Summary
Un protocollo migliore è presentato per la misura dell'espressione genica transitoria da costruzioni del reporter in cellule di aleurone di orzo dopo il bombardamento di particelle. La combinazione di grano automatizzato rettifica con analisi dell'enzima piastra a 96 pozzetti fornisce throughput elevato per la procedura.
Abstract
Lo strato aleuronico di chicchi d'orzo è un importante sistema modello per l'espressione di gene ormone-regolato nelle piante. In cellule di aleurone, geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale attivati da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). I meccanismi di segnalazione GA e ABA possono essere interrogati dall'introduzione di costruzioni di gene del reporter in cellule di aleurone via bombardamento di particelle, con l'espressione transitoria risultante misurata mediante analisi dell'enzima. Un protocollo migliorato è segnalato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione di grano e l'analisi dell'enzima, che consente una velocità effettiva significativamente maggiore rispetto ai metodi esistenti. Omogeneizzazione dei campioni grano viene effettuata utilizzando un omogeneizzatore automatizzato del tessuto, e GUS (β-glucuronidasi) le analisi sono effettuate utilizzando un sistema di piastra a 96 pozzetti. Risultati rappresentativi utilizzando il protocollo suggeriscono che l'attività della fosfolipasi D può svolgere un ruolo importante nell'attivazione dell'espressione genica di HVA1 di ABA, attraverso il fattore di trascrizione TaABF1.
Introduction
Lo strato aleuronico orzo è un sistema consolidato modello per lo studio dell'espressione di gene ormone-regolato in piante1. In particolare, un numero di geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale è attivato da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). La GA e ABA vie di segnalazione sono intrecciate, come l'espressione di alcuni geni attivati dal GA è inibita da ABA e viceversa1.
Una strategia importante per comprendere che il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA è stata l'introduzione di costrutti genici effettrici tramite bombardamento di particelle, seguita dall'espressione transitoria di costruzioni del reporter che consentono l'effetto risultante sul espressione genica a valle deve essere determinato. L'uso di geni reporter come GUS (β-glucuronidasi) o Luciferase permette la misura sensibile e quantitativa dell'espressione genica in particolare all'interno delle cellule che hanno ricevuto il costrutto dell'effettore. Ad esempio, l'introduzione di un costrutto di effettori che codifica per il fattore di trascrizione TaABF15,6 stabilito che geni indotti da ABA come HVA1 sono indotte da TaABF1, mentre GA-indotta di geni come Amy32b sono repressi. Bombardamento di particelle come una strategia sperimentale è stato utilizzato da più laboratori di approfondire diversi aspetti della GA/ABA segnalazione. Tale lavoro ha portato all'identificazione di elementi promotore importanti per l'attivazione indotta da GA2 sia geni indotti da ABA3e alla scoperta della proteina chinasi4 e fattori di trascrizione5 che regolano la espressione di questi geni.
Gli esistenti protocolli2,3,4,5,6 per bombardamento di particelle e successiva misura della espressione genica transitoria sono abbastanza laborioso, come ogni set di bombardato a malapena grani è omogeneizzato a mano in un mortaio e pestello e l'analisi dell'enzima sono effettuate individualmente. Questo manoscritto segnala un protocollo migliorato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione e GUS saggi per consentire una velocità effettiva significativamente maggiore, permettendo un maggior numero di trattamenti da sottoporre all'esperimento stesso, e/o la inclusione di ulteriori repliche per ogni trattamento ottenere altri risultati statisticamente robusti. Risultati rappresentativi sono indicati per l'espressione di HVA1 e Amy32b costruzioni del reporter, regolata dal fattore di trascrizione TaABF1 nonché da GA, ABA e altre molecole regolatrici.
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Protocol
1. preparazione del Effector e Gene Reporter costruisce
- Costruire costrutti effettrici che impiegano un promotore costitutivo (es. mais ubiquitina, UBI) all'espressione di unità da un telaio di lettura aperto desiderato. Ad esempio, costruire un plasmide contenente UBI::TaABF1 di forte espressione costitutiva unità di TaABF15.
- Costruire costruzioni del reporter che includono il promotore cui attività deve essere misurato, posto a Monte di un open reading frame, come GUS. Ad esempio, costruire un plasmide contenente HVA1::GUS per misurare l'espressione dal promotore HVA1 2,5.
- Costruire un costrutto di controllo interno (ad es. UBI::luciferasi).
- Utilizzando una colonna di silice associazione protocollo (Vedi Tabella materiali), preparare il plasmide di alta qualità per ciascuno dei costrutti gene richiesto. Usando la spettroscopia ultravioletta (Vedi Tabella materiali), accuratamente misurare la concentrazione di ogni preparazione del plasmide.
2. preparazione di chicchi d'orzo per il bombardamento
- Impostare un foglio di calcolo (per un esempio, vedere Figura 1 ) che indica i plasmidi che saranno bombardati, i trattamenti ormonali appropriati e altre informazioni pertinenti per ogni trattamento che sarà parte dell'esperimento.
- Utilizzando una lama di rasoio sterile e un tagliere, tagliare gli embrioni da chicchi di orzo Himalaya (40 per ogni trattamento incluso nell'esperimento). Escludere i grani che sono scolorite o sostanzialmente più piccole della media.
- Posizionare tutti i grani embryoless in una provetta da 50 mL. Aggiungere 40 mL di acqua e roccia per 10 minuti.
- Versare l'acqua con attenzione (per evitare di perdere i grani) e aggiungere 40 mL di candeggina al 10%. Roccia per 20 minuti.
- Versare la candeggina e aggiungere 40 mL di acqua sterile. Roccia per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio di acqua sterile quattro volte di più.
- Aggiungere 40 mL di soluzione di Imbibing (succinato del sodio di 20 mM, 20 mM di cloruro di calcio, pH 5.0) e 40 μL di soluzione di riserva di cloramfenicolo (10 mg/mL).
- Trasferire la maggior parte della soluzione (con cloramfenicolo) assorbendo dal tubo in una piastra di Vermiculite (Vedi Tabella materiali). Quindi trasferire i grani sulla superficie della carta da filtro bagnata nella piastra di Vermiculite. Stendere in modo uniforme i grani. Versare in una soluzione abbastanza semplice per mantenere i grani parzialmente (ma non completamente) sommerso. Posizionare il coperchio sopra la piastra di Vermiculite.
- Incubare i grani embryoless a 24 ° C per circa 48 h con illuminazione fluorescente. Aggiungi ulteriori Imbibing soluzione come necessario.
- Aprire una capsula di Petri 90 mm plastica e versare 20 mL di soluzione di Imbibing nel piatto stesso e 20 mL nel coperchio rovesciato. Aggiungere 20 μL di cloramfenicolo (10 mg/mL) a ciascuno. Sterilizzare due paia di pinze a punta fine tuffandoli in alcool.
- Posto alcuni dei grani embryoless nel coperchio della piastra di petri. Utilizzando le pinze, rimuovere delicatamente il cappotto di seme (trasparente) da ogni grano. Durante la rimozione il cappotto di seme dal lato liscio del grano, non danneggiare le celle sottostanti (aleuronico). Trasferire il grano pelato di Petri contenente soluzione assorbendo.
- Dopo il cappotto di seme da tutti i grani di peeling, restituirli alla piastra di Vermiculite. Incubare i grani embryoless pelati a 24 ° C per 16-20 ore.
- Appena prima di usare i grani per il bombardamento, togliere l'umidità superficiale agitando loro tra carta da filtro in una capsula di Petri.
3. preparazione del DNA del plasmide per bombardamento
- Etichettare una provetta da 1,5 mL per ogni trattamento che verrà inclusi nell'esperimento bombardamento. A ciascuna provetta aggiungere 2,5 µ g di UBI:: plasmide controllo internoluciferasi , 2,5 µ g di un plasmide del reporter GUS e la quantità desiderata (in genere 0.025 µ g 2,5 µ g) di un plasmide dell'effettore. Aggiungere acqua per portare il volume totale a 5 µ l.
- Preparare 1,6 µm oro microcarriers (Vedi Tabella materiali) pubblicati protocolli6.
- Per ogni trattamento, aggiungere 50 µ l di sospensione microcarriers nella provetta da 1,5 mL contenente il DNA del plasmide. Cappotto microcarriers con DNA plasmidico secondo protocolli6 del produttore.
- Nella fase finale, quando il microcarriers rivestite con plasmide sono sospese in 48 µ l 100% di etanolo, dispensare 8 μL di sospensione microcarriers su ognuno dei cinque macrocarriers e consentire loro di aria secca.
4. particelle bombardamento di chicchi d'orzo Embryoless
- Impostare l'apparecchio di bombardamento di particelle (Vedi Tabella materiali)6.
- Inserire un disco di rottura psi 1550 il tappo ritegno e montarla sullo strumento.
- Posizionare un macrocarrier contenente la combinazione desiderata plasmide (insieme a una schermata di arresto) nel microcarrier lancio assieme. Inserire il gruppo nell'alloggiamento superiore della camera del bombardamento. Impostare la distanza tra il disco di rottura mantenendo il tappo e il coperchio di copertura macrocarrier alla distanza standard (6 mm) e inserire il supporto di schermo di arresto dalla posizione centrale (standard), che permette una distanza di viaggio di macrocarrier di 11 mm (Figura 2A).
- Organizzare embryoless 8 grani a raggiera stretto (con l'estremità più sottile punta verso l'interno) su un cerchio di carta da filtro che è registrato giù piatta al coperchio di una piastra di petri di 90 mm (Vedi Figura 2B).
- Posizionare il piatto con i grani nella camera di bombardamento, ad una distanza di 6 cm dalla schermata di arresto.
- Evacuare la camera di bombardamento a 95 kPa e poi bombardare il campione.
- Dopo aver rilasciato il vuoto, è possibile trasferire i grani hanno bombardati a una capsula di Petri con etichetta 60 mm contenente 4 mL di soluzione di Imbibing contenente 1 mg/ml di cloramfenicolo.
- Ripetere fino a quando tutti i bombardamenti sono stati completati. Incubare (su una piattaforma d'agitazione a 100 giri/min) a 24 ° C per 24 ore.
5. estrazione della proteina solubile dai grani hanno bombardati
- Usando il forcipe, rimuovere i 8 grani bombardati da una capsula di Petri 60mm e asciugare loro secco su un tovagliolo di carta. Dividere i grani in due tubi etichettati 2,0 mL (4 grani per tubo) ognuno dei quali contiene 800 μL rettifica Buffer (100 mM Na fosfato pH 7.2, 5 mM DTT, 10 µ g/mL leupeptina, 20% glicerolo) e una perlina di acciaio di 5 mm. Ripetere questo processo per tutti i cereali hanno bombardati.
- Inserire due cesti dell'omogeneizzatore perlina (fino a 48) 2,0 mL provette (Vedi Tabella materiali). Montare i rack sull'omogeneizzatore.
- Agitare i campioni a 30 Hz per 3 minuti.
- Rimuovere il rack omogeneizzatore dall'omogeneizzatore e metterli su ghiaccio (5 min) per ri-raffreddare i campioni.
- Montare i rack torna sull'omogeneizzatore - nell'orientamento opposto. Agitare nuovamente i campioni a 30 Hz per 3 minuti.
- Raffreddare le cremagliere su ghiaccio, quindi ripetere i passaggi 5.3 a 5.5. Questo aggiungerà fino a un totale di 12 minuti di agitazione.
- Centrifugare gli estratti di grano a 16.000 x g a 4 ° C per 10 minuti.
- Decantare immediatamente dopo la centrifugazione, i sovranatante chiari in un secondo set di tubi per microcentrifuga. Dare ogni tubo un vortice veloce. Conservare i capillari sul ghiaccio.
- Dopo aver trasferito il supernatante, recuperare le sfere d'acciaio dai pellet così possono essere lavati e riutilizzati.
6. misurazione di attività luciferasica da estratti di grano
- Per ogni provetta di estrazione grana deve essere analizzato, preparare una provetta di vetro 12 mm x 75 mm contenente 200 μL di miscela di Luciferase Assay (45 mM Tris pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20mm DTT, 1,5 mM EDTA, luciferina di 1 mM, 1 mM ATP del solfato).
- Aggiungere 100 μL del primo estratto di grano per il primo tubo di dosaggio. Vortice rapidamente per mescolare bene. Immediatamente inserire il tubo nel supporto del tubo del luminometro e chiudere la porta. Quando la misurazione è terminata, estrarre il tubo dal luminometro – lasciando la porta aperta per il posizionamento del tubo successivo.
- Ripetere questo processo fino a quando tutti i campioni sono stati misurati.
7. misurazione dell'attività GUS da estratti di grano
- Aggiungere 200 μL di tampone del saggio GUS (50mm Na fosfato pH 7.2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µ g/mL leupeptina, 20% metanolo, 0,02% di sodio azide) in ciascun pozzetto di una piastra ben 96.
- Mettere 50 μL di ogni estrazione grana nella corrispondente bene. Mescolare con la punta dopo l'aggiunta. Sigillare la parte superiore con pellicola sigillante.
- Incubare la piastra ben 96 a 37 ° C al buio per 20 ore.
- Centrifugare la piastra ben 96 a 4.000 x g a 4 ° C per 10 minuti e posizionarlo sul ghiaccio.
- Aggiungere 250 μL di 0,2 M Na2CO3 in ciascun pozzetto di una piastra ben nero 96.
- Aggiungere 6,25 μL di ogni miscela di analisi GUS centrifugato nella corrispondente bene (contenente 0,2 M Na2CO3) del nero 96 ben piatto. Mescolare con la punta dopo l'aggiunta. Includono i pozzetti con 6,25 μL di 10 μM, 40 μM e 100 μM 4-methylumbelliferone come standard.
- Posizionare la piastra nera in un fluorometro di piastra e leggere la fluorescenza di methylumbelliferone. Prendere le letture ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 460 nm. Impostare il guadagno dello strumento tale che un contenente 6,25 μL di 40 μM 4-methylumbelliferone e 250 μL di 0,2 M Na2CO3 dà una lettura di 1000 unità di fluorescenza.
8. analisi dei dati
- Immettere i valori per la luciferasi e dosaggi di GUS in un foglio di calcolo. Escludere dalla considerazione qualsiasi campione con una lettura di luciferasi inferiore a 20.000 luminescenza relativa unità s-1, come questo indica che i costrutti genici non sono stati recapitati correttamente per le cellule di aleurone.
- Per ogni granello con successo hanno bombardato l'Estratto (che rappresenta un gruppo di quattro grani embryoless), calcolare l'espressione di GUS normalizzato dai dati grezzi di GUS e luciferasi come segue: normalizzato GUS = [(espressione di GUS - GUS vuoto) x (2.000.000)] / (luciferase espressione – luciferasi in bianco).
Nota: Questo normalizza la quantità di attività di GUS a quanto sarebbe stato osservato in un bombardamento che ha dato una lettura di luciferasi di 2.000.000. - Segnalare il livello relativo di espressione di un costrutto particolare reporter in presenza di costrutti effettrici o trattamenti ormonali in fase di test confrontando il livello di espressione in assenza di effettori o ormoni.
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Representative Results
La tecnica qui descritta può essere utilizzata per introdurre qualsiasi costruzione di prova gene nelle cellule di aleurone di chicchi d'orzo. Il livello di espressione dal gene test quindi può essere convenientemente misurato (Figura 2). Il protocollo di throughput superiore descritto qui notevolmente aumenta l'efficienza del seme macinazione e la procedura di analisi enzima. Questo metodo è stato utilizzato per valutare la capacità del fattore di trascrizione TaABF15,6 di attivare l'espressione del gene indotta da ABA HVA17. Nei risultati della rappresentativi presentati qui, una costruzione del reporter HVA1::GUS è stato introdotto nelle cellule di aleurone insieme a un costrutto di effettori UBI::TaABF1 (Figura 3A). Mentre un TaABF1/HVA1 rapporto di soli 0,01 era sufficiente per causare un 3 volte induzione del gene del reporter di HVA1 in assenza di ABA esogeno, i livelli elevati del costrutto TaABF1 ha provocato progressivamente maggiore HVA1 espressione, in maniera dose-dipendente (Figura 3BC).
Questo protocollo sperimentale può anche includere l'uso di ormoni o altri composti durante il periodo di incubazione post-bombardamento di valutare il ruolo di queste molecole nella regolazione dell'espressione genica. Lavoro precedente da altri ricercatori ha suggerito l'importanza della fosfolipasi D in alcuni aspetti della segnalazione di ABA. In particolare, il prodotto di attività della fosfolipasi D, acido fosfatidico, è stato implicato come intermedio in alcune risposte a ABA8,9. Il fatto che 1-butanolo, un inibitore della fosfolipasi D (PLD), è stato indicato per impedire l'espressione di ABA-indotto del gene in cellule di aleurone suggerisce che il PLD potrebbe essere parte integrante della ABA segnalazione in questo tessuto. Il protocollo di bombardamento è stato utilizzato per verificare se 1-butanolo potrebbe inibire l'espressione di HVA1 indotta da ABA o indotta da TaABF1. Come previsto, ABA esogeno o TaABF1 fortemente potrebbe indurre l'espressione della costruzione del reporter HVA1::GUS (Figura 3). In entrambi i casi, la presenza di 1-butanolo fortemente inibito l'induzione di HVA1 . Ciò suggerisce che il PLD potrebbe svolgere un ruolo importante nell'attivazione dell'espressione genica HVA1 di ABA, attraverso TaABF1.
Oltre al suo ruolo nello sviluppo e grani di germinazione, ABA è anche fondamentale per la regolazione apertura stomatica in foglie. Nelle cellule di guardia di stomi, la produzione di acido fosfatidico è stimolata dall'ossido nitrico (NO), che è a sua volta indotta dal perossido di idrogeno (H2O2). Per alcune risposte, n e H2O2 può sostituire per ABA9. Per determinare se questo è anche il caso in cellule di aleurone, il protocollo di bombardamento è stato utilizzato per verificare se il NO donatore nitroprusside del sodio (SNP) o H2O2 potrebbe sostituire per ABA nell'inibizione dell'espressione della indotta da GA Amy32b gene. Mentre ABA potrebbe inibire fortemente espressione indotta da GA per il reporter Amy32b::GUS costruire, H2O2 né SNP ha causato qualsiasi riduzione significativa (Figura 3D). Questi risultati, pertanto, non supportano un ruolo per n e H2O2 nelle risposte delle cellule ABA aleuronico.
Figura 1 : Foglio di calcolo per un esperimento di bombardamento tipico. La quantità di ogni preparazione del plasmide per essere inserito nel tubo per ogni bombardamento è indicata. In questo esperimento, quattro colpi (8 grani ogni) sono stati utilizzati per ogni trattamento per un totale di otto campioni possibili (4 grani ogni) per ogni trattamento. Al fine di mantenere la stessa concentrazione di DNA totale in ogni bombardamento, un plasmide dell'effettore "fittizio" è stato utilizzato per sostituire il plasmide del effector di UBI::TaBF1 in alcuni casi. Trattamento è un bombardamento "in bianco" per stabilire il livello di sfondo dell'attività GUS e luciferasi in cellule di aleurone. I risultati dell'esperimento bombardamento delineato in questo foglio di calcolo sono riportati nella Figura 3B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Diagramma del protocollo. (A) schema del dispositivo bombardamento. (B) particelle di oro rivestite con una costruzione del reporter che trasportano il promotore da testare, un effettore (se necessario) e un controllo interno (UBI::luciferase) sono introdotti nelle cellule di aleurone orzo da bombardamento di particelle. Dopo l'incubazione (in genere per 24 h), i grani sono terra e analizzati per attività GUS sia l'attività luciferasica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Regolamento dei promotori di HVA1 e Amy32b di TaABF1, ABA e potenziali mediatori di segnalazione ABA. (A) Reporter ed effettrici costrutti utilizzati negli esperimenti. (B) il costrutto dell'effettore UBI::TaABF1 Co-è stato bombardato in cellule di aleurone con il reporter HVA1::GUS e il costrutto di controllo interno (UBI::luciferase). La quantità di UBI::TaABF1 effettrici (riguardante il reporter HVA1::GUS ) varia da 0 a 0,1, come indicato sotto le barre. Attività di luciferase e GUS sono state misurate dopo 24 h di incubazione. I dati indicati sono i mezzi (± SE) di 6-8 ripetizioni biologici. (C) il reporter HVA1::GUS Co-è stato bombardato in cellule di aleurone con il costrutto di controllo interno (UBI::luciferase) in presenza o assenza del costrutto effettrici UBI::TaABF1. La quantità di TaABF1 effettrici (riguardante il reporter) era 1.0. Attività di luciferase e GUS sono state misurate dopo 24 h di incubazione con o senza 20 µM ABA e 0,4% 1-butanolo. (D) il giornalista Amy32b::GUS era co-hanno bombardato in cellule di aleurone con il costrutto di controllo interno (UBI::luciferase). Attività di luciferase e GUS sono state misurate dopo 24 h di incubazione in presenza di 1 mM GA con o senza ABA 20 µM, 1 mM H2O2o 100 µM nitroprusside del sodio (SNP). Attività GUS i valori sono relativi l'espressione del reporter Amy32b::GUS in assenza di GA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'introduzione del gene dell'effettore costrutti tramite bombardamento di particelle, seguita dall'espressione transitoria di costruzioni del reporter è una strategia importante per il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA e nel gene ormone-regolata risultante di dissezione espressione.
Tuttavia, i protocolli esistenti per lo svolgimento di tali esperimenti in orzo aleuronico cellule2,3,4,5,6 sono molto laborioso. Ogni gruppo di bombardati a malapena grani devono essere omogeneizzato in un mortaio e pestello a mano, e gli estratti risultanti sono analizzati singolarmente per attività GUS e luciferasi. Gli attuali protocolli di conseguenza limitano il numero di trattamenti separati che possono essere inclusi nell'esperimento stesso e limitare il numero di repliche biologiche che possono ragionevolmente essere inclusi per ogni trattamento. Queste limitazioni rendono più difficile effettuare confronti completi e simultanei tra i trattamenti multipli. Tale confronto può essere particolarmente difficile se la differenza nell'espressione del gene fra i trattamenti è modesta e un numero relativamente elevato di repliche biologiche è necessaria stabilire la significatività statistica.
Un protocollo semplificato è presentato qui che parzialmente automatizza la preparazione di Estratto di grano e il GUS saggi per consentire una velocità notevolmente superiore. Questa nuova versione del rende protocollo fattibile per includere un numero molto maggiore di totale di campioni in un esperimento, consentendo sia per l'inserimento di più diversi trattamenti per esperimento e di più replica per ogni trattamento. Per la preparazione degli estratti di grano dopo il bombardamento e l'incubazione, noi abbiamo sostituito con un protocollo di rettifica in gran parte automatizzato che utilizza un omogeneizzatore del tallone che può elaborare 48 campioni contemporaneamente (in circa 20 minuti). Così, un singolo ricercatore può preparare proteina solubile estratti da quasi 200 campioni in meno tempo che ci vorrebbe una squadra di quattro ricercatori a portata di mano macinare solo 100 campioni. L'analisi modificata di GUS, effettuato a 96 pozzetti, richiede anche molto meno lavoro che il protocollo originale che impiegati tubi singoli dosaggi.
Nella preparazione delle miscele di plasmide per bombardamento (punto 3.1), è possibile utilizzare un realizzatore al rapporto di reporter di 1.0, soprattutto per i test preliminari determinare se un particolare effettore ha alcun effetto a tutti. Tuttavia, a causa della forza del promotore mais ubiquitina (UBI), un forte effetto può spesso essere osservato con rapporti molto più bassi, come si vede in Figura 2B e in rapporti precedentemente pubblicati4,5,6. Altri punti critici in questo protocollo sono peeling del tegumento dai grani di orzo e l'utilizzo delle impostazioni accuratamente definite nell'apparato di bombardamento. Se i tegumenti non vengono completamente rimosse, l'oro microcarriers sarà essere impedito di entrare le cellule di aleurone subtending. Consegna di successo dell'oro microcarriers nelle cellule di aleurone è anche abbastanza dipenda dal tipo specifico di utilizzate il disco di rottura, la posizione del coperchio microcarrier, schermo di arresto e tessuto ad essere bombardati. Le condizioni in genere segnalato qui risultato nella consegna di successo dei costrutti gene (Vedi punto 8.1) ad un'alta percentuale (≥ 70%) di campioni di grano orzo hanno bombardato. Dovrebbe essere previsto che altri materiali biologici che richiedono diverse condizioni per consegna ottimale del gene.
Anche se non è descritto qui, sarebbe possibile semplificare ulteriormente la procedura effettuando i saggi di luciferasi flash a 96 pozzetti. Tuttavia, come la produzione di luce da luciferasi deve essere misurata in un luminometro immediatamente dopo la miscelazione la proteina Estratto con il substrato (luciferina), questo richiederebbe l'uso di una piastra di luminometro flash con iniettori, uno strumento che è molto più costoso rispetto ad un singolo tubo luminometer.
I risultati rappresentativi segnalati qui confermano che il fattore di trascrizione TaABF1 può attivare l'espressione di HVA1 in assenza di esogeno ABA5,6. Attivazione di HVA1 da TaABF1 o ABA esogeno è stata impedita dal PLD inibitore 1-butanolo, suggerendo che la produzione di acido fosfatidico di PLD può essere richiesto per l'attivazione HVA1 . Questi risultati per regolamento HVA1 da TaABF1 e ABA sono simili a quelli ottenuti da Zou et al. 10 per l'attivazione di HVA22 per il fattore di trascrizione LtWRKY21 e di ABA. L'individuazione che H2O2 o SNP non sostituire per ABA esogeno nel sopprimere l'espressione di aleurone di Amy32b, conferma che alcuni aspetti di ABA segnalazione in grani di cereale sono distinti da quello che si verifica in cellule di guardia stomatica. L'individuazione che H2O2 non non downregulate Amy32b espressione è coerenza con i risultati osservati da Ishibashi et al. 11 per l'attività dell'enzima amilasi.
Ora viene utilizzato il protocollo di aumentare il throughput di effettuare uno studio completo degli effetti della fosforilazione di TaABF1 sulla sua capacità di regolare l'espressione genica a valle. Come altri membri della ABF famiglia di fattori di trascrizione può essere fosforilata in un certo numero di siti diversi12,13,14,15,16, più putativa fosforilazione siti su TaABF1 bisogno di essere testati. Il throughput più elevato consentito dal presente protocollo consentirà un gran numero di versioni mutanti di TaABF1 (con potenzialmente fosforilabile serina e treonina residui per volta) per essere interrogati, ciascuno con un numero elevato di biologico replica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Greyson Butler e Margaret Barrett per aiuto nello svolgere gli esperimenti, Judy Stone per consigli su omogeneizzazione di grano e Lynn Hannum per consigli su fluorometria. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (IOB 0443676), di un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health, sotto concessione numero P20GM0103423 e da sovvenzioni da la divisione di Colby College di scienze naturali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
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