantois, og α4β1 integrin lokalisert chorion mesothelium, som er avledet fra extraembryonic mesoderm. Likevel, selv om disse to vedheft molekyler er anerkjent som prinsipp spillere i chorioallantoic fusion, ~ 50% av embryo homozygous knockout mutasjoner i VCAM-1 eller α4 integrin gjennomgå chorioallantoic fusion i vivo11 ,12,13. På grunn av denne ufullstendig penetrance, kan ex vivo metoden beskrevet i stede protokollen ikke være tilstrekkelig til å utelukke et krav for disse to vedheft molekyler i genetisk modeller med en feil chorioallantoic Fusion.
Under fysiologiske forhold, α4β1 integrins er innebygd i plasma membranen av chorion trophoblasts og er innlemmet i et intrikat nettverk av strukturelle og signalnettverk proteiner som samarbeider for å regulere celle-celle (og celle-matrix) vedheft 19. som med de fleste reduksjonistiske i vitro tilnærminger, kompleksiteten av chorion VCAM-1 bindende grensesnittet er bare modellert i svært begrenset grad av immobilisert α4β1 integrin. Foruten potensielle mangel på andre viktige strukturelle eller signalnettverk innspill avledet fra den intakte plasmocitara i dette systemet, er det sannsynlig at bare en brøkdel av integrins som er blokkert på en rigid, todimensjonal flate er tilstede i aktive binding-kompetente, "åpne" konformasjon.
Metoden presentert tilnærmet tidlig vedlegget og spre trinn i allantois til plasmocitara, og kan også rapportere om utviklingen av den allantoic vaskulære plexus kombinert med analyse av fartøyet formasjon9. Men nåværende tilnærming ikke modell invasjonen av plasmocitara av spirende angiogenese formidlet av allantoic endotelceller, heller ikke reflekterer det branching morphogenesis av plasmocitara, som er en viktig prosess for chorioallantoic fusion og senere utvikling av placental labyrint10.
Kontrast eller differensiell forstyrrelser mikroskopi kombinert med (semi-) automatisert bildeanalyser, presentert metoden kan brukes i større skala skjermer for første analyse av forsinket eller mislykket allantoic vedlegg i vitro. I tillegg til analysen av musen mutanter, kan metoden være av interesse for skjermen virkningene av narkotika, patogener, metabolitter eller miljømessige agenter allantoic vedlegg.
I mange musen mutanter mislykkes chorioallantoic vedlegg skje, selv om allantois og plasmocitara synes å ha utviklet seg normalt. Videre vise mutanter som viser chorioallantoic vedlegg defekter vanligvis ufullstendig penetrance1,2,10. Det vil være viktig å undersøke om disse funksjonelt tilsynelatende svært forskjellige gener påvirker vanlige molekylær veier og/eller cellulære prosesser. Live bildebehandling av allantois explants fra musen mutanter har potensial til å belyse slike mekanismer. For eksempel celler i den ytre skorpe av dissekert allantois kunne merkes med viktig fluorescerende fargestoffer (for eksempel DiI eller DiO lipofile carbocyanine tracers16,18) bildet vedheft og spre arrangement, eller spore celle migrasjon i sanntid. I tillegg fluorescerende journalister som Visualiser cytoskjelett eller vedheft proteinene kan vise seg for å være informativ.
Nylig en ex vivo co kultur system for pre vedlegg murine allantoides og chorions har blitt beskrevet, og dette ble brukt til å undersøke hendelser som oppstår etter chorioallantoic vedlegg, for eksempel labyrint laget dannelse17. Analyse av allantois vedlegg effektivitet på immobilisert chorions isolert fra ulike (f.eksgenmodifiserte) musen modeller kan gi ny innsikt i molekylær spillere og veier som styrer, tidlige trinn i utviklingen av den murine morkaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (til A.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J wildtype mice | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| 70 % (v/v) Ethanol | VWR International | 930031006 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Forceps used to open the abdominal cavity. |
| Micro dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip. |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Straight blades. |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds. |
| Microspoon | Carl Roth | AT18.1 | 5 mm Spoon diameter. |
| Microtiter plates | ibidi | 81501 | We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic. |
| 10 cm dish | Nunc | 150350 | Sterile tissue culture dishes. |
| 3.5 cm dish | Nunc | 150288 | Sterile tissue culture dishes. |
| Large orifice pipette tips | Biozym | VT0140X | Low binding pipette tips, 200 µL. |
| α4β1 integrin | R&D Systems | 6054-A4 | Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-03600 | The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| L-Glutamine | PAN Biotech | P04-80100 | 100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C. |
| para-Formaldehyde | Carl Roth | 0335.2 | To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks. |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100. |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses. |
| α-CD31 Antibodies | BD Biosciences | 550274 | Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3. |
| Secondary goat anti-rat antibodies | Thermo Fisher | A-11006 | Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible. |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000 |
| Labovert | Leitz | Labovert | Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable. |
| M80 | Leica Microsystems | M80 | Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection. |
| DM4000B | Leica Microsystems | DM4000B | Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment. |
| Digital camera | JVC | KY-F75U | 3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective. |
References
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).
- Segerer, G., et al. An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation. Sci Rep. 6, 35160 (2016).
- Kane, S. V., Acquah, L. A. Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy. Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).
- Xu, X., Vugmeyster, Y. Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics. AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).
- Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).
- Racicot, K., Mor, G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).
- Grandjean, P., et al. Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives. Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).
- Inman, K. E., Downs, K. M. The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus. Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).
- Arora, R., Papaioannou, V. E. The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation. Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).
- Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development. 121 (2), 549-560 (1995).
- Gurtner, G. C., et al. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).
- Kwee, L., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121 (2), 489-503 (1995).
- Downs, K. M., Gardner, R. L. An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated. Development. 121 (2), 407-416 (1995).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
- Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. Study of the murine allantois by allantoic explants. Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).
- Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha. Placenta. 47, 12-23 (2016).
- Zeigler, B. M., et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential. Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).
- Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).
