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Neuroscience

वीवो में माउस Suprachiasmatic नाभिक में Circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति की निगरानी प्रतिदीप्ति पत्रकारों का उपयोग

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/56765
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1PTN Joint Graduate Program, School of Life Sciences, Peking University, 2National Institute of Biological Sciences, Beijing

Summary

यह नव विकसित प्रतिदीप्ति आधारित प्रौद्योगिकी के suprachiasmatic नाभिक में circadian घड़ी जीन की प्रतिलेखन की लंबी अवधि की निगरानी सक्षम बनाता है (SCN) आज़ादी से वास्तविक समय में चूहों चलती है और एक उच्च लौकिक संकल्प पर ।

Abstract

इस तकनीक ऑप्टिकल फाइबर मध्यस्थता प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग रिकॉमबिनेंट adeno-जुड़े वायरस आधारित जीन पत्रकारों के सटीक वितरण के साथ जोड़ती है. इस नए और आसान vivo प्रतिदीप्ति मॉनिटरिंग सिस्टम में उपयोग करने के लिए घड़ी जीन के transcriptional ताल रिकॉर्ड विकसित किया गया था, Cry1, स्वतंत्र रूप से चलती चूहों के suprachiasmatic नाभिक (SCN) में. ऐसा करने के लिए, एक Cry1 प्रतिलेखन प्रतिदीप्ति रिपोर्टर डिजाइन और Adeno में पैक-जुड़े वायरस था । शुद्ध, केंद्रित वायरस माउस SCN में इंजेक्शन एक ऑप्टिक फाइबर, जो तब मस्तिष्क की सतह पर तय किया गया था की प्रविष्टि के बाद किया गया था । जानवरों को अपने घर पिंजरों को लौट रहे थे और एक 1 महीने के बाद ऑपरेटिव वसूली अवधि के लिए पर्याप्त रिपोर्टर अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने की अनुमति दी । प्रतिदीप्ति तो आज़ादी से चलती चूहों में एक के माध्यम से दर्ज किया गया था vivo निगरानी प्रणाली है कि हमारे संस्थान में निर्माण किया गया था । vivo रिकॉर्डिंग सिस्टम में , एक ४८८ एनएम लेजर के लिए एक 1 × 4 बीम के साथ युग्मित-अलगानेवाला कि समान शक्ति के चार लेजर उत्तेजना outputs में प्रकाश विभाजित किया गया था । इस सेटअप हमें एक साथ चार जानवरों से रिकॉर्ड करने के लिए सक्षम होना चाहिए । उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेतों में से प्रत्येक एक photomultiplier ट्यूब और एक डेटा अधिग्रहण कार्ड के माध्यम से एकत्र किया गया था । vivo circadian घड़ी रिकॉर्डिंग तकनीक में पिछले bioluminescence के विपरीत, vivo रिकॉर्डिंग सिस्टम में इस प्रतिदीप्ति प्रकाश चक्र के दौरान circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति की रिकॉर्डिंग की अनुमति दी ।

Introduction

स्तनधारी में, suprachiasmatic नाभिक (SCN) पूरे शरीर की circadian लय को नियंत्रित करने के लिए एक व्यक्ति की प्रतिक्रिया exogenous पर्यावरण परिवर्तन (जैसे, प्रकाश, तापमान, तनाव, आदि)1समंवय । कोर घड़ी घटकों Per1-3, Cry1-2, घड़ी, और Bmal1से मिलकर बनता है, और प्रत्येक कोशिका के circadian घड़ी को विनियमित करने में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । SCN में प्रत्येक कोशिका transcriptional उत्प्रेरक, घड़ी/BMAL1, जो प्रति और रोने की अभिव्यक्ति पैदा करने के लिए एक heterodimer के रूप में कार्य करता है शामिल हैं । प्रति/रोना परिसर तो घड़ी/BMAL1 के समारोह के लिए एक प्रतिलेखन-अनुवाद राय पाश है कि के बारे में 24 h2,3पूरा करने के लिए लेता फार्म को रोकता है ।

SCN पर पिछले अध्ययन मुख्य रूप से पूर्व vivo SCN स्लाइस संस्कृति विधि4,5,6 कार्यरत है और, जबकि इस दृष्टिकोण मूल्यवान जानकारी प्रदान की गई है, अपनी सीमाओं को हमारे करने की क्षमता को बाधित किया है SCN पर अन्य मस्तिष्क नाभिक के प्रभाव के बारे में डेटा प्राप्त करें, साथ ही इस महत्वपूर्ण क्षेत्र में रहने वाले कोशिकाओं पर exogenous उत्तेजनाओं (जैसे, प्रकाश) के प्रभाव के रूप में. २००१ में, हितोशी है Okamura समूह सबसे पहले bioluminescence प्रणाली में vivo मॉनिटर circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति में SCN में स्वतंत्र रूप से चूहों7ले जाने के लिए उपयोग किया गया था । केन-इची है Honma समूह पिछले कुछ वर्षों बिताया है आगे SCN8,9,10में vivo रिकॉर्डिंग प्रणाली में bioluminescence के विकास । साथ में, इन अध्ययनों ने शोधकर्ताओं को लगातार अंधेरे में या हल्की नाड़ी के बाद circadian घड़ी की निगरानी करने की क्षमता प्रदान की है । हालांकि, क्योंकि bioluminescence भी प्रकाश/अंधेरे चक्र के दौरान सतत निगरानी के लिए अनुमति देने के लिए मंद है, तथ्य यह है कि प्रकाश प्रमुख SCN-circadian घड़ियों11की मध्यस्थता entrainment के लिए आवश्यक संकेत है के साथ युग्मित, वहां है प्रयोगात्मक तरीकों के विकास के लिए बढ़ती मांग है जो bioluminescence रिकॉर्डिंग के साथ जुड़े सीमाओं को दूर । वर्तमान रिपोर्ट में एक प्रतिदीप्ति-आधारित प्रणाली का वर्णन है जिसका निर्माण SCN की circadian घड़ी में vivo में स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में निगरानी के लिए किया गया था. यह आसान करने के लिए उपयोग विधि प्रकाश/अंधेरे चक्र के दौरान सतत निगरानी परमिट और वास्तविक समय में और उच्च लौकिक संकल्प में SCN में circadian घड़ी जीन की प्रतिलिपि की लंबी अवधि के अवलोकन के लिए अनुमति देता है ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाएं चीन के अशासकीय विनियमों के अनुसार राष्ट्रीय जैव विज्ञान संस्थान, बीजिंग के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) की स्वीकृति के साथ आयोजित की गई थीं ।

1. Cry1 प्रतिदीप्ति रिपोर्टर का निर्माण

नोट: पिछले circadian अध्ययन bioluminescence प्रणाली2,12,13 फ्यूज एक अस्थिर luciferase (dLuc) के साथ एक circadian प्रमोटर लयबद्ध dLuc अभिव्यक्ति प्रेरित का उपयोग कर । एक प्रतिदीप्ति रिपोर्टर विकसित करने के लिए, अस्थिर luciferase अस्थिर प्रतिदीप्ति प्रोटीन (dVenus) के साथ लयबद्ध dVenus अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए प्रतिस्थापित किया गया था । पी (Cry1)-डीवीनस रिपोर्टर की पीढ़ी के नीचे वर्णित है, जो की निर्माण वर्तमान में Addgene के लिए प्रस्तुत किया जा रहा है और शैक्षणिक उपयोग के लिए जल्द ही उपलब्ध हो जाएगा ।

  1. कार्यात्मक माउस बढ़ाना Cry1 प्रमोटर (+ ३२८ के लिए-१२०८ Cry1 जीन के बीपी क्षेत्र, प्रतिलेखन प्रारंभ साइट ' '-1 ' ' के रूप में नामित) । पीसीआर एंजाइम का प्रयोग करें (KOD प्लस नव), प्राइमरों F1 और R1 ( 2 तालिकादेखें), एक टेम्पलेट के रूप में माउस जीनोम और निर्माता की पीसीआर प्रोटोकॉल Cry1 प्रवर्तक डीएनए टुकड़ा बढ़ाना.
  2. बढ़ाना intron ३३६ के Cry1 जीन है, जो Cry114के circadian घड़ी समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. intron ३३६ डीएनए टुकड़ा बढ़ाना करने के लिए एक टेम्पलेट और निर्माता के पीसीआर प्रोटोकॉल के रूप में पीसीआर एंजाइम, प्राइमर्स F2 और R2, माउस जीनोम का उपयोग करें ।
  3. शुक्रबढ़ाना । शुक्र डीएनए अंश को बढ़ाना के लिए पीसीआर एंजाइम, प्राइमरी F3 और R3, pVENUS-N1 प्लाज्मिड टेम्पलेट और निर्माता के पीसीआर प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करें ।
  4. एनएलएस-D2 डीएनए टुकड़ा बढ़ाना । एनएलएस-D2 डीएनए टुकड़ा बढ़ाना करने के लिए एक टेम्पलेट और निर्माता के पीसीआर प्रोटोकॉल के रूप में पीसीआर एंजाइम, प्राइमरों F4 और R4, pcdna 3.3-d2eGFP प्लाज्मिड का उपयोग करें ।
  5. एक्सॉन 1 के रूप में डीएनए टुकड़ा 1 संश्लेषित ।
  6. intron ३३६ और वीनस डीएनए टुकड़ा के बीच कड़ी के रूप में डीएनए टुकड़ा 2 संश्लेषित ।
  7. कट pAAV-EF1a-डबल floxed-hChR2 (H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA प्लाज्मिड और MluI एंजाइमों के साथ EcoRI वेक्टर । बड़ा डीएनए टुकड़ा शुद्ध करने के लिए जेल निष्कर्षण किट का प्रयोग करें । निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।
  8. एक गिब्सन विधानसभा मिश्रण और उसके मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करना, डीएनए टुकड़े के सभी इकट्ठा करने के लिए एक साथ pAAV-P (Cry1) का उत्पादन-intron336-वीनस-एनएलएस-D2-WPRE-HGHpA रिपोर्टर । निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।

2. Adeno-जुड़े वायरस का उत्पादन15

  1. निम् नलिखित प्लाज्मिड को तैयार करें DNA स्टॉक्स: ३१.२५ µ g ऑफ pRV1, ३१.२५ µ g ऑफ pH21, १२५ µ g ऑफ pFdelta6, और ६२.५ µ g ऑफ pAAV-P (Cry1)-intron336-वीनस-एनएलएस-D2-WPRE-HGHpA.
  2. 293T कोशिकाओं के ५ १५ cm व्यंजन तैयार करें और कोशिकाओं ९०% धाराप्रवाह बनने तक इंतजार ।
  3. अभिकर्मक एजेंट प्रोटोकॉल के बाद 297T कक्षों में plasmids Transfect । प्रत्येक डिश के लिए, pRV1 के ६.२५ µ g का उपयोग करें, ६.२५ µ g of pH21, 25 µ g of pFdelta6, १२.५ µ g of pAAV-P (Cry1)-intron336-वीनस-एनएलएस-D2-WPRE-HGHpA, और १२० µ l का अभिकर्मक रिएजेंट ।
  4. ७२ ज अभिकर्मक के बाद, एक पिपेट बंदूक का उपयोग कर प्रत्येक थाली से अलग कोशिकाओं; फसल २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में कोशिकाओं ।
  5. 10 मिनट के लिए ८०० x g पर कोशिकाओं को गोली और supernatant त्यागें । प्रत्येक ट्यूब में फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 20 मिलीलीटर रखकर कोशिकाओं को धो लें; 10 मिनट के लिए ८०० x g पर कोशिकाओं गोली, और supernatant त्यागें ।
  6. १५० mm NaCl और 20 मिमी Tris समाधान में छर्रों reसस्पेंड, पीएच ८.०; समाधान के 25 मिलीलीटर ट्यूब/ प्रत्येक ट्यूब के लिए नए सिरे से तैयार 10% सोडियम deoxycholate (डीएच2ओ में) की १.२५ मिलीलीटर जोड़ें । प्रति मिलीलीटर ५० इकाइयों की एक अंतिम एकाग्रता के लिए benzonase nuclease जोड़ें, और अच्छी तरह से मिश्रण । 1 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  7. 15 मिनट के लिए ३००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सेलुलर मलबे निकालें । इसके अलावा सुनिश्चित करें कि सभी मलबे एक ०.४५ माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से मिश्रण धक्का द्वारा हटा दिया गया है; यह चरण हेपरिन स्तंभों के ब्लॉकिंग को रोकने में मदद करेगा ।
  8. सिकुड़नेवाला पम्प का उपयोग करके हेपरिन कॉलम सेट करें; 1 मिलीलीटर/मिनट के लिए प्रवाह दर सेट करें, सुनिश्चित करना है कि कोई हवा बुलबुले कॉलम में पेश कर रहे हैं ।
  9. १५० मिमी NaCl, 20 मिमी Tris समाधान, पीएच ८.० के 10 मिलीलीटर के साथ कॉलम Equilibrate । प्रत्येक स्तंभ के लिए वायरस युक्त समाधान जोड़ें । एक १०० mm NaCl, 20 मिमी Tris समाधान, पीएच ८.० के 20 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो लें । फिर, एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग, एक २०० मिमी NaCl और 20 मिमी Tris समाधान पीएच ८.० के 1 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो, एक ३०० मिमी NaCl और 20 मिमी Tris समाधान की 1 मिलीलीटर के बाद, पीएच ८.० ।
  10. एक ४०० मिमी NaCl, 20 मिमी Tris समाधान, पीएच ८.० के 3 मिलीलीटर के साथ वायरस elute करने के लिए एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें, एक ४५० मिमी NaCl के 4 मिलीलीटर, 20 मिमी Tris समाधान, पीएच ८.० के बाद, और अंत में एक के द्वारा 3 मिलीलीटर ५०० मिमी NaCl , 20 मिमी Tris समाधान, पीएच ८.० । निकाली सामग्री ले लीजिए ।
  11. रिकॉमबिनेंट adeno-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) एकाग्रता के लिए, एक समय में निकाली सामग्री, 4 मिलीलीटर लोड, केंद्रापसारक फिल्टर इकाइयों में एक १००,००० आणविक वजन कटऑफ के साथ । प्रत्येक 4-एमएल नमूना २००० x g पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर, प्रवाह के माध्यम से खारिज ।
  12. जब सभी निकाली सामग्री केंद्रापसारक फिल्टर इकाइयों के माध्यम से चला गया है, पंजाब के 4 मिलीलीटर जोड़ने और लगभग २५० μL में मिश्रण केंद्रापसारक । निकालें rAAVs (वायरल titer के बारे में होना चाहिए 2-8 x 1012 प्रति मिलीलीटर वायरल कण) से केंद्रापसारक फ़िल्टर इकाइयों, aliquot और दुकान पर-८० ° c उपयोग तक । इस स्तर पर, वायरस कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

3. rAAV इंजेक्शन और वयस्क माउस SCN में ऑप्टिक फाइबर प्रविष्टि

  1. circadian प्रतिदीप्ति रिपोर्टर-SCN में rAAVs ले जाने के इंजेक्शन
    1. लोड 5 µ एल के rAAV (वायरस titer है के बारे में 2-8 x 1012 एक माइक्रो सिरिंज में प्रति वायरस कणों).
    2. Anesthetize एक वयस्क माउस (2-5 महीने पुराने, C57BL/intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से Nembutal (८० मिलीग्राम/किग्रा) के साथ । एक पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण के पर्याप्त गहराई के लिए जाँच करें ।
    3. माउस के सिर से फर को हटाने के लिए कैंची का प्रयोग करें और फिर एक stereotaxic तंत्र में माउस माउंट । एक परिचालित गर्म पानी कंबल या एक और हीटिंग डिवाइस के माध्यम से anesthetized पशुओं के लिए एक गर्मी स्रोत प्रदान करें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, फर को हटाने के लिए लोमनाशक क्रीम या बिजली के बाल कतरनी का उपयोग करें ।
    4. उचित संक्रमित एजेंटों के साथ सर्जिकल साइट को साफ । उदाहरण के लिए, यह बाँझ पानी या अल्कोहल और आयोडीन, betadine, या बारी सफ़ाई में chlorhexidine पतला शामिल हो सकते हैं । दोहराएं कम से 3 बार । शल्य साइट कपड़ा ।
    5. खोपड़ी में एक चीरा बनाने के लिए और खोपड़ी बेनकाब करने के लिए कैंची का उपयोग करें ।
    6. stereotaxic तंत्र को समायोजित करें ताकि bregma और लैंब्डा एक ही क्षैतिज विमान में हों; एक ही क्षैतिज विमान में bregma के दो सममित अंक बनाओ ।
    7. एक बाँझ कपास झाड़ू 4% एच2में लथपथ का उपयोग करें हे२/H२हे ब्रेन periosteum को जीर्णशीर्ण होते. फिर एक साफ, बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए स्पष्ट और खोपड़ी की सतह सूखी ।
    8. एक माइक्रो ड्रिल का उपयोग करना, एक छेद के बारे में 1 मिमी व्यास में ०.४६ mm पीछे और ०.२५ mm bregma करने के लिए पार्श्व ।
    9. फ़ाई मस्तिष्क के उजागर सतह से हड्डी के टुकड़े स्पष्ट करने के लिए शारीरिक खारा समाधान के साथ एक साफ कपास बाँझ झाड़ू का उपयोग करें ।
    10. एक माइक्रो-मस्तिष्क में सिरिंज डालें, सुनिश्चित करना है कि माइक्रो सिरिंज की नोक ०.४६ mm पीछे और ०.२५ mm bregma करने के लिए पार्श्व है, और ५.७ मिमी खोपड़ी की सतह से गहरी.
    11. SCN में rAAV (५० nL मिन-1) के ५०० nL सुई, माइक्रो-10 मिनट के लिए जगह में इंजेक्शन के बाद rAAV का पूरा प्रसार सुनिश्चित करने के लिए छोड़ सिरिंज ।
    12. धीरे से माइक्रो सिरिंज वापस ले लो ।
  2. SCN क्षेत्र में ऑप्टिकल फाइबर डालें ।
    1. एक ऑप्टिकल फाइबर चाकू का उपयोग करना, लंबाई में एक फाइबर 17 मिमी कटौती, यकीन है कि ऑप्टिक फाइबर के प्रत्येक पक्ष चिकनी है बना.
    2. सिरेमिक सामी में ऑप्टिक फाइबर डालें और मिथाइल एथिल कीटोंन पेरोक्साइड (अब गोंद) के साथ एक सिरेमिक सामी को ऑप्टिक फाइबर ठीक करें, यह सुनिश्चित करना कि ऑप्टिकल फाइबर और सिरेमिक सामी की सतहों को फ्लश कर रहे हैं ।
    3. एक ठंडी बाँझ समाधान या ईथीलीन ऑक्साइड के साथ फाइबर साफ ।
    4. rAAV इंजेक्शन (step 3.1.11) के बाद, SCN में सिरेमिक सामी-युक्त ऑप्टिक फाइबर डालें ।
    5. खोपड़ी पर सिरेमिक सामी और ऑप्टिकल फाइबर दंत राल का उपयोग कर ठीक करें और शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    6. पीठ नेल पॉलिश के साथ दंत राल की सतह धब्बा । 3.2.5 करने के लिए 3.1.2 में उल्लिखित प्रक्रियाओं को दोहराएँ, नियंत्रण के लिए rAAV के वास्तविक इंजेक्शन को छोड़.
  3. शल्य चिकित्सा के बाद देखभाल
    1. एक दिन में दो बार, चमड़े के नीचे, buprenorphine 2 मिलीग्राम/kg शरीर के वजन के रूप में पोस्ट ऑपरेटिव एनाल्जेसिक के साथ चूहों प्रदान करते हैं ।
    2. एक वसूली पिंजरे में जगह चूहों जबकि वे संज्ञाहरण से बाहर आते हैं ।
    3. घर चूहों के तहत व्यक्तिगत रूप से एक 12 ज प्रकाश/अंधेरे हालत (प्रकाश तीव्रता ~ १०० लक्स पिंजरे के नीचे) के साथ भोजन/पानी उपलब्ध विज्ञापन libitum। आठ दिन आगे प्रयोग से पहले आवंटित किया जाना चाहिए पर्याप्त वसूली समय के लिए अनुमति देने के लिए और इष्टतम प्रतिदीप्ति रिपोर्टर अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए ।

4. vivo प्रतिदीप्ति सिग् मॉनीटरिंग और डेटा कलेक् शन में

  1. आठ दिन सर्जरी के बाद, प्रतिदीप्ति सिग्नल मॉनिटर (जैसे, जीन पर्यवेक्षक) के साथ माउस सिर पर फाइबर कनेक्ट । पृष्ठभूमि संकेत स्थापित करने के लिए नियंत्रण चूहों के SCN में प्रतिदीप्ति संकेत की जाँच करें. निरीक्षण और प्रतिदीप्ति संकेत मॉनिटर का उपयोग कर इस संकेत के माप का संचालन ।
  2. नियंत्रण माउस की ही कार्रवाई के साथ प्रायोगिक माउस के प्रतिदीप्ति संकेत का मूल्यांकन करें । चूहों जो वायरल वेक्टर प्राप्त हुआ है, लेकिन जो केवल विश्लेषण से पृष्ठभूमि संकेत प्रदर्शित, के रूप में इस संभावना का संकेत है कि ऑप्टिक फाइबर की नोक SCN याद किया है बाहर । इन प्रारंभिक उपायों के बाद, एक और 3 सप्ताह के लिए अपने घर पिंजरों के लिए चूहों प्रतिदीप्ति संकेत को स्थिर करने की अनुमति देते हैं ।
  3. 3 सप्ताह के बाद, प्रतिदीप्ति संकेत मॉनिटर के साथ चूहों कनेक्ट. १०० हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर, 15 एस हर 10 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति को मापने. इन मापन के दौरान चूहे आज़ादी से अपने पिंजरों में भोजन/पानी उपलब्ध विज्ञापन libitumके साथ घूम रहे हैं । ~ १०० लक्स के पिंजरे के तल पर एक प्रकाश की तीव्रता का प्रयोग करें, और 15-20 µW के बीच ऑप्टिक फाइबर की नोक पर एक लेजर शक्ति ।
  4. सभी रिकॉर्डिंग के पूरा होने के बाद, perfuse चूहों 4% paraformaldehyde के साथ, और हटाने और ऑप्टिक फाइबर की नियुक्ति की जाँच करने के लिए दिमाग टुकड़ा. अगर ऑप्टिक फाइबर टिप सही SCN में प्रत्यारोपित नहीं है विश्लेषण से चूहों को बाहर निकालें ।

5. डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति

  1. उपाय प्रतिदीप्ति संकेत हर 10 मिनट के लिए 15 एस, १०० हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर, १५०० डेटा अंक प्राप्ति के लिए. इन १५०० अंक का औसत किसी भी समय बिंदु पर प्रतिदीप्ति संकेत करने के लिए अनुवाद करता है । समय के साथ कई औसत की साजिश रचने एक संकेत करने वाली समय वक्र जो स्वतंत्र रूप से चलती चूहों के SCN में एक नियंत्रण प्रकाश हालत के तहत Cry1 के transcriptional ताल से मेल खाती है पैदा करता है ।

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Representative Results

प्रतिदीप्ति रिपोर्टर डिजाइन ऑफ Cry1 फिगर 1aमें दिखा था । ऊपर विस्तृत दृष्टिकोण का उपयोग करना, ५०० nL के rAAV-P (Cry1)-intron336-वीनस-एनएलएस-D2 सफलतापूर्वक एक वयस्क माउस के SCN में इंजेक्ट किया गया था, और मजबूत वीनस अभिव्यक्ति (चित्रा 1b, 1C) का प्रदर्शन. 12घं/12घं light/डार्क (LD) और डार्क/डार्क (DD) शर्तों (चित्रा 2) के तहत दर्ज प्रतिदीप्ति संकेतों दोनों स्थितियों में मजबूत circadian लय झुकेंगे । अंत में, प्रतिदीप्ति सिग्नल लंबी और छोटी photoperiod स्थितियों (चित्रा 3) में दर्ज किया गया था ।

Figure 1
चित्र 1. प्रतिदीप्ति रिपोर्टर डिजाइन और यह SCN में अभिव्यक्ति
(क) Cry1के प्रतिदीप्ति रिपोर्टर डिजाइन । (ख) माउस मस्तिष्क के Photomicrograph रिपोर्टर अभिव्यक्ति 8 दिन बाद वायरस इंजेक्शन । (ग) (ख) में दर्शाए गए photomicrograph पर लाल रंग में बॉक्स्ड क्षेत्र का इज़ाफ़ा. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. प्रतिदीप्ति में vivo रिकॉर्डिंग में LD और डीडी शर्तों के तहत SCN
(क) दोनों LD और डीडी शर्तों के तहत कोई पता लगाने की लय दिखा SCN में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति । सफेद और भूरे रंग के क्षेत्रों क्रमशः प्रकाश पर और प्रकाश-ऑफ पीरियड, संकेत मिलता है । (ख) पी (Cry1)-intron336-वीनस-एनएलएस-D2 अभिव्यक्ति एक 12-12 LD हालत में 7 दिनों के पाठ्यक्रम पर और एक डीडी हालत में 7 दिन । (ग) LD हालत में circadian ताल का विश्लेषण (~ २४.४ ज); लाल लाइन साइन वक्र में एकाग्र फिट इंगित करता है (फिट का परिणाम बाएं पैनल में दिखाया गया है) । (घ) डीडी दशा में circadian लय का विश्लेषण (~ २३.२५ ज); लाल लाइन साइन वक्र में एकाग्र फिट इंगित करता है (फिट का परिणाम बाएं पैनल में दिखाया गया है) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. 20-4 के तहत SCN में vivo प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग में लॉन्ग और 4-20 शॉर्ट photoperiod की शर्तें
P (Cry1) की एक प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग का उदाहरण-intron336-वीनस-एनएलएस-D2 अभिव्यक्ति SCN में एक 12-12 ld शर्त के तहत 7 दिनों के लिए, एक 20-4 लंबे photoperiod हालत के तहत 7 दिनों के बाद, एक डीडी हालत के तहत 3 दिन, एक 12-12 ld शर्त के तहत 3 दिन, और फिर एक 4-20 लघु photoperiod हालत के तहत 7 दिन । सफ़ेद और धूसर क्षेत्र क्रमशः प्रकाश-ऑन और लाइट-ऑफ़ पीरियड्स को इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1. प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक विशिष्ट रिएजेंट ( सामग्री तालिकादेखें)

प्राइमरी का नाम अनुक्रम
प्राइमर F1 cactaggggttcctgcggccgcACGCGTGTAAAGATGCACATGTG
प्राइमर R1 TTGTAACCTTGATACTTACCTACTTAGATCGCAGATCTCGTCCGG
प्राइमर F2 GTTATGACACAGTGTAGAAACTATGGCATAGGACAGATGACTGTG
प्राइमरी R2 CATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGGGTACCtCTTGACAGCTCTACC
प्राइमर F3 ctgtattttcagggcCCTGCAGGtGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG
प्राइमर R3 TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
प्राइमर F4 GCATGGACGAGCTGTACAAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG
प्राइमरी R4 tgatatcgaattcGGATCCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC

तालिका 2. प्राइमर प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया

तालिका 3. डीएनए अनुक्रम प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

इस तरह के स्लाइस संस्कृति4,5, आर टी-पीसीआर16, और सीटू संकरण17 में , जो कि जानवरों को मार डाला जा की आवश्यकता के रूप में पूर्व vivo तरीकों, के विपरीत, vivo रिकॉर्डिंग विधि में अनुमति देता है एक जीवित पशु में circadian जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए जांचकर्ताओं । जैसे, इस प्रौद्योगिकी तंत्रिका circadian घड़ी पर विभिन्न शारीरिक perturbations के प्रभाव का मूल्यांकन करने की क्षमता प्रदान करता है (जैसे, नींद अभाव, तनाव, भोजन का सेवन, आदि). के विपरीत में vivo bioluminescence7,8,10 विधि है कि केवल लगातार अंधेरे परिस्थितियों में काम कर सकते हैं, vivo रिकॉर्डिंग विधि में प्रतिदीप्ति प्रकाश के तहत लागू किया जा सकता शर्तें-प्रकाश संकेतों के रूप में प्रौद्योगिकी का एक महत्वपूर्ण लाभ re-entrainment SCN circadian घड़ी18. हालांकि अपेक्षाकृत स्थिर, मजबूत circadian लय इस पद्धति के साथ पता लगाया जा सकता है, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि रिपोर्टर प्रौद्योगिकी मात्रात्मक जानकारी प्रदान नहीं करता है और इसलिए जीन प्रतिलेखन के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है और अनुवाद.

इस प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण कदम हैं । ध्यान केंद्रित rAAV titer के रूप में उच्च के रूप में होना चाहिए 2-8 x 10 प्रति मिलीलीटर वायरल कणों; लोअर वायरल titers मंद या यहां तक कि undetectable प्रतिदीप्ति संकेतों से देना होगा । जब stereotaxic तंत्र में माउस के सिर फिक्सिंग, सुनिश्चित करें कि खोपड़ी वायरस इंजेक्शन और ऑप्टिकल फाइबर आरोपण के लिए सही स्थिति सुरक्षित करने के लिए क्षैतिज है । वायरस के इंजेक्शन धीरे किया जाना चाहिए (≤ ५० nL मिन-1) यह सुनिश्चित करने के लिए कि वायरस SCN में रहता है. सिरेमिक सामी और ऑप्टिकल फाइबर सुरक्षित रूप से खोपड़ी पर तय किया जाना चाहिए और दंत राल त्वचा से संपर्क नहीं करना चाहिए । यदि सिरेमिक सामी और ऑप्टिकल फाइबर पर्याप्त रूप से तय नहीं कर रहे हैं, वे धीरे से माउस सिर से अलग होगा ।

इस तकनीक को प्रवर्तक और इसी intron19को बदलकर अन्य जीन रिपोर्टर (जैसे, Per2, Bmal1, सी-फोस, Pomc आदि) को भी शामिल किया जा सकता है. झंडा पलटने से-inton336-वीनस-एनएलएस-D2 कैसेट दो उलट लोक्स दृश्यों के साथ और एक Cre माउस लाइन के साथ रिपोर्टर के संयोजन, इस तकनीक को विशिष्ट ंयूरॉंस में गतिविधि रिकॉर्ड किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक वीआईपी-cre माउस लाइन के साथ इस दृष्टिकोण के संयोजन vasoactive आंत्र पॉलीपेप्टाइड में Cry1 transcriptional लय की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति होगी SCN में ंयूरॉंस व्यक्त । इस विधि भी सीए 2 + संकेतक मस्तिष्क में ca2 + circadian ताल रिकॉर्ड करने के लिए के रूप में GCaMP6 को रोजगार कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए उत्तेजक चर्चाएं और Zhan लैब में सदस्यों को उपलब्ध कराने के लिए झांग लैब में सदस्यों को धंयवाद । इस शोध का समर्थन किया गया था अनुदान ३१५००८६० (C.Z.) के NSFC, 2012CB837700 (करने के लिए E.E.Z. और C.Z.) चीन के M.O.S.T. से ९७३ कार्यक्रम के, और बीजिंग नगर निगम सरकार से धन द्वारा । E.E.Z. चीनी "वैश्विक युवा विशेषज्ञों की भर्ती कार्यक्रम" द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD Plus Neo TOYOBO KOD-401 Reagent
pVENUS-N1 addgene #61854 Plasmid
pcDNA3.3_d2eGFP addgene #26821 Plasmid
pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA addgene #20297 Plasmid
MluI Thermo Scientific FD0564 Reagent
EcoRI Thermo Scientific FD0274 Reagent
Gibson Assembly Mix NEB E2611s Reagent
Lipofectamine 2000 Thermo Scientific 12566014 Reagent
Syringe Filter EMD Millipore SLHV033RS 0.45 µm 
HiTrap heparin columns gelifesciences 17-0406-01 1 mL 
Amicon ultra-4 centrifugal filter EMD Millipore  UFC810024 100,000 MWCO
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 Reagent
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D5670 Make fresh solution for each batch
mouse stereotaxic apparatus B&E TEKSYSTEMS LTD #SR-5M/6M Equipment
pentobarbital SigmaAldrich #1507002 Reagent
mouse stereotaxic apparatus B&E TEKSYSTEMS LTD #SR-5M/6M Equipment
Hydrogen peroxide solution SigmaAldrich #216763 Reagent
Optical Fiber Thorlabs FT200EMT 0.39 NA, Ø200 µm
microsyringe pump Nanoliter 2000 Injector, WPI Equipment
ceramic ferrule Shanghai Fiblaser 230 μm I.D., 2.5 mm O.D.
Gene Observer BiolinkOptics Equipment

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References

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जौव में इस महीने अंक १३७ Circadian घड़ी Suprachiasmatic नाभिक प्रतिदीप्ति vivo में घड़ी जीन Cry1 आज़ादी से चलती
<em>वीवो में</em> माउस Suprachiasmatic नाभिक में Circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति की निगरानी प्रतिदीप्ति पत्रकारों का उपयोग
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Mei, L., Zhan, C., Zhang, E. E.… More

Mei, L., Zhan, C., Zhang, E. E. In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters. J. Vis. Exp. (137), e56765, doi:10.3791/56765 (2018).

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