Summary
Dette nyudviklede fluorescens-baseret teknologi gør det muligt for langsigtet overvågning af transkription af døgnrytmen ur gener i suprachiasmatic kernen (SCN) af frit flytte mus i realtid og med en høj tidsmæssige opløsning.
Abstract
Denne teknik kombinerer optisk fiber medieret fluorescens optagelser med præcis levering af rekombinant adeno-associeret virus baseret gen journalister. Denne nye og nemme at bruge i vivo fluorescens overvågning system blev udviklet til at registrere ur gen, Cry1, transcriptional rytme i suprachiasmatic kernen (SCN) af frit flytte mus. At gøre det, en Cry1 transskription fluorescens reporter var designet og pakket ind i Adeno-associeret virus. Renset, koncentreret virus blev sprøjtet ind i musen SCN efterfulgt af indsættelsen af en optisk fiber, som blev derefter fast på overfladen af hjernen. Dyrene var vendt tilbage til deres hjem bure og tilladt en 1-måneds postoperativ nyttiggørelse periode for at sikre tilstrækkelig reporter udtryk. Fluorescens blev derefter optaget i frit flytte mus via en i vivo overvågningssystem, der blev bygget på vores institution. For den i vivo optagelse system, blev en 488 nm laser kombineret med en 1 × 4 beam-splitter, inddelt fire laser excitation udgange lige strøm lyset. Denne opsætning givet os mulighed at optage fra fire dyr samtidig. Hver af signalerne, der udsendes fluorescens blev indsamlet via et photomultiplier tube og et datakort erhvervelse. I modsætning til den tidligere bioluminescens i vivo døgnrytmen ur optagelse teknik tilladt denne fluorescens i vivo optagelse system registrering af døgnrytmen ur genekspression under lys cyklus.
Introduction
I pattedyr styrer suprachiasmatic kernen (SCN) hele kroppens døgnrytme for at koordinere den enkeltes reaktion på eksogene miljømæssige ændringer (f.eks., lys, temperatur, stress, osv.)1. Core clock komponenter består af Per1-3, Cry1-2, urog Bmal1, og spiller en central rolle i reguleringen af døgnrytmen uret i hver celle. Hver celle i SCN indeholder transcriptional aktivator, ur/BMAL1, der fungerer som en heterodimer til inducerer udtryk af PER og græde. PER / CRY kompleks derefter hæmmer funktionen af ur/BMAL1 til at danne en transskription-oversættelse feedback loop, der tager omkring 24 h til fuldstændig2,3.
Tidligere undersøgelser på SCN har hovedsageligt ansat ex vivo SCN skive kultur metode4,5,6 , og mens denne tilgang har givet værdifulde oplysninger, sine begrænsninger har hæmmet vores evne til at få data vedrørende påvirkning af andre hjerne kerner på SCN, samt påvirkning af eksogene stimuli (fxlys) celler bosat i denne vigtige region. I 2001 var Hitoshi Okamura gruppe først til at bruge bioluminescens systemet i vivo genekspression skærm døgnrytmen uret i SCN i frit flytte mus7. Ken-ichi Honma gruppe har tilbragt de sidste par år yderligere at udvikle bioluminescens i vivo optagelse system i SCN8,9,10. Sammen, har disse undersøgelser givet forskerne mulighed for at overvåge døgnrytmen uret i konstant mørke eller efter en lys puls. Men fordi bioluminescens er for svagt til at give mulighed for kontinuerlig overvågning under lys/mørke cyklus, kombineret med det faktum, at lys er den fremherskende signal kræves for SCN-medieret medrivning af døgnrytmen ure11, der er stigende efterspørgsel efter udviklingen af eksperimentelle metoder, der overvinde de begrænsninger i forbindelse med bioluminescens optagelse. Den aktuelle rapport beskriver et fluorescens-baseret system, som blev bygget til at overvåge døgnrytmen uret i SCN- vivo i frit flytte mus. Denne let-at-bruge metode tillader kontinuerlig overvågning under lys/mørke cyklus og giver mulighed for langsigtet observation af transkription af døgnrytmen ur gener i SCN i realtid og med høj tidsmæssige opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer i denne protokol blev gennemført med godkendelse af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af det nationale Institut for biologiske videnskaber, Beijing, i overensstemmelse med statslige bestemmelser i Kina.
1. opførelse af Cry1 fluorescens Reporter
Bemærk: Tidligere døgnrytmen undersøgelser ved hjælp af bioluminescens system2,12,13 lunte en døgnrytmen promotor med en destabiliseret luciferase (dLuc) til at fremkalde rytmiske dLuc udtryk. For at udvikle et fluorescens reporter, blev destabiliseret luciferase erstattet med destabiliseret fluorescens protein (dVenus) til at fremkalde rytmiske dVenus udtryk. Generation af P (Cry1)-dVenus reporter er beskrevet nedenfor, konstruktionen der er i øjeblikket at være indsendt til Addgene og vil være anvendelig hurtigt nemlig akademiske brug.
- Forstærke funktionelle mus Cry1 promoter (+328 til-1208 bp region i Cry1 gen, transskription startsted udpeget som '' -1 ''). Bruge PCR enzym (KOD Plus Neo), primere F1 og R1 (Se tabel 2), med musen genom som en skabelon og producentens PCR-protokollen for at forstærke Cry1 promotor DNA fragmenter.
- Forstærke intron 336 af Cry1 -genet, hvilket er vigtigt for funktionen døgnrytmen ur Cry114. Brug enzym PCR primere F2 og R2, mus genom som en skabelon og producentens PCR-protokol til at forstærke intron 336 DNA fragmenter.
- Forstærke Venus. Brug enzym PCR primere F3 og R3, pVENUS-N1 plasmid som en skabelon og producentens PCR-protokol til at forstærke Venus DNA fragmenter.
- Forstærke NLS-D2 DNA-fragment. Brug enzym PCR primere F4 og R4, pcDNA3.3-d2eGFP plasmid som en skabelon og producentens PCR-protokol til at forstærke NLS-D2 DNA-fragment.
- Syntetisere DNA fragment 1 som exon 1.
- Syntetisere DNA fragment 2 som linker mellem intron 336 og Venus DNA fragmenter.
- Skær pAAV-EF1a-dobbelt floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA vektor plasmid med MLU og EcoRI enzymer. Bruge Gel udvinding Kit til at rense det større DNA-fragment. Brug producentens protokol.
- Brug en Gibson forsamling mix og dens standardprotokol, samle alle DNA-fragmenter sammen for at producere pAAV-Petersen (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA reporter. Brug producentens protokol.
2. produktion af Adeno-associeret Virus15
- Forbered de følgende plasmid DNA bestande: 31,25 µg for pRV1, 31,25 µg for pH21, 125 µg for pFdelta6 og 62,5 µg af pAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.
- Udarbejde fem 15 cm retter af 293T celler og vente, indtil cellerne blive 90% sammenflydende.
- Transfect plasmider i 297T celler efter Transfektion reagens protokol. For hvert fad, bruge 6,25 µg for pRV1, 6,25 µg af pH21, 25 µg for pFdelta6, 12,5 µg af pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, og 120 µL Transfektion reagens.
- 72 h efter Transfektion, frigør celler fra hver plade ved hjælp af en pipette pistol; høste cellerne i to 50 mL rør.
- Sammenpresse cellerne ved 800 x g i 10 min. og supernatanten. Cellerne vaskes ved at placere 20 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i hver tube; sammenpresse cellerne ved 800 x g i 10 min., og supernatanten.
- Resuspend pellets i 150 NaCl og 20 mM Tris løsning, pH 8,0; bruge 25 mL af opløsning/rør. 1,25 mL frisklavede 10% natrium deoxycholate (i dH2O) tilsættes til hvert rør. Tilføje benzonase nukleasen til en slutkoncentration på 50 enheder pr. mL, og der blandes grundigt. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Fjern celleaffald ved centrifugering ved 3000 x g i 15 min. Desuden sørge for, at alle rester er fjernet ved at skubbe blandingen gennem en 0,45 μm sprøjte filter; Dette trin vil hjælpe med at forhindre blokering af heparin kolonner.
- Opsætning af heparin kolonner ved hjælp af en peristaltisk pumpe; Indstil flowet til 1 mL/min., at sikre, at ingen luftbobler er indført i kolonnerne.
- Reagensglasset kolonner med 10 mL af en 150 mM NaCl, 20 mM Tris løsning, pH 8,0. Tilføj den løsning, der indeholder virus til hver kolonne. Kolonnerne udvaskes med 20 mL af en 100 mM NaCl, 20 mM Tris løsning, pH 8,0. Derefter, ved hjælp af en 5 mL sprøjte, kolonnerne udvaskes med 1 mL af en 200 mM NaCl og 20 mM Tris løsning pH 8,0, efterfulgt af 1 mL af en 300 mM NaCl og 20 mM Tris løsning, pH 8,0.
- Brug en 5 mL sprøjte for at eluere virus med 3 mL af en 400 mM NaCl, 20 mM Tris løsning, pH 8,0, efterfulgt af 4 mL af en 450 mM NaCl, 20 mM Tris løsning, pH 8,0, og endelig ved en 3 mL af en 500 mM NaCl , 20 mM Tris løsning, pH 8,0. Indsamle de udvundne materialer.
- For rekombinante adeno-associeret virus (rAAV) koncentration, skal du indlæse de udvundne materialer, 4 mL ad gangen, i centrifugal filter enheder med en 100.000 molekylvægt cutoff. Der centrifugeres hver 4 mL prøve på 2000 x g i 5 min. ved stuetemperatur, udsmid gennemstrømnings.
- Når alle udvundne materialer har kørt gennem de centrifugale filter enheder, tilsættes 4 mL PBS og centrifugeres blandingen i ca 250 μL. Fjern rAAVs (viral titer bør være omkring 2-8 x 1012 virale partikler per mL) fra centrifugal filter enheder, delprøve og opbevares ved-80 ° C indtil brug. På dette stadium, kan virussen opbevares i flere måneder.
3. rAAV injektion og optisk Fiber indsættelse i Adult mus SCN
- Indsprøjtning af døgnrytmen fluorescens reporter-bærende rAAVs i SCN
- Indlæse 5 µL af rAAV (virus titer er omkring 2-8 x 1012 viruspartikler per mL) i en mikro-sprøjte.
- Bedøver en voksen mus (2 - til 5-måned-forhenværende, C57BL/6 baggrund) med Nembutal (80 mg/kg) via intraperitoneal injektion. Check for tilstrækkelig dybde af anæstesi af manglen på en tå-knivspids reaktion.
- Brug saks til at fjerne skind fra lederen af musen og derefter montere musen i et stereotaxisk apparatur. Give en varmekilde til bedøvede dyr via en cirkulerende varmt vand tæppe eller en anden opvarmning enhed.
Bemærk: Brug alternativt depilatory creme eller elektrisk hårklippemaskiner for at fjerne skind. - Ren operationsstedet med de passende desinficerende agenter. Dette kunne for eksempel omfatter sterilt vand eller alkohol og jod, betadine eller fortyndes chlorhexidin i vekslende scrubs. Gentag mindst 3 gange. Drapere operationsstedet.
- Bruge saksen til at gøre et snit i hovedbunden og udsætte kraniet.
- Justere den stereotaxisk apparatur, så bregma og lambda er i samme horisontale plan; gøre to symmetriske punkter af bregma i det samme vandrette plan.
- Brug en steril vatpind dyppet i 4% H2O2h2O at ætse hjernen periosteum. Brug derefter en ren og steril vatpind at rydde og tørre overfladen af kraniet.
- Bruger en mikro boremaskine, lave et hul ca 1 mm i diameter bageste 0,46 og 0,25 mm lateral til bregma.
- Fi Brug en ren steril vatpind med fysiologisk saltvand løsning for at rydde knoglerester fra udsatte overfladen af hjernen.
- Indsæt en mikro-sprøjte ind i hjernen, at sikre, at spidsen af mikro-sprøjte 0,46 mm bageste og 0,25 mm lateral til bregma og 5,7 mm dybt fra overfladen af kraniet.
- Injicere 500 nL af rAAV (50 nL min-1) i SCN, forlader mikro-sprøjte i sted i 10 min efter injektion til at sikre komplet diffusion af rAAV.
- Langsomt trække mikro-sprøjte.
- Indsæt den optiske fiber i området SCN.
- Ved hjælp af en optisk fiber kniv, skåret en fiber 17-mm i længden, og sørg for, at hver side af den optiske fiber er glat.
- Indsæt den optiske fiber i den keramiske Doppsko og lave den optiske fiber til et keramisk Doppsko med methylethylketon peroxid (AB lim), sikrer, at overflader af optisk fiber og keramiske Doppsko flush.
- Ren fiber med en kold sterilant løsning eller ethylen oxid.
- Efter rAAV injektion (trin 3.1.11), skal du indsætte den keramiske Doppsko-holdige optisk fiber i SCN.
- Lave keramiske Doppsko og optisk fiber på kraniet ved hjælp af dental harpiks og lad tørre.
- Smøre overfladen af dental harpiks med tilbage neglelak. Gentag de procedurer, der er skitseret i 3.1.2 til 3.2.5, udelade de faktiske injektion af rAAV for kontrol.
- Postoperative pleje
- Give mus med postoperativ smertestillende midler, såsom buprenorphin 2 mg/kg legemsvægt, subkutant, to gange om dagen.
- Placere mus i en recovery bur, mens de kommer ud af anæstesi.
- Hus mus individuelt under en 12t lys/mørke tilstand (lysintensitet ~ 100 lux i bunden af buret) med mad/vand tilgængelig ad libitum. Otte dage skal tildeles før yderligere eksperimenter til at give mulighed for tilstrækkelig restitutionstid og sikre optimal fluorescens reporter udtryk.
4. in vivo fluorescens Signal overvågning og dataindsamling
- Otte dage efter operationen, Tilslut fiber på musen hovedet med fluorescens signal skærm (fx., Gene Observer). Kontrollere fluorescens signal i SCN kontrol mus at etablere baggrunden signal. Foretage observation og måling af dette signal ved hjælp af fluorescens signal skærm.
- Evaluere fluorescens signal af eksperimentelle mus med den samme operation af kontrol mus. Udelukke mus der har fået den virale vektor, men som kun vise baggrunden signalet fra analyse, da dette sandsynligvis indikerer, at spidsen af den optiske fiber har savnet SCN. Efter disse indledende foranstaltninger, skal du returnere mus til deres hjem bure i en anden 3 uger til at tillade fluorescens signalet til at stabilisere.
- Efter 3 uger, skal du tilslutte mus med fluorescens signal skærm. Måle fluorescens for 15 s hver 10 min ved en frekvens på 100 Hz. Under disse målinger er musene frit bevægeligt i deres bure med mad/vand tilgængelig ad libitum. Bruge en lysintensiteten på bunden af buret af ~ 100 lux, og en laser power på spidsen af den optiske fiber mellem 15-20 µW.
- Efter afslutningen af alle optagelser, perfuse mus med 4% PARAFORMALDEHYD, og fjerne og skær hjerner for at kontrollere placeringen af optisk fiber. Udelukke mus fra analyse, hvis den optiske fiber spids ikke er korrekt implanteret i SCN.
5. dataanalyse og præsentation
- Foranstaltning fluorescens signal hver 10 min. til 15 s, ved en frekvens på 100 Hz, at give 1500 datapunkter. Gennemsnittet af disse 1500 punkter svarer til fluorescens signal på ethvert givet tidspunkt. Plotte flere gennemsnit over tid producerer et signal til anden kurve, som svarer til transcriptional rytmen af Cry1 under en kontrol lysforhold i SCN frit flytte mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescens reporter design af Cry1 var show i figur 1A. Ved anvendelse af metode beskrevet ovenfor, 500 nL rAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 var med held injiceres SCN af en voksen mus og udstillet robust Venus udtryk (figur 1B, 1 C). Fluorescens signaler registreres under 12h / 12h lys/mørke (LD) og mørke og mørke (DD) betingelser (figur 2) givet robuste døgnrytme i begge betingelser. Endelig, fluorescens signal blev indspillet i lange og korte lysperiode betingelser (figur 3).
Figur 1. Fluorescens reporter design og det udtryk i SCN
(A) Fluorescens reporter design af Cry1. (B) Photomicrograph af musen hjernen viser reporter udtryk 8 dage efter virus injektion. (C) forstørrelse af området boxed i rødt på photomicrograph vist i (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fluorescens i vivo optagelse i SCN LD-DD betingelser
(A) baggrund fluorescens i SCN viser ingen påviselige rytme på både LD og DD betingelser. De hvide og grå områder angiver lys-on og lys-off perioder, henholdsvis. (B) P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 udtryk i løbet af 7 dage i en 12-12 LD tilstand og 7 dage i en DD tilstand. (C) analyse af døgnrytme i LD betingelse (~24.4 h); den røde linje angiver de konvergerede passer i sinus kurve (resultatet af pasformen er vist i panelet til venstre). (D) analyse af døgnrytme i DD betingelse (~23.25 h); den røde linje angiver de konvergerede passer i sinus kurve (resultatet af pasformen er vist i panelet til venstre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. In vivo fluorescens optagelser i SCN under 20-4 lange og 4-20 kort lysperiode betingelser
Eksempel på en fluorescens optagelse af P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 udtryk i SCN i 7 dage under 12-12 LD betingelse, efterfulgt af 7 dage på en 20-4 lange lysperiode betingelse, 3 dage på en DD betingelse, 3 dage på en 12-12 LD betingelse, og derefter 7 dage på et 4-20 kort lysperiode betingelse. Hvide og grå områder angiver de lys-on og lys-off perioder, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Specifikke reagenser kræves for protokollen (Se Tabel af materialer)
| primer navn | sekvens | ||
| primer F1 | cactaggggttcctgcggccgcACGCGTGTAAAGATGCACATGTG | ||
| primer R1 | TTGTAACCTTGATACTTACCTACTTAGATCGCAGATCTCGTCCGG | ||
| primer F2 | GTTATGACACAGTGTAGAAACTATGGCATAGGACAGATGACTGTG | ||
| primer R2 | CATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGGGTACCtCTTGACAGCTCTACC | ||
| primer F3 | ctgtattttcagggcCCTGCAGGtGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG | ||
| primer R3 | TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC | ||
| primer F4 | GCATGGACGAGCTGTACAAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG | ||
| primer R4 | tgatatcgaattcGGATCCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC | ||
Tabel 2. Primer anvendes i protokollen
Tabel 3. DNA sekvens anvendes i protokollen venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I modsætning til ex vivo metoder, såsom skive kultur4,5, RT-PCR16, og i situ hybridisering17, der kræver, at dyrene aflives, den i vivo optagelse metode giver mulighed for efterforskere at studere døgnrytmen genekspression i et levende dyr. Som sådan, giver denne teknologi mulighed for at evaluere effekten af forskellige fysiske forstyrrelser (fx, søvn, stress, fødeindtagelse, etc.) på neurale døgnrytmen uret. I modsætning til i vivo bioluminescens7,8,10 metode, der kan kun arbejde i konstant mørke betingelser, fluorescens i vivo optagelse metode kan anvendes under lys betingelser-en vigtig fordel af teknologi som lys signaler re medrivning af SCN døgnrytmen ur18. Selvom forholdsvis konstant, robust døgnrytmen kan påvises med denne metode, det bør nævnes at reporter teknologien giver ikke kvantitative oplysninger og kan derfor ikke bruges til at måle niveauet af genet transskription og Oversættelse.
Der er mange kritiske trin af denne protokol. Koncentreret rAAV titer bør være så høj som 2-8 x 1012 viruspartikler pr. mL; lavere viral titers ville give off dim eller endda målbart fluorescens signaler. Ved fastsættelsen af lederen af musen ind af stereotaxisk apparatur, sikre, at kraniet er vandret til at sikre præcis positionering for virus injektion og optisk fiber implantation. Indsprøjtning af virus bør ske langsomt (≤50 nL min-1) til at sikre, at virussen forbliver i SCN. Keramisk Doppsko og optisk fiber bør fastsættes sikkert på kraniet og dental harpiks bør ikke kontakte huden. Hvis den keramiske Doppsko og optisk fiber ikke er tilstrækkeligt fast, vil de gradvist løsne sig fra musen hovedet.
Denne teknik kan udvides til at omfatte andre gen journalister (f.eks. Per2, Bmal1, c-Fos, Pomc, osv.) ved at ændre initiativtageren og den tilsvarende intron19. Ved at vende den flag-inton336-Venus-NLS-D2 kassette med to omvendte lox sekvenser og kombinere reporter med en Cre mus linje, kan denne teknologi bruges til at registrere aktivitet i specifikke neuroner. For eksempel, kombinerer denne tilgang med en Vip-cre mus linje ville give mulighed for optagelse af Cry1 transcriptional rytmer i vasoaktive intestinal polypeptid-udtrykker neuroner i SCN. Denne metode kan også anvende GCaMP6 som en Ca2 + indikator til at optage Ca2 + -døgnrytme i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Vi takke medlemmerne i Zhang lab for at give stimulerende diskussioner og medlemmer i Zhan laboratoriet for teknisk bistand. Denne forskning blev støttet af tilskud 31500860 (til C.Z.) af NSFC, 2012CB837700 (til E.E.Z. og C.Z.) af programmet 973 fra M.O.S.T. i Kina, og af midler fra Beijing Municipal regering. E.E.Z. blev støttet af kinesiske "Rekruttering Program af Global Ungdom eksperter".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R.
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E.
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
