Summary
एक बेहतर प्रोटोकॉल रिपोर्टर से क्षणिक जीन अभिव्यक्ति की माप के लिए प्रस्तुत किया जाता है कण बमबारी के बाद जौ aleurone कोशिकाओं में constructs । स्वचालित के साथ पीस अनाज का संयोजन 96-अच्छी तरह से प्लेट एंजाइम परख प्रक्रिया के लिए उच्च प्रवाह प्रदान करता है ।
Abstract
जौ अनाज की aleurone परत पौधों में हार्मोन विनियमित जीन अभिव्यक्ति के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है । aleurone कोशिकाओं में, अंकुरण या जल्दी अंकुर विकास के लिए आवश्यक जीन gibberellin (GA) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, जबकि तनाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीन abscisic एसिड (आबा) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । GA और आबा संकेतन के तंत्र कण बमबारी के माध्यम से aleurone कोशिकाओं में रिपोर्टर जीन का निर्माण शुरू करने से पूछताछ की जा सकती है, जिसके परिणामस्वरूप क्षणिक अभिव्यक्ति एंजाइम परख का उपयोग कर मापा के साथ । एक बेहतर प्रोटोकॉल की सूचना दी है कि आंशिक रूप से स्वचालित रूप से और अनाज homogenization कदम और एंजाइम परख को कारगर बनाने, मौजूदा तरीकों से काफी अधिक प्रवाह की अनुमति । अनाज के नमूनों की Homogenization एक स्वचालित ऊतक homogenizer का उपयोग कर बाहर किया जाता है, और गस (β-glucuronidase) परख एक 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रणाली का उपयोग कर बाहर किया जाता है । प्रतिनिधि प्रोटोकॉल का उपयोग कर परिणाम सुझाव है कि phospholipase डी गतिविधि आबा द्वारा, प्रतिलेखन कारक TaABF1 के माध्यम से HVA1 जीन अभिव्यक्ति के सक्रियकरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है ।
Introduction
जौ aleurone परत हार्मोन के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल प्रणाली है-पौधों में जीन अभिव्यक्ति विनियमित1। विशेष रूप से, अंकुरण या जल्दी अंकुर विकास के लिए आवश्यक जीन की एक संख्या gibberellin (GA) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, जबकि तनाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीन abscisic एसिड (आबा) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । ga और आबा सिग्नलिंग मार्ग intertwined हैं, कुछ ga-सक्रिय जीनों की अभिव्यक्ति के रूप में आबा द्वारा हिचकी है, और प्रतिकूल1।
GA/आबा संकेतन में विशेष अभिनेताओं की भूमिका को समझने के लिए एक मूल्यवान रणनीति कण बमबारी के माध्यम से प्रभाव जीन constructs का परिचय दिया गया है, रिपोर्टर के क्षणिक अभिव्यक्ति के बाद constructs कि जिसके परिणामस्वरूप प्रभाव की अनुमति बहाव जीन अभिव्यक्ति निर्धारित किया जाना है । ऐसे गस (β-glucuronidase) या Luciferase के रूप में रिपोर्टर जीन का उपयोग विशेष रूप से कोशिकाओं है कि प्रभाव का निर्माण प्राप्त है भीतर जीन अभिव्यक्ति के संवेदनशील और मात्रात्मक माप की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, एक प्रभाव की शुरूआत एक प्रतिलेखन कारक एंकोडिंग का निर्माण TaABF15,6 स्थापित है कि HVA1 जैसे आबा-प्रेरित जीन TaABF1 द्वारा प्रेरित कर रहे हैं, जबकि GA प्रेरित जीन जैसे Amy32b दमित हैं । एक प्रयोगात्मक रणनीति के रूप में कण बमबारी GA/आबा संकेतन के विविध पहलुओं की जांच करने के लिए कई प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है । इस तरह के काम दोनों GA-प्रेरित2 और आबा-प्रेरित जीन3के सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण प्रमोटर तत्वों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है, और प्रोटीन kinases की खोज करने के लिए4 और प्रतिलेखन कारकों5 कि विनियमित इन जीनों की अभिव्यक्ति ।
मौजूदा प्रोटोकॉल2,3,4,5,6 कण बमबारी और क्षणिक जीन अभिव्यक्ति के बाद के माप के लिए काफी परिश्रम गहन हैं, बमबारी के प्रत्येक सेट के रूप में बमुश्किल अनाज एक मोर्टार और मूसल में हाथ से homogenized है और एंजाइम परख व्यक्तिगत रूप से किया जाता है । इस पांडुलिपि एक बेहतर प्रोटोकॉल है कि आंशिक रूप से स्वचालित बनाता है और homogenization कदम और गस परख को कारगर बनाने के लिए काफी अधिक प्रवाह की अनुमति रिपोर्ट, उपचार की एक बड़ी संख्या में अनुमति के लिए एक ही प्रयोग में परीक्षण किया है, और/ अधिक सांख्यिकीय मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक उपचार के लिए अधिक प्रतिकृति का समावेश । प्रतिनिधि परिणाम HVA1 और Amy32b रिपोर्टर का निर्माण, प्रतिलेखन कारक TaABF1 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से GA, आबा, और अंय विनियामक अणुओं द्वारा विनियमित की अभिव्यक्ति के लिए दिखाए जाते हैं ।
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Protocol
1. प्रभाव और रिपोर्टर जीन construction की तैयारी
- बिल्ड इफेक्टर का निर्माण करता है कि एक वांछित खुले पढ़ने के फ्रेम से अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए एक गठित प्रवर्तक (जैसे मक्का ubiquitin, यूबीआई) को रोजगार. उदाहरण के लिए, TaABF15की सशक्त गठित अभिव्यक्ति को चलाने के लिए यूबीआई:: TaABF1 युक्त प्लाज्मिड का निर्माण करें ।
- बिल्ड रिपोर्टर उस प्रवर्तक को शामिल करता है, जिसकी गतिविधि को मापा जाना है, जैसे कि गसके रूप में एक खुला पठन फ़्रेम के ऊपर रखा गया है । उदाहरण के लिए, एक HVA1 युक्त प्लाज्मिड का निर्माण :: गस HVA1 प्रमोटर से अभिव्यक्ति को मापने के लिए2,5।
- निर्माण एक आंतरिक नियंत्रण निर्माण (जैसे यूबीआई::luciferase) ।
- एक सिलिका बाइंडिंग स्तंभ प्रोटोकॉल का उपयोग करना ( सामग्री की तालिकादेखें), प्रत्येक आवश्यक जीन के निर्माण के लिए उच्च-गुणवत्ता वाले प्लाज्मिड तैयार करें । पराबैंगनी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें), ध्यान से प्रत्येक प्लाज्मिड तैयारी की एकाग्रता को मापने ।
2. बमबारी के लिए जौ अनाज की तैयारी
- एक स्प्रेडशीट सेट करें (एक उदाहरण के लिए चित्र 1 देखें) plasmids है कि बमबारी हो जाएगा संकेत, उचित हार्मोन उपचार, और प्रत्येक उपचार है कि प्रयोग का हिस्सा होगा के लिए अन्य प्रासंगिक जानकारी.
- एक काटने बोर्ड और एक बाँझ उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, हिमालय जौ के अनाज से भ्रूण काट (प्रत्येक उपचार के लिए 40 प्रयोग में शामिल) । रंग फीका या औसत से काफी छोटा है कि अनाज को छोड़ दें ।
- एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सभी भ्रूण अनाज प्लेस । 10 मिनट के लिए पानी और रॉक के 40 मिलीलीटर जोड़ें ।
- पानी को ध्यान से डालो (अनाज खोने से बचने के लिए) और 10% ब्लीच के 40 मिलीलीटर जोड़ें । 20 मिनट के लिए रॉक ।
- ब्लीच बाहर डालो और बाँझ पानी की 40 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए रॉक । इस बाँझ पानी को चार बार धोकर दोहराएं ।
- Imbibing समाधान के 40 मिलीलीटर जोड़ें (20 मिमी सोडियम succinate, 20 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, पीएच 5.0) और क्लॉरॅंफेनिकोल स्टॉक समाधान के 40 μL (10 मिलीग्राम/एमएल) ।
- एक Vermiculite प्लेट में ट्यूब से (क्लॉरॅंफेनिकोल के साथ) Imbibing समाधान के अधिकांश हस्तांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें). फिर अनाज को Vermiculite प्लेट में गीले फिल्टर पेपर की सतह पर ट्रांसफर कर दीजिये । बाहर अनाज समान रूप से फैला । अनाज को आंशिक रूप से रखने के लिए पर्याप्त imbibing समाधान में डालना (लेकिन पूरी तरह से नहीं) जलमग्न. ढक्कन को Vermiculite प्लेट के ऊपर रखें ।
- फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ के बारे में 48 एच के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण अनाज मशीन । अतिरिक्त Imbibing समाधान आवश्यक के रूप में जोड़ें ।
- एक 90 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश खोलें और Imbibing समाधान के पकवान ही में 20 मिलीलीटर और उल्टे ढक्कन में 20 मिलीलीटर डालना । प्रत्येक को क्लॉरॅंफेनिकोल (10 मिलीग्राम/एमएल) के 20 μL जोड़ें । उन्हें शराब में सूई देकर फाइन पॉइंट संदंश के दो जोड़े निष्फल करते हैं ।
- पेट्री डिश के ढक्कन में एक भ्रूण अनाज की कुछ जगह है । संदंश का प्रयोग, धीरे से प्रत्येक अनाज से (पारदर्शी) बीज कोट निकालें । जबकि अनाज के चिकनी ओर से बीज कोट को हटाने, अंतर्निहित (aleurone) कोशिकाओं को नुकसान नहीं है । Imbibing समाधान युक्त पेट्री डिश के लिए छिलके वाले अनाज को हस्तांतरित करें ।
- सभी अनाजों से बीज कोट छीलने के बाद, उन्हें Vermiculite प्लेट में लौटा दें । 16-20 घंटे के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर खुली हुई भ्रूण अनाज की मशीन ।
- बस बमबारी के लिए अनाज का उपयोग करने से पहले, उंहें एक पेट्री डिश में फिल्टर कागज के बीच मिलाकर सतह नमी को दूर ।
3. बमबारी के लिए प्लाज्मिड डीएनए की तैयारी
- प्रत्येक उपचार है कि बमबारी प्रयोग में शामिल किया जाएगा के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब लेबल । प्रत्येक ट्यूब के लिए यूबीआईकी 2.5 µ g जोड़ने के लिए::luciferase आंतरिक नियंत्रण प्लाज्मिड, एक गस रिपोर्टर प्लाज्मिड के 2.5 µ जी, और वांछित राशि (आमतौर पर ०.०२५ µ जी को 2.5 µ g) के एक प्रभाव प्लाज्मिड । कुल मात्रा को 5 µ में लाने के लिए पानी डालें l
- तैयार 1.6 µm गोल्ड microcarriers ( सामग्री की तालिकादेखें) के बाद प्रकाशित प्रोटोकॉल6।
- प्रत्येक उपचार के लिए, प्लाज्मिड डीएनए युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में निलंबित microcarriers के 50 µ एल जोड़ें । कोट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्लाज्मिड डीएनए के साथ microcarriers6।
- अंतिम चरण में, जब प्लाज्मिड-लेपित microcarriers 48 µ एल में निलंबित कर दिया 100% इथेनॉल, पांच μL में से प्रत्येक पर निलंबित microcarriers के प्लास्टिक 8 macrocarriers और उंहें शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं ।
4. भ्रूण के कण बमबारी जौ अनाज
- कण बमबारी उपकरण सेट अप ( सामग्री की तालिकादेखें)6।
- बनाए रखने की टोपी में एक 1550 साई टूटना डिस्क प्लेस और साधन पर यह माउंट ।
- एक वांछित प्लाज्मिड संयोजन युक्त macrocarrier प्लेस (एक साथ एक रोक स्क्रीन के साथ) microcarrier प्रक्षेपण विधानसभा में । बमबारी चैंबर के शीर्ष स्लॉट में विधानसभा डालें । टूटना डिस्क टोपी बनाए रखने और मानक दूरी (6 मिमी) पर macrocarrier कवर ढक्कन के बीच की दूरी निर्धारित करें, और (मानक) मध्य स्थिति पर रोक स्क्रीन समर्थन जगह, 11 मिमी (चित्रा 2a) की एक macrocarrier यात्रा की दूरी की अनुमति.
- एक तंग रेडियल पैटर्न में एक फिल्टर कागज सर्कल कि एक 90 mm पेट्री डिश के ढक्कन के लिए फ्लैट नीचे टेप है पर (के साथ पतले सिरों की ओर इशारा करते हुए) के साथ 8 भ्रूण अनाज की व्यवस्था ( चित्रा 2 बीदेखें).
- बौछार कक्ष में अनाज के साथ पकवान प्लेस, रोक स्क्रीन से 6 सेमी की दूरी पर ।
- 95 केपीए को बमबारी चैंबर खाली और फिर नमूने बौछार ।
- वैक्यूम जारी करने के बाद, एक लेबल 60 मिमी पेट्री पकवान Imbibing समाधान के 4 मिलीलीटर युक्त के लिए बमबारी अनाज हस्तांतरण 1 मिलीग्राम/क्लॉरॅंफेनिकोल के एमएल ।
- बमबारी के सभी पूरा कर लिया गया है जब तक दोहराएँ. 24 घंटे के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर (100 rpm पर एक मिलाते हुए मंच पर) मशीन ।
5. बमबारी अनाज से घुलनशील प्रोटीन का निष्कर्षण
- संदंश का प्रयोग, एक 60 मिमी पेट्री पकवान से 8 बमबारी अनाज हटा दें और उंहें एक कागज तौलिया पर सूखे दाग । दो लेबल 2.0 मिलीलीटर ट्यूबों में अनाज विभाजित (ट्यूब प्रति 4 अनाज) एक युक्त 800 μL पीस बफर (100 मिमी न फॉस्फेट पीएच 7.2, 5 मिमी डीटीटी, 10 µ जी/एमएल leupeptin, 20% ग्लिसरॉल) और एक 5 मिमी स्टेनलेस स्टील मनका । बमबारी अनाज के सभी के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ ।
- प्लेस (48 तक) 2.0 मिलीलीटर ट्यूब मनका homogenizer के दो रैक में ( सामग्री की तालिकादेखें). homogenizer पर रैक माउंट ।
- 3 मिनट के लिए 30 हर्ट्ज पर नमूने शेक.
- homogenizer से homogenizer रैक निकालें और उंहें बर्फ पर जगह (5 मिनट) को फिर से ठंडा करने के नमूने ।
- माउंट homogenizer पर वापस रैक-विपरीत अभिविंयास में । 3 मिनट के लिए 30 हर्ट्ज पर फिर नमूने शेक.
- बर्फ पर रैक ठंडा है, तो चरण 5.3 से 5.5 दोहराएं । यह मिलाते हुए 12 मिनट की कुल करने के लिए जोड़ देगा ।
- 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर अनाज निष्कर्षों को केंद्रापसारक ।
- तुरंत केंद्रापसारक के बाद, microcentrifuge ट्यूबों के एक दूसरे सेट में supernatants स्पष्ट नहीं कर सकते । प्रत्येक ट्यूब एक त्वरित भंवर दे । बर्फ पर ट्यूबों की दुकान ।
- supernatant स्थानांतरित करने के बाद, छर्रों से इस्पात मोतियों की वसूली ताकि वे धोया जा सकता है और पुनः प्रयोग किया ।
6. अनाज के अर्क से Luciferase गतिविधि का मापन
- अनाज निकालने के प्रत्येक ट्यूब के लिए परख हो, एक 12 मिमी x 75 मिमी ग्लास टेस्ट Luciferase परख मिश्रण के 200 μL युक्त ट्यूब (45 मिमी Tris सल्फेट पीएच 7.7, 15 मिमी MgCl2, 20 मिमी डीटीटी, 1.5 मिमी EDTA, 1 मिमी luciferin, 1 मिमी एटीपी तैयार) ।
- पहली परख ट्यूब करने के लिए पहली अनाज निकालने के 100 μL जोड़ें । भंवर जल्दी से अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । तुरंत luminometer के ट्यूब होल्डर में ट्यूब लगाएं और दरवाजा बंद कर दें । जब माप समाप्त हो गया है, luminometer से ट्यूब को दूर-अगले ट्यूब के स्थान के लिए दरवाजा खुला छोड़ने.
- इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक सभी नमूने मापी नहीं गए ।
7. अनाज के अर्क से गस गतिविधि का मापन
- गस परख बफर के 200 μL जोड़ें (50 मिमी न फॉस्फेट पीएच 7.2, 2.5 मिमी 4-methylumbelliferyl--डी-glucuronide, 10 मिमी डीटीटी, 2 मिमी EDTA, 10 µ जी/एमएल leupeptin, 20% मेथनॉल, 0.02% सोडियम azide) एक अच्छी तरह से एक 96 अच्छी प्लेट के लिए ।
- प्लेस प्रत्येक अनाज के 50 μL में इसी तरह निकालने । जोड़ने के बाद टिप के साथ मिश्रण । फिल्म सील के साथ शीर्ष सील ।
- 20 घंटे के लिए अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से थाली मशीन ।
- 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 x जी में 96 अच्छी तरह से थाली और बर्फ पर जगह ।
- एक काले 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए 0.2 एम ना2CO3 के 250 μL जोड़ें ।
- इसी वेल में प्रत्येक केंद्रापसारक गस परख मिश्रण के 6.25 μL जोड़ें (0.2 एम ना2CO3) काले 96 अच्छी तरह से थाली से युक्त । जोड़ने के बाद टिप के साथ मिश्रण । 10 माइक्रोन, 40 माइक्रोन, और 100 माइक्रोन 4-methylumbelliferone के 6.25 μL के साथ कुओं को मानकों के रूप में शामिल करें ।
- काली प्लेट को एक प्लेट fluorometer में रखें और methylumbelliferone की प्रतिदीप्ति पढ़ें । 360 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर रीडिंग ले लो, और 460 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य । इस तरह के साधन का लाभ निर्धारित करें कि एक अच्छी तरह से युक्त 6.25 μL 40 माइक्रोन 4-methylumbelliferone और 250 μL के 0.2 M ना2CO3 1000 प्रतिदीप्ति इकाइयों के पढ़ने देता है ।
8. डेटा विश्लेषण
- एक स्प्रेडशीट में luciferase और गस परख के लिए मान दर्ज करें । विचार से कम 20,000 रिश्तेदार luminescence इकाइयों के एक luciferase पढ़ने के साथ किसी भी नमूने से बाहर निकलें एस-1, के रूप में यह इंगित करता है कि जीन निर्माण सफलतापूर्वक aleurone कोशिकाओं को वितरित नहीं किया गया ।
- प्रत्येक सफलतापूर्वक बमबारी अनाज निकालने के लिए (चार भ्रूण अनाज के एक समूह का प्रतिनिधित्व), कच्चे गस और luciferase डेटा से सामान्यीकृत गस अभिव्यक्ति की गणना के रूप में इस प्रकार है: सामान्यीकृत गस = [(गस अभिव्यक्ति-गस रिक्त) x (२,०००,०००)]/(luciferase अभिव्यक्ति – luciferase blank).
नोट: यह गस गतिविधि की राशि क्या एक बमबारी है कि २,०००,००० की एक luciferase पढ़ने दिया में देखा गया होगा सामांय । - प्रभाव या हार्मोन के अभाव में अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना द्वारा परीक्षण किया जा रहा है एक विशेष रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के रिश्तेदार के स्तर की रिपोर्ट के लिए प्रभावी निर्माण या हार्मोन उपचार का निर्माण ।
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Representative Results
तकनीक यहां वर्णित किसी भी परीक्षण जीन जौ अनाज की aleurone कोशिकाओं में निर्माण शुरू किया जा सकता है । परीक्षण जीन से अभिव्यक्ति का स्तर तो आसानी से मापा जा सकता है (चित्रा 2). उच्च प्रवाह प्रोटोकॉल यहां वर्णित बहुत बीज पीसने और एंजाइम परख कदम की क्षमता बढ़ जाती है । इस विधि में आबा-प्रेरित जीन HVA17की अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए प्रतिलेखन कारक TaABF15,6 की क्षमता का आंकलन किया गया है । प्रतिनिधि यहां प्रस्तुत परिणामों में, एक HVA1:: गस रिपोर्टर निर्माण aleurone कोशिकाओं में एक साथ एक यूबीआई:: TaABF1 प्रभाव निर्माण (चित्रा 3) के साथ शुरू किया गया था । जबकि सिर्फ 0.01 का एक TaABF1/HVA1 अनुपात पर्याप्त था exogenous आबा के अभाव में 3 गुना प्रेरण HVA1 रिपोर्टर जीन के कारण, TaABF1 के उच्च स्तर का निर्माण उत्तरोत्तर अधिक से अधिक HVA1 अभिव्यक्ति, एक खुराक पर निर्भर तरीके से (चित्र बी, सी).
इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल भी हार्मोन या बाद बमबारी के दौरान अंय यौगिकों के उपयोग को शामिल कर सकते है के लिए जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में उन अणुओं की भूमिका का आकलन अवधि । अंय जांचकर्ताओं द्वारा पिछले काम आबा संकेतन के कुछ पहलुओं में phospholipase डी के महत्व का सुझाव दिया है । विशेष रूप से, phospholipase डी गतिविधि के उत्पाद, phosphatidic एसिड, आबा8,9के लिए कुछ प्रतिक्रियाओं में एक मध्यवर्ती के रूप में फंसाया गया है. तथ्य यह है कि 1-ब्यूटानॉल, phospholipase डी (PLD) के एक अवरोधक, aleurone कोशिकाओं में आबा-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति को रोकने के लिए दिखाया गया है कि PLD इस ऊतक में आबा संकेतन का एक अभिन्न हिस्सा हो सकता है पता चलता है. बमबारी प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया गया था कि क्या 1-ब्यूटानॉल या तो आबा-प्रेरित या TaABF1-प्रेरित HVA1 अभिव्यक्ति को बाधित कर सकता है । जैसा कि उंमीद थी, या तो exogenous आबा या TaABF1 दृढ़ता से HVA1:: गस रिपोर्टर का निर्माण (चित्र 3सी) की अभिव्यक्ति पैदा कर सकता है । या तो मामले में, 1-ब्यूटानॉल की उपस्थिति दृढ़ता से HVA1 प्रेरण बाधा । यह पता चलता है कि PLD आबा द्वारा, TaABF1 के माध्यम से HVA1 जीन अभिव्यक्ति के सक्रियकरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है ।
अनाज के विकास और अंकुरण में अपनी भूमिका के अलावा, आबा भी पत्तियों में stomatal एपर्चर को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण है । stomata के रक्षक कोशिकाओं में, phosphatidic एसिड का उत्पादन नाइट्रिक ऑक्साइड (नहीं), जो हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) द्वारा प्रेरित बारी में है द्वारा उत्तेजित है । कुछ प्रतिक्रियाओं के लिए, नहीं और एच2हे2 आबा9के लिए विकल्प कर सकते हैं । यह निर्धारित करने के लिए कि क्या यह भी aleurone कोशिकाओं में मामला है, बमबारी प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि क्या कोई दाता सोडियम nitroprusside (SNP) या एच2ओ2 की अभिव्यक्ति बाधा में आबा के लिए विकल्प सकता है GA-प्रेरित Amy32b जीन. जबकि आबा जोरदार Amy32b के लिए GA प्रेरित अभिव्यक्ति को बाधित कर सकता है :: गस पत्रकार का निर्माण, न तो एच2ओ2 और न ही SNP किसी भी महत्वपूर्ण कमी (चित्रा 3 डी) का कारण बना । ये परिणाम, इसलिए, aleurone कक्ष आबा प्रतिसाद में कोई और H 2 O2 के लिए कोई भूमिका का समर्थन नहीं करते ।
चित्र 1 : एक ठेठ बमबारी प्रयोग के लिए स्प्रेडशीट । प्रत्येक बमबारी के लिए ट्यूब में रखी जाने वाली प्रत्येक प्लाज्मिड तैयारी की मात्रा दर्शाई गई है. इस प्रयोग में, चार शॉट्स (8 अनाज प्रत्येक) प्रत्येक उपचार के लिए आठ संभव नमूनों की कुल देने के लिए इस्तेमाल किया गया (4 अनाज प्रत्येक) प्रत्येक उपचार के लिए । आदेश में प्रत्येक बमबारी में एक ही कुल डीएनए एकाग्रता बनाए रखने के लिए, एक "डमी" प्रभाव प्लाज्मिड यूबीआई:: TaBF1 प्रभाव प्लाज्मिड कुछ मामलों में के लिए विकल्प के लिए इस्तेमाल किया गया था । उपचार एक एक "खाली" बमबारी को aleurone कोशिकाओं में गस और luciferase गतिविधि की पृष्ठभूमि स्तर की स्थापना है । इस स्प्रेडशीट में उल्लिखित बमबारी प्रयोग के परिणाम चित्र बीमें दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : प्रोटोकॉल का आरेख. (क) बमबारी डिवाइस की योजनाबद्ध । (ख) सोने के एक संवाददाता प्रमोटर ले जाने का निर्माण करने के लिए परीक्षण के साथ लेपित कणों, एक प्रभाव (यदि आवश्यक हो), और एक आंतरिक नियंत्रण (यूबीआई:: luciferase) कण बमबारी से जौ aleurone कोशिकाओं में पेश कर रहे हैं । (आमतौर पर 24 घंटे के लिए) मशीन के बाद, अनाज जमीन और दोनों गस गतिविधि और luciferase गतिविधि के लिए परख रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : TaABF1, आबा, और आबा सिग्नलिंग के संभावित मध्यस्थों द्वारा HVA1 और Amy32b प्रवर्तकों का विनियमन. (क) रिपोर्टर और प्रभाव के प्रयोगों में इस्तेमाल किया constructs. (ख) प्रभाव यूबीआई:: TaABF1 HVA1:: गस रिपोर्टर और आंतरिक नियंत्रण का निर्माण (यूबीआई:: luciferase) के साथ aleurone कोशिकाओं में सह बमबारी थी । यूबीआई की राशि :: TaABF1 प्रभाव ( HVA1:: गस रिपोर्टर) के सापेक्ष 0 से 0.1, के रूप में सलाखों के नीचे संकेत दिया । गस और luciferase गतिविधियों की मशीन के 24 ज के बाद मापा गया । दिखाया डेटा का मतलब है (± एसई) 6-8 जैविक प्रतिकृति । (ग) HVA1:: गस रिपोर्टर का निर्माण आंतरिक नियंत्रण के साथ aleurone कोशिकाओं में बौछार सह था (यूबीआई:: luciferase) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में प्रभाव यूबीआई का निर्माण :: TaABF1। TaABF1 प्रभाव की राशि (रिपोर्टर के सापेक्ष) 1.0 था । गस और luciferase गतिविधियों के साथ या 20 µ एम आबा और 0.4% 1-ब्यूटानॉल के बिना मशीन के 24 ज के बाद मापा गया । (घ) Amy32b:: गस संवाददाता आंतरिक नियंत्रण निर्माण (यूबीआई:: luciferase) के साथ aleurone कोशिकाओं में बौछार सह था । गस और luciferase गतिविधियों 1 मिमी GA के साथ या 20 µ एम आबा, 1 मिमी एच2ओ2, या 100 µ एम सोडियम nitroprusside (SNP) के बिना की उपस्थिति में गर्मी के 24 घंटे के बाद मापा गया । गस गतिविधि के लिए मान Amy32b की अभिव्यक्ति के सापेक्ष होते हैं :: गस रिपोर्ट GA के अभाव में इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
प्रभाव जीन का परिचय कण बमबारी के माध्यम से constructs, रिपोर्टर के क्षणिक अभिव्यक्ति के बाद constructs GA/में विशेष अभिनेताओं की भूमिका को विच्छेदन के लिए एक बहुमूल्य रणनीति है संकेतन और परिणामस्वरूप हार्मोन विनियमित जीन में अभिव्यक्ति.
हालांकि, जौ aleurone कोशिकाओं2,3,4,5,6 में ऐसे प्रयोगों को ले जाने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल बहुत गहन श्रम कर रहे हैं । बमबारी के प्रत्येक समूह बमुश्किल अनाज एक मोर्टार और मूसल में हाथ homogenized होना चाहिए, और जिसके परिणामस्वरूप अर्क गस और luciferase गतिविधि के लिए व्यक्तिगत रूप से परख रहे हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल इसलिए अलग उपचार है कि एक ही प्रयोग में शामिल किया जा सकता है की संख्या सीमित है, और जैविक प्रतिकृति कि यथोचित प्रत्येक उपचार के लिए शामिल किया जा सकता की संख्या को सीमित करें । इन सीमाओं इसे और अधिक व्यापक और एकाधिक उपचार के बीच एक साथ तुलना बाहर ले जाने के लिए मुश्किल बना । इस तरह की तुलना विशेष रूप से मुश्किल हो सकता है अगर उपचार के बीच जीन अभिव्यक्ति में अंतर मामूली है और जैविक प्रतिकृति की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या के लिए सांख्यिकीय महत्व स्थापित करने की आवश्यकता है ।
एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया है कि आंशिक रूप से अनाज निकालने की तैयारी और गस परख काफी उच्च प्रवाह अनुमति देता है । प्रोटोकॉल का यह नया संस्करण एक प्रयोग में नमूनों की एक बहुत बड़ा कुल संख्या शामिल करने के लिए संभव बनाता है, दोनों प्रयोग प्रति अधिक अलग उपचार के शामिल किए जाने के लिए अनुमति देता है, और अधिक प्रत्येक उपचार के लिए प्रतिकृति । बमबारी और गर्मी के बाद अनाज निष्कर्षों की तैयारी के लिए, हम एक मोटे तौर पर स्वचालित पीसने प्रोटोकॉल है कि एक मनका homogenizer कि एक साथ 48 नमूनों की प्रक्रिया कर सकते है का इस्तेमाल प्रतिस्थापित किया है (के बारे में 20 मिनट में) । इस प्रकार, एक अंवेषक को कम समय में लगभग 200 नमूनों से घुलनशील प्रोटीन का अर्क तैयार कर सकते है कि यह चार जांचकर्ताओं की एक टीम लेने के लिए हाथ केवल 100 नमूनों पीसने होगा । संशोधित गस परख, 96 अच्छी तरह से प्लेटों में बाहर किया, भी बहुत कम परिश्रम की आवश्यकता है कि मूल प्रोटोकॉल है कि व्यक्तिगत ट्यूब परख कार्यरत हैं ।
बमबारी (3.1 कदम) के लिए प्लाज्मिड मिश्रण तैयार करने में, यह विशेष रूप से प्रारंभिक परीक्षणों के लिए एक प्रभाव रिपोर्टर अनुपात करने के लिए उपयोग करने के लिए संभव है, तो एक विशेष प्रभाव सभी पर कोई प्रभाव पड़ता है निर्धारित करने के लिए । हालांकि, मक्का ubiquitin (यूबीआई) प्रवर्तक की ताकत के कारण, एक मजबूत प्रभाव अक्सर बहुत कम अनुपात के साथ मनाया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 2में देखा गया है और पहले प्रकाशित रिपोर्टों में 4,5,6. इस प्रोटोकॉल में अंय महत्वपूर्ण कदम जौ अनाज और बमबारी उपकरण में सावधानी से परिभाषित सेटिंग्स के उपयोग से बीज कोट के छीलने शामिल हैं । यदि बीज कोट पूरी तरह से नहीं निकले तो सोने की microcarriers को उपaleurone कोशिकाओं में प्रवेश करने से रोक दिया जाएगा । aleurone कोशिकाओं में सोने microcarriers का सफल वितरण भी काफी इस्तेमाल किया टूटना डिस्क के विशिष्ट प्रकार पर निर्भर है, microcarrier कवर ढक्कन की स्थिति, स्क्रीन को रोकने, और बमबारी करने के लिए ऊतक. शर्तों यहां आम तौर पर जीन constructs के सफल वितरण में परिणाम (देखें कदम 8.1) एक उच्च प्रतिशत (बमबारी जौ अनाज के नमूनों की ≥ 70%) । यह उंमीद की जानी चाहिए कि अंय जैविक सामग्री इष्टतम जीन वितरण के लिए विभिंन शर्तों की आवश्यकता होगी ।
हालांकि यह यहां वर्णित नहीं है, यह आगे 96 अच्छी तरह से प्लेटों में फ़्लैश luciferase परख ले द्वारा प्रक्रिया को कारगर बनाने के लिए संभव होगा । हालांकि, के रूप में luciferase से प्रकाश उत्पादन सब्सट्रेट (luciferin) के साथ प्रोटीन निकालने के बाद तुरंत एक luminometer में मापा जाना चाहिए, यह एक थाली फ़्लैश luminometer के उपयोग की आवश्यकता होगी, एक उपकरण है कि बहुत अधिक है एक भी ट्यूब luminometer से महँगी.
प्रतिनिधि परिणाम यहां रिपोर्ट की पुष्टि करें कि प्रतिलेखन कारक TaABF1 exogenous आबा5,6के अभाव में HVA1 अभिव्यक्ति सक्रिय कर सकते हैं । या तो TaABF1 या exogenous आबा द्वारा HVA1 के सक्रियकरण PLD अवरोधक द्वारा रोका गया था 1-ब्यूटानॉल, सुझाव है कि phosphatidic द्वारा PLD एसिड का उत्पादन HVA1 सक्रियण के लिए आवश्यक हो सकता है । TaABF1 और आबा द्वारा HVA1 विनियमन के लिए ये परिणाम Zou एट अल द्वारा प्राप्त उन लोगों के समान हैं । 10 HVA22 के सक्रियकरण के लिए प्रतिलेखन कारक LtWRKY21 द्वारा और आबा द्वारा । लग रहा है कि एच2हे2 या SNP Amy32b की aleurone अभिव्यक्ति को दबाने में exogenous आबा के लिए विकल्प नहीं है , पुष्टि करता है कि अनाज अनाज में आबा संकेतन के कुछ पहलुओं stomatal गार्ड कोशिकाओं में क्या होता है से अलग हैं. खोज है कि एच2ओ2 downregulate नहीं है Amy32बी अभिव्यक्ति Ishibashi एट अल द्वारा मनाया परिणामों के अनुरूप है । amylase एंजाइम गतिविधि के लिए 11 .
वृद्धि का प्रवाह प्रोटोकॉल अब TaABF1 फास्फारिलीकरण के बहाव जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता पर प्रभाव का एक व्यापक अध्ययन बाहर ले जाने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है । प्रतिलेखन कारकों के ABF परिवार के अंय सदस्यों के रूप में विभिंन साइटों की संख्या में phosphorylated जा सकता है12,13,14,15,16, एकाधिक ख्यात फास्फारिलीकरण TaABF1 पर साइटों का परीक्षण किया जाना चाहिए । उच्च इस प्रोटोकॉल द्वारा अनुमति का प्रवाह TaABF1 के उत्परिवर्ती संस्करणों की एक बड़ी संख्या की अनुमति (संभावित phosphorylatable serine और threonine अवशेषों के साथ संशोधित) के लिए पूछताछ की जाएगी, जैविक प्रतिकृति की एक बड़ी संख्या के साथ प्रत्येक ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक Greyson बटलर और मार्गरेट बैरेट को बाहर प्रयोगों, अनाज homogenization पर सलाह के लिए पत्थर से लगा हुआ, और fluorometry पर सलाह के लिए लिन Hannum ले जाने में मदद के लिए धंयवाद । यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (आइओबी ०४४३६७६) द्वारा समर्थित किया गया था, एक संस्थागत विकास पुरस्कार से (आइडिया) राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के अनुदान संख्या P20GM0103423 के तहत, और से अनुदान द्वारा कोल्बी कॉलेज प्राकृतिक विज्ञान के प्रभाग ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
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