Summary
Se presenta un protocolo mejorado para la medición de la expresión de genes transitorios de construcciones de reportero en las células de aleurona de cebada después de bombardeo de partículas. La combinación de grano automático con placa de 96 pozos análisis de enzima proporciona alto rendimiento para el procedimiento.
Abstract
La capa de aleurona de cereales de cebada es un sistema de modelo importante para la expresión de genes regulados por hormonas en las plantas. En las células de la aleurona, genes requieren para la germinación o desarrollo temprano de la plántula son activados por giberelinas (GA), mientras que los genes asociados con respuestas de estrés son activados por el ácido abscísico (ABA). Los mecanismos de señalización de GA y ABA pueden ser interrogados por introducir reportero gene construcciones en las células de aleurona mediante bombardeo de partículas, con la expresión transitoria resultante medida mediante pruebas enzimáticas. Se divulga un protocolo mejorado parcialmente que automatiza y agiliza el paso de homogeneización del grano y el análisis de enzima, lo que permite mucho más rendimiento que los métodos existentes. Homogeneización de las muestras de grano se lleva a cabo utilizando un homogeneizador de tejidos automatizados, y GUS (β-glucuronidasa) los ensayos se llevan a cabo mediante un sistema de placa de 96 pocillos. Resultados representativos usando el protocolo sugieren que la actividad de la fosfolipasa D puede desempeñar un papel importante en la activación de la expresión de genes HVA1 por ABA, a través del factor de transcripción TaABF1.
Introduction
La capa de aleurona de cebada es un sistema de modelo bien establecido para el estudio de la expresión de genes regulados por hormonas en las plantas1. En particular, un número de genes necesarios para la germinación o el desarrollo temprano de la plántula es activado por giberelinas (GA), mientras que los genes asociados con respuestas de estrés son activados por el ácido abscísico (ABA). El GA y ABA vías de señalización están entrelazados, como la expresión de algunos genes de GA activa es inhibida por ABA y viceversa1.
Una estrategia valiosa para entender que el papel de los actores particulares en la señalización de ABA/GA ha sido la introducción de efector gen construcciones mediante bombardeo de partículas, seguida de la expresión transitoria de construcciones de reportero que permiten el efecto resultante en expresión del gen aguas abajo a determinarse. El uso de genes del reportero luciferasa como GUS (β-glucuronidasa) permite la medida sensible y cuantitativa de la expresión génica específicamente dentro de las células que han recibido la construcción del generador de efectos. Por ejemplo, la introducción de un concepto de efector codifican el factor de transcripción TaABF15,6 estableció que los genes inducidos por ABA como HVA1 son inducidos por TaABF1, mientras que de genes inducida por GA como Amy32b son reprimidos. Bombardeo de partículas como una estrategia experimental se ha utilizado por varios laboratorios para investigar diversos aspectos de la señalización de ABA/GA. Dicho trabajo ha conducido a la identificación de los elementos del promotor importantes de la activación inducida por GA2 y3de genes inducidos por ABA y al descubrimiento de la proteína kinasas4 y factores de transcripción5 que regulan la expresión de estos genes.
Los actuales protocolos2,3,4,5,6 por bombardeo de partículas y medición posterior de la expresión génica transitoria son bastante mano de obra, como cada juego de bombardea apenas granos se homogeneiza con la mano en un mortero y los análisis de enzima se llevan a cabo individualmente. Este manuscrito informa un protocolo mejorado que parcialmente automatiza y simplifica el paso de homogeneización y GUS ensayos para permitir un rendimiento significativamente más, permitiendo un mayor número de tratamientos en el mismo experimento, o la inclusión de más repeticiones para cada tratamiento obtener resultados estadísticamente robustos más. Se muestran resultados representativos para la expresión de construcciones de reportero HVA1 y Amy32b , regulado por el factor de transcripción TaABF1, así como por otras moléculas reguladoras, GA y ABA.
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Protocol
1. preparación del efector y gen reportero construye
- Construir estructuras efectoras que emplean a un promotor constitutivo (e.g. ubiquitina de maíz, UBI) a la expresión de la unidad desde un marco de lectura abierto deseada. Por ejemplo, la construcción de un plásmido que contiene UBI::TaABF1 de fuerte expresión constitutiva unidad de TaABF15.
- Construir construcciones reportero que incluyen el promotor cuya actividad es la que se medirá, situado aguas arriba de un marco abierto de lectura, como GUS. Por ejemplo, la construcción de un plásmido que contiene HVA1::GUS para medir la expresión de la HVA1 promotor2,5.
- Construir un concepto de control interno (por ejemplo, UBI::luciferasa).
- Usando una columna de sílice enlace protocolo (véase Tabla de materiales), preparación de plásmido de alta calidad para cada una de las construcciones de genes requeridos. Usando la Espectroscopia ultravioleta (véase Tabla de materiales), cuidadosamente Mida la concentración de cada preparación de plásmido.
2. preparación de granos de cebada para el bombardeo
- Configurar una hoja de cálculo (ver figura 1 para un ejemplo) indicando la plásmidos que será bombardeada, los tratamientos adecuados de la hormona y otra información pertinente para cada tratamiento que será parte del experimento.
- Usando una tabla de cortar y una hoja de afeitar estéril, cortar los embriones de granos de cebada de Himalaya (40 para cada tratamiento en el experimento). Excluir los granos que están decolorados o substancialmente más pequeño que el promedio.
- Coloque los granos de embryoless en un tubo de 50 mL. Añadir 40 mL de agua y roca durante 10 minutos.
- Vierta el agua con cuidado (para evitar la pérdida de granos) y añadir 40 mL de lejía del 10%. Roca durante 20 minutos.
- Verter la lejía y añadir 40 mL de agua estéril. Roca durante 5 minutos. Repita este lavado con agua estéril cuatro veces más.
- Añadir 40 mL de solución bebiendo (succinato de sodio 20 mM, cloruro de calcio 20 mM, pH 5,0) y 40 μL de la solución madre de cloranfenicol (10 mg/mL).
- Transferir la mayor parte de la solución bebiendo (con cloranfenicol) del tubo a una placa de vermiculita (véase Tabla de materiales). Luego se transfieren los granos sobre la superficie de papel de filtro húmedo en la placa de vermiculita. Se extienden los granos uniformemente. Vierta suficiente bebida solución para guardar los granos parcialmente (pero no totalmente) sumergido. Coloque la tapa encima de la placa de vermiculita.
- Incubar los granos embryoless a 24 ° C por cerca de 48 horas con iluminación fluorescente. Añadir solución bebiendo adicional según sea necesario.
- Arriba de un plato de petri plástico 90 mm y vierta 20 mL de solución de ingerir en el plato sí mismo y 20 mL en la tapa invertida. Añadir 20 μL del cloranfenicol (10 mg/mL) a cada uno. Esterilizar de dos pares de pinzas de punta fina por inmersión en alcohol.
- Coloque algunos de los granos de embryoless en la tapa de la caja Petri. Usando las pinzas, suavemente Retire la capa de semilla (transparente) de cada grano. Mientras se retira la capa de semilla desde el lado liso del grano, no dañe las células subyacentes (aleurona). Transferir el grano pelado a la placa de Petri que contenga solución de bebiendo.
- Después de pelar la capa de la semilla de todos los granos, devolverlos a la placa de vermiculita. Incubar los granos pelados embryoless a 24 ° C durante 16-20 horas.
- Antes de usar los granos para el bombardeo, eliminar la humedad superficial por agitación entre papeles de filtro en una placa Petri.
3. preparación de plásmido ADN para el bombardeo
- Etiquetar un tubo de 1,5 mL para cada tratamiento que se incluirán en el experimento de bombardeo. Añadir a cada tubo 2.5 μg de UBI:: plásmido de control interno deluciferasa , 2,5 μg de un plásmido de reportero GUS y la cantidad deseada (generalmente 0.025 μg 2.5 μg) de un plásmido de efector. Añadir agua para hacer el volumen total de 5 μl.
- Preparar 1,6 microcarriers μm oro (véase Tabla de materiales) siguiente publicado protocolos6.
- Para cada tratamiento, añada 50 μl de suspensión microcarriers en tubo de 1,5 mL que contiene el DNA plasmídico. Capa microcarriers con ADN plásmido según protocolos6 fabricante.
- En el paso final, cuando el microcarriers revestido de plásmido se suspenden en 48 μl 100% de etanol, pipeta 8 μL de microcarriers suspendido en cada una de cinco macrocarriers y deje al aire seco.
4. partícula bombardeo de granos de cebada Embryoless
- Configurar el aparato de bombardeo de partículas (véase Tabla de materiales)6.
- Montar en el instrumento y coloque un disco de ruptura de 1550 psi en la tapa de retención.
- Coloque una macrocarrier que contiene la combinación deseada de plásmido (junto con una pantalla de parada) en la Asamblea de lanzamiento de potencia. Inserte el montaje en la ranura superior de la cámara de bombardeo. Ajuste la distancia entre el disco de ruptura conserva la tapa y la tapa de macrocarrier a la distancia estándar (6 mm) y coloque el soporte de la pantalla de parada en la posición media (estándar), lo que permite un recorrido macrocarrier de 11 mm (figura 2A).
- Colocar 8 granos embryoless en un patrón radial apretado (con los extremos más delgados apuntando hacia dentro) en un círculo de papel de filtro que se graba hacia abajo del plano a la tapa de una caja de Petri 90 mm (ver figura 2B).
- Coloque el plato con los granos en la cámara de bombardeo, a una distancia de 6 cm de la pantalla de parada.
- Evacuar la cámara bombardeo a 95 kPa y luego bombardear la muestra.
- Después de lanzar el vacío, transferir los granos bombardeados a un etiquetado 60 mm placa de Petri que contiene 4 mL de solución bebiendo 1 mg/ml de cloranfenicol.
- Repita hasta que todos los bombardeos se han completado. Incubar a 24 ° C 24 horas (en una plataforma de agitación a 100 rpm).
5. extracción de la proteína Soluble de los granos bombardeados
- Con unas pinzas, quitar los 8 granos bombardeados de un plato de petri de 60 mm y borra los seca en una toalla de papel. Dividir los granos en dos tubos etiquetados 2,0 mL (4 granos por tubo), cada una con 800 μL tampón pulir (100 mM Na fosfato pH 7.2, 5 mM DTT, 10 μg/mL leupeptin, 20% de glicerol) y una tira de acero inoxidable de 5 mm. Repita este proceso para todos los granos bombardeados.
- Colocar tubos de 2.0 mL (hasta 48) en las dos parrillas del homogenizador de grano (véase Tabla de materiales). Montar los estantes en el homogenizador.
- Agitar las muestras en 30 Hz durante 3 minutos.
- Retire los soportes de homogeneizador de la homogeneizadora y coloque en hielo (5 min) para volver a enfriar las muestras.
- Instale los estantes en el homogenizador - en la orientación opuesta. Agitar nuevamente las muestras a 30 Hz durante 3 minutos.
- Enfriar las parrillas en el hielo, repita los pasos 5.3 a 5.5. Esto se suman un total de 12 minutos de agitación.
- Centrifugar los extractos de grano a 16.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
- Inmediatamente después de la centrifugación, decantar el sobrenadante claro en un segundo conjunto de tubos de microcentrífuga. Dar cada tubo vortex rápido. Almacenar los tubos en hielo.
- Después de transferir el sobrenadante, recuperar los granos de acero de los pellets para ser lavados y reutilizados.
6. medición de la actividad de luciferasa de extractos de grano de
- Para cada tubo del extracto de grano a ensayar, preparar un tubo de ensayo de vidrio 12 x 75 mm que contiene 200 μL de la mezcla de ensayo de luciferasa (45 mM Tris pH 7.7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1, 5 mM EDTA, luciferin de 1 mM, 1 mM ATP del sulfato).
- Añada 100 μL del extracto de grano primera al primer tubo de ensayo. Vórtice rápidamente para mezclar bien. Inmediatamente Coloque el tubo en el soporte del tubo de luminómetro y cierre la puerta. Una vez terminada la medición, retire el tubo del luminómetro, dejando la puerta abierta para la colocación del tubo siguiente.
- Repita este proceso hasta que todas las muestras han sido medidas.
7. medición de la actividad de GUS de extractos de grano de
- Añadir 200 μL de tampón de ensayo de GUS (50 mM Na fosfato, pH 7,2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 μg/mL leupeptin, metanol 20%, 0,02% de azida sódica) a cada pocillo de una placa bien 96.
- Depositar 50 μL de cada extracto de grano en el correspondiente bien. Después de agregar la mezcla con la punta. Selle la parte superior con la película.
- Incube la placa bien 96 a 37 ° C en la oscuridad durante 20 horas.
- Centrifugue la placa bien 96 a 4.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos y coloque en hielo.
- Añadir 250 μL de 0,2 M de Na2CO3 en cada pocillo de una placa bien negro 96.
- Añadir 6,25 μL de cada mezcla de ensayo centrifugado de GUS a los correspondientes (que contiene 0,2 M Na2CO3) pozo del negro 96 bien la placa. Después de agregar la mezcla con la punta. Son pozos con 6,25 μL de 10 μM, 40 μM y 100 μM 4-methylumbelliferone como estándares.
- Coloque la placa negra en un fluorómetro de placa y leer la fluorescencia de methylumbelliferone. Tomar las lecturas a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de la emisión de 460 nm. Establecer la ganancia del instrumento de forma que un bien que contienen 6.25 μL de 40 μM 4-methylumbelliferone y 250 μL de 0,2 M de Na2CO3 dan una lectura de 1000 unidades de fluorescencia.
8. Análisis de datos
- Introduzca los valores de los análisis de GUS y luciferasa en una hoja de cálculo. Excluir de consideración cualquier muestra con una lectura de luciferase de inferior a 20.000 luminiscencia relativa unidades s-1, esto indica que las construcciones de genes no fueron entregadas con éxito a las células de la aleurona.
- Para cada grano bombardeado con éxito extraer (representando a un grupo de cuatro granos embryoless), calcular la expresión de GUS normalizada de los datos brutos de GUS y luciferasa como sigue: normalizado GUS = [(expresión de GUS - GUS en blanco) x (2.000.000)] / (luciferase expresión-luciferasa en blanco).
Nota: Esto normaliza la cantidad de actividad de GUS lo hubiera observado en un bombardeo que dio una lectura de luciferase de 2.000.000. - Informe el nivel relativo de expresión de una construcción particular reportero en presencia de construcciones efectoras o tratamientos hormonales, siendo probados por comparación con el nivel de expresión en la ausencia de efectores o las hormonas.
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Representative Results
La técnica descrita aquí puede utilizarse para introducir cualquier prueba gen construcción en células de aleurona de granos de cebada. El nivel de expresión del gen de la prueba puede entonces ser medido convenientemente (figura 2). El protocolo de rendimiento más alto descrito aquí grandemente aumenta la eficiencia de la molienda de la semilla y pasos de análisis de enzima. Este método se ha utilizado para evaluar la capacidad del factor de transcripción TaABF15,6 para activar la expresión del gen inducida por ABA HVA17. En los resultados representativos presentados aquí, una construcción de reportero HVA1::GUS fue introducida en las células de aleurona junto con una construcción UBI::TaABF1 de efectoras (Figura 3A). Mientras que un TaABF1/ relaciónHVA1 de sólo 0.01 fue suficiente para causar una 3-fold inducción del gen reportero HVA1 en ausencia del ABA exógeno, niveles más altos de la construcción de TaABF1 dio lugar a la progresivamente mayor HVA1 expresión, de una manera dependiente de la dosis (figura 3BC).
Este protocolo experimental también puede incorporar el uso de hormonas u otros compuestos durante el período de incubación posterior bombardeo para evaluar el papel de las moléculas en la regulación de la expresión génica. Trabajos previos de otros investigadores ha sugerido la importancia de la fosfolipasa D en algunos aspectos de la señalización de la ABA. En concreto, el producto de la actividad de la fosfolipasa D, ácido fosfatídico, se ha implicado como un intermediario en algunas respuestas a ABA8,9. El hecho de que 1-butanol, un inhibidor de la fosfolipasa D (PLD), se ha demostrado para prevenir la expresión de genes inducidos por ABA en las células de aleurona sugiere que el PLD podría ser parte integral de la señalización de ABA en este tejido. El protocolo de bombardeo fue utilizado para probar si el 1-butanol puede inhibir la expresión HVA1 inducida por ABA o inducida por TaABF1. Como se esperaba, o ABA exógeno o TaABF1 podría fuertemente inducen la expresión de la construcción de reportero HVA1::GUS (figura 3). En cualquier caso, la presencia de 1-butanol inhibe fuertemente la inducción HVA1 . Esto sugiere que el PLD podría jugar un papel importante en la activación de la expresión de genes HVA1 por ABA, a través de TaABF1.
Además de su papel en el desarrollo y germinación de granos, ABA también es fundamental para regular la apertura estomática en hojas. En las células del protector de estomas, se estimula la producción de ácido fosfatídico por óxido nítrico (NO), que a su vez es inducida por el peróxido de hidrógeno (H2O2). Para algunas respuestas, n y H2O2 se puede sustituir por ABA9. Para determinar si éste es también el caso en las células de la aleurona, el protocolo de bombardeo fue utilizado para probar si el NO donante nitroprusiato de sodio (SNP) o H2O2 podría sustituir para el ABA en la inhibición de la expresión de la inducida por GA Amy32b gen. Mientras ABA podría inhibir fuertemente la expresión inducida por GA para el reportero de Amy32b::GUS construir, H2O2 ni SNP causó una reducción significativa (figura 3D). Estos resultados, por lo tanto, no apoyan un papel para NO y H2O2 en las respuestas de la célula ABA de aleurona.
Figura 1 : Hoja de cálculo para un experimento de bombardeo típico. Se indica la cantidad de cada preparación de plásmido para ser colocado en el tubo de cada bombardeo. En este experimento, se utilizaron cuatro tiros (8 cereales) para cada tratamiento para dar un total de ocho muestras posibles (4 granos) para cada tratamiento. Para mantener la misma concentración total de ADN en cada bombardeo, un plásmido efector "simulado" fue utilizado para sustituir el plásmido de efector UBI::TaBF1 en algunos casos. El tratamiento A es un bombardeo "en blanco" para establecer el nivel de fondo de la actividad de GUS y luciferasa en las células de la aleurona. Los resultados del experimento de bombardeo descritos en esta hoja de cálculo se muestran en la figura 3B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Diagrama del protocolo. (A) diagrama esquemático del dispositivo de bombardeo. (B) las partículas de oro recubiertas con una construcción de reportero con el promotor a probarse, una unidad de efectos (si es necesario) y un control interno (UBI::luciferase) se introducen en las células de aleurona de cebada por el bombardeo de partículas. Después de la incubación (generalmente de 24 h), los granos se muelen y ensayaron para la actividad de GUS y actividad de luciferasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Reglamento de promotores HVA1 y Amy32b TaABF1, ABA y potenciales mediadores de señalización ABA. (A) periodista y efectoras construcciones utilizadas en los experimentos. (B) la construcción del generador de efectos UBI::TaABF1 Co fue bombardeada en las células de la aleurona con el reportero HVA1::GUS y la estructura de control interno (UBI::luciferase). La cantidad de UBI::TaABF1 efector (en relación con el reportero HVA1::GUS ) varió de 0 a 0.1, tal como se indica debajo de las barras. Actividades de GUS y luciferasa fueron medidas después de 24 h de incubación. Datos mostrados son los medios (± SE) de 6-8 repeticiones biológicas. (C) el reportero HVA1::GUS Co fue bombardeado en las células de la aleurona con el constructo de control interno (UBI::luciferase) en la presencia o ausencia de la construcción del generador de efectos UBI::TaABF1. La cantidad de TaABF1 efector (en relación con el reportero) fue de 1.0. Actividades de GUS y luciferasa fueron medidas después de 24 h de incubación con o sin ABA μm 20 y % de 0.4 1-butanol. (D) el reportero Amy32b::GUS fue bombardeado conjuntamente en las células de la aleurona con el constructo de control interno (UBI::luciferase). Actividades de GUS y luciferasa fueron medidas después de 24 h de incubación en presencia de 1 mM GA con o sin ABA de 20 μm, 1 mM H2O2o 100 μm de nitroprusiato de sodio (SNP). Valores de actividad de GUS están en relación con la expresión de la periodista Amy32b::GUS en ausencia de Georgia por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La introducción del gen efector construye mediante bombardeo de partículas, seguida de la expresión transitoria de construcciones de reportero es una estrategia valiosa para el papel de los actores particulares en la señalización de ABA/GA y en el gen de la hormona regulada resultante de la disección expresión.
Sin embargo, los protocolos existentes para llevar a cabo tales experimentos en cebada aleurona células2,3,4,5,6 son muy laborioso. Cada grupo de bombardeo apenas granos deben ser homogeneizada en un mortero de mano, y los extractos resultantes se analizan individualmente actividad GUS y luciferasa. Los protocolos actuales, por tanto, limitan el número de tratamientos separados que pueden incluirse en el mismo experimento y restringir el número de réplicas biológicas que pueden razonablemente ser incluidos para cada tratamiento. Estas limitaciones hacen más difícil para llevar a cabo comparaciones completa y simultáneas entre varios tratamientos. Tales comparaciones pueden ser especialmente difíciles si la diferencia en la expresión génica entre los tratamientos es modesta y un número relativamente grande de réplicas biológicas es necesario para establecer la significación estadística.
Un protocolo optimizado se presenta aquí que automatiza parcialmente la preparación del extracto de grano y GUS ensayos para permitir el rendimiento substancialmente más alto. Esta nueva versión de las marcas de protocolo es factible incluir un mucho mayor número total de muestras en un experimento, lo que permite tanto la inclusión de los más diferentes tratamientos por experimento y más repeticiones para cada tratamiento. Para la preparación de extractos de grano después de bombardeo y de incubación, hemos sustituido un protocolo pulido en gran parte automatizado que utiliza un homogenizador de grano que puede procesar 48 muestras al mismo tiempo (en unos 20 minutos). Así, el investigador solo puede preparar proteína soluble extractos de casi 200 muestras en menos tiempo que un equipo de cuatro investigadores que moler 100 muestras. El ensayo de GUS modificado, llevado a cabo en 96 placas de pozos, también requiere mucho menos trabajo que el protocolo original que tubo individual de ensayos.
En la preparación de las mezclas de plásmido para el bombardeo (paso 3.1), es posible utilizar un generador de efectos al cociente de reportero de 1.0, especialmente para las pruebas preliminares determinar si un determinado efector tiene ningún efecto en absoluto. Sin embargo, debido a la fuerza del promotor ubiquitina de maíz (UBI), un fuerte efecto a menudo se observan con proporciones mucho menores, como se ve en la figura 2B y en informes previamente publicados4,5,6. Otros pasos críticos en este protocolo incluyen peeling de la testa de los granos de cebada y el uso de la configuración definida cuidadosamente en el aparato de bombardeo. Si no se retiran completamente las capas de semilla, se prevendrán microcarriers oro entren en las células de aleurona abrazadas. Entrega exitosa de microcarriers oro en las células de la aleurona es también muy dependiente en el tipo de disco de ruptura utilizado, la posición de la tapa de potencia, pantalla parada y tejido a ser bombardeado. Las condiciones aquí registrados típicamente resultado en la entrega exitosa de las construcciones de genes (ver paso 8.1) a un alto porcentaje (≥70%) de muestras de grano de cebada bombardeado. Es de esperar que otros materiales biológicos requieren diferentes condiciones para la entrega óptima de gene.
Aunque no se describe aquí, es posible optimizar aún más el procedimiento mediante la realización de los ensayos de luciferase flash en 96 placas bien. Sin embargo, como la producción de luz de luciferase debe ser medida con un luminómetro inmediatamente después de mezclar Extracto de la proteína con el sustrato (luciferin), esto requeriría la utilización de un luminómetro flash de la placa con los inyectores, un instrumento que es mucho más caro que un solo tubo luminómetro.
Los representativos reportados aquí confirman que el factor de transcripción TaABF1 puede activar HVA1 expresión en ausencia de ABA exógeno5,6. Activación de HVA1 TaABF1 o ABA exógeno fue prevenida por el PLD inhibidor 1-butanol, sugiriendo que la producción de ácido fosfatídico por PLD puede ser requerido para la activación de la HVA1 . Estos resultados para HVA1 regulación por TaABF1 y ABA son similares a los obtenidos por Zou et al. 10 para la activación de HVA22 por el factor de transcripción LtWRKY21 y ABA. El hallazgo de que H2O2 o SNP no sustituya para ABA exógeno en la supresión de la expresión de aleurona de Amy32b, confirma que algunos aspectos de la señalización de ABA en granos de cereales son distintas de lo que ocurre en las células de guardia estomáticos. El hallazgo que el H2O2 no no downregulate Amy32b expresión es coherente con los resultados observados por Ishibashi et al. 11 para la actividad de la enzima amilasa.
El protocolo de mayor rendimiento ahora se está utilizando para llevar a cabo un estudio exhaustivo de los efectos de la fosforilación TaABF1 en su capacidad para regular la expresión del gen aguas abajo. Como otros miembros de la ABF familia de factores de transcripción puede ser phosphorylated en un número de diferentes sitios12,13,14,15,16, múltiple fosforilación putativa sitios de TaABF1 que deba probarse. El rendimiento más alto permitido por este protocolo permitirá que un gran número de versiones mutantes de TaABF1 (con potencialmente phosphorylatable serina y treonina residuos modificados) para ser interrogado, cada uno con un gran número de biológicos Replica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Greyson Butler y Margaret Barrett para ayuda en la realización de los experimentos, Judy Stone para asesoramiento sobre homogeneización de grano y Lynn Hannum para asesoramiento en análisis de fluorescencia. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (IOB 0443676), por una concesión de desarrollo institucional (IDeA) desde el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud, bajo la concesión número P20GM0103423 y por las subvenciones de la división del Colby College de Ciencias naturales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
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