En kvantitativ Dot Blot analys för AAV titrering och dess användning för funktionell bedömning av den Adeno-associerade Virus församling-aktiverande protein
Summary
Detta manuskript Detaljer en okomplicerad dot blot analys för kvantitering av adeno-associerade virus (AAV) titrar och dess tillämpning på studera roll församling-aktiverande protein (åtgärdsprogram), en ny klass av icke-strukturella virusproteiner Funna i alla AAV serotyper, att främja montering av förhoppningsvis härrör från cognate och heterologa AAV serotyper.
Abstract
Medan adeno-associerade virus (AAV) är allmänt accepterat som en attraktiv vektor för genterapi, tjänar också som en modell virus för att förstå virus biologi. I det senare avseendet har den senaste upptäckten av ett icke-strukturella AAV protein, kallas församling-aktiverande protein (AAP), kasta nytt ljus på processerna som är inblandade i församlingen av viral kapsid VP proteiner i en kapsid. Trots många AAV serotyperna kräver AAP för montering, vi har nyligen rapporterat att AAV4, 5, och 11 finns undantag från denna regel. Dessutom visade vi att åtgärdsprogram och sammansatta förhoppningsvis av olika serotyper lokalisera till olika subcellulär fack. Denna oväntade heterogenitet i biologiska egenskaper och funktionella roller av åtgärdsprogram bland olika AAV serotyp understreck vikten av studier på åtgärdsprogram som härrör från olika serotyper. Detta manuskript Detaljer en okomplicerad dot blot analys för AAV kvantifiering och dess tillämpning att bedöma AAP beroende och serotyp specificitet i kapsid församling. För att påvisa nyttan av denna dot blot analys, anges vi för att karakterisera kapsid församling och AAP beroendet av orm AAV, en tidigare uncharacterized reptil AAV, samt AAV5 och AAV9, som tidigare har visat sig vara AAP-oberoende och AAP-beroende serotyp, respektive. Analysen visade att orm AAV kapsid montering kräver orm AAP och inte kan främjas genom åtgärdsprogram från AAV5 och AAV9. Analysen visade också att, till skillnad från många av de vanliga serotypen åtgärdsprogram som främjar heterologa kapsid församlingen genom cross-komplettering, orm AAP inte främja montering av AAV9 förhoppningsvis. Dessutom visar vi att valet av nuclease avsevärt påverkar avläsningen av dot blot analysen, och att välja en optimal enzym är således avgörande för framgångsrik bedömning av AAV titrar.
Introduction
Adeno-associerade virus (AAV) är en liten, icke-höljebärande, enkelsträngat DNA-virus med en arvsmassa av ungefärligt 4.7 kilobases (kb). AAV genomet innehåller öppna-läsning ramar (ORFs) för rep och cap generna. I 2010, en tidigare oidentifierad ickestrukturella protein som kodas av en + 1 ram-skiftat ORF inom AAV2 cap genen upptäcktes av Sonntag et al. och befunnits spelar en avgörande roll i församlingen av AAV2 kapsid VP monomer proteiner till en viral kapsid1. Denna roman protein har utsetts församling-aktiverande protein (AAP) efter vilken roll den spelar för att främja kapsid församling1.
ORFs för AAP har varit identifierade bioinformatically i genomen hos alla parvovirus i släktet Dependoparvovirus, men inte inom genomen hos virus av olika släkten av parvovirus familj1,2. Funktionella studier av denna roman protein var ursprungligen inriktat på AAP från prototypen AAV2 (AAP2), som har etablerat den viktiga rollen som AAP2 i inriktning omonterad VP proteiner till nucleolus för deras ackumulering och bildning i fullt monterade förhoppningsvis1,3,4. De AAV2 förhoppningsvis oförmåga att montera i avsaknad av AAP uttryck har varit självständigt bekräftas av flera grupper, inklusive vår1,2,3,4,5 . Senare undersökningar på AAV serotyperna 1, 8 och 9 bekräftade åtgärdsprogram kritiska roll i kapsid församling, som VP3 monomer proteiner av AAV1, 8, och 9 kunde inte bilda en färdigmonterad kapsid i avsaknad av samtidig uttryck för AAP2.
Nyligen, genom strategier som omfattar användningen av kvantitativa dot blot analyser, vi undersökte AAV1 förmåga att 12 VP3 monomerer att montera in förhoppningsvis i avsaknad av AAP uttryck och AAP1 förmåga till 12 att främja montering av VP3 monomerer från heterologa serotyper. Denna studie har visat att AAV4, 5, och 11 VP3 monomerer kan montera utan AAP. Dessutom konstaterades att åtta av de tolvna AAP serotyperna vi granskat (dvsalla utom AAP4, 5, 11 och 12) visas en bred förmåga att stödja kapsid montering av heterologa AAV serotyp förhoppningsvis, medan AAP4, 5, 11 och 12 visas en väsentligen begränsad förmåga i detta hänseende6. Dessa fyra serotyperna är fylogenetiskt avlägsen från andra AAP serotyper2,3. Studien har dessutom avslöjat betydande heterogenitet i subcellulär lokaliseringar av olika åtgärdsprogram6. Studien har vidare föreslagit att snäva associering av AAP med sammansatta förhoppningsvis och nucleolus, kännetecknet för AAV2 kapsid församling, nödvändigtvis inte kan utvidgas till andra serotyper inklusive AAV5, 8 och 9, som visar nukleolära uteslutande av sammansatta förhoppningsvis6. Således, information från studien av någon särskild serotyp AAP inte är allmänt tillämpliga på alla AAP biologi. Sådan förbryllande karaktär av AAP biologi understryker behovet av att undersöka den roll och funktion av varje AAP från både kanoniska och icke-kanoniska AAV serotyper.
AAP biologiska roll i kapsid församlingen kan bedömas genom att var fullt-förpackade AAV-virus-partikeln titrarna produceras i mänskliga embryonala njurar (HEK) 293 celler, den vanligaste cellinje för AAV vektor produktion, med eller utan AAP protein uttryck. Standardmetoderna för AAV kvantitering är kvantitativ PCR (qPCR)-baserade analyser7,8 och kvantitativa dot blot-baserade analyser9. Andra metoder för AAV virus-partikeln kvantitering såsom glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analys10,11 eller optisk densitet mätning12 är inte idealiska för prover från många olika AAV serotyper eller prover förorenade med orenheter (rå lysates eller kultur media), som ofta är de prover som används för AAV forskning. För närvarande, används qPCR mest för AAV kvantitering; Det är dock nödvändigt att erkänna potentiella varningar för qPCR-baserad analys, som analysen kan leda till systemfel och betydande titer variationer13,14. PCR-baserade analyser påverkas av ett antal potentiellt störande faktorer, såsom förekomsten av kovalent stängt terminal hårnålar i PCR-mallar som hämmar förstärkning13. Även erfarna individ kan införa potential störfaktorer i en qPCR-baserade assay omedvetet13. Kvantitativa dot blot analyser finns däremot en klassisk molekylärbiologisk teknik som innebär inte genomet förstärkning och använder en mycket enklare princip med en minimal risk för fel jämfört med qPCR-baserade analyser. Metoden är mindre tekniskt utmanande; Analysens resultat är därför rimligen reproducerbara även av oerfarna personer.
I den här rapporten beskriver vi de metodologiska detaljerna för en kvantitativ dot blot analys vi rutinmässigt använder för AAV vektor kvantifiering och ge ett exempel på hur att tillämpa den analysmetod för att studera åtgärdsprogram församling-främjande roll gemensamt serotyp (AAV5 och AAV9) och tidigare uncharacterized AAP från Snake AAV14. I naturen, AAV VP proteiner och AAP proteiner uttrycks i cis från en enda gen (dvs, VP-AAP cis-komplettering), medan i analysen beskrivs här, VP och AAP proteiner levereras i trans från två separata plasmider (dvs.VP-AAP Trans-komplettering). Eftersom varje VP eller AAP protein från olika serotyper kan uttryckas från varje oberoende plasmid, blir det möjligt att testa heterologa VP-AAP kombinationer för kapsid församling (dvs, VP-AAP cross-komplettering). Kort, AAV VP3 från olika serotyper uttrycks i HEK 293 celler av plasmid DNA transfection att paketera en AAV vektor arvsmassa i närvaro eller frånvaro av cognate serotypen AAP eller i närvaro av ett heterologt serotyp AAP. Efter produktion, kultur media och cell lysates utsätts för en dot blot analys att kvantifiera det virala genomet inom kapsid skalet. Det första steget för dot blot analys är att behandla prover med en nuclease bort kontaminerande kontrollplasmid-DNA och oförpackade AAV genomen i prover. Underlåtenhet att göra detta skulle öka bakgrunden signalerna i synnerhet när orenat prover har analyserats. Detta följs sedan av en proteas behandling att bryta viral förhoppningsvis och släppa nuclease-resistenta virala genomer i provlösning. Nästa, virala arvsmassan är denaturerad, utplånas på ett membran och hybridiseras med en viral arvsmassa-specifika DNA sond för kvantitering. I exempel analysen redovisas här, visar vi att orm AAV VP3 kräver orm AAP för kapsid församling och att orm AAP inte främja montering av AAV9 förhoppningsvis till skillnad från många av de åtgärdsprogram som härrör från AAP-beroende serotyper som kan också främja montering av heterologa serotyp förhoppningsvis. Slutligen, Vi rapporterar en viktig varning till qPCR eller dot blot-baserade AAV kvantitering analyser att valet av nuclease avsevärt påverkar analysens resultat.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna rapport beskrivs nyttan av kvantitativa dot blot analyser att studera AAV åtgärdsprogram och deras roll i kapsid församling. Kunskap från dessa studier kan ge detaljerade insikter om medfödda skillnader håller på att AAV kapsid församling och den funktionella rollen för åtgärdsprogram mellan olika serotyper. I detta avseende AAV VP3-AAP cross-komplettering dot blot analys visade att orm AAV VP3 visas ett strikt beroende på samtidig uttryckt av dess cognate AAP för kapsid montering och att orm AAP int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Xiao Xiao vid University of North Carolina at Chapel Hill för att förse oss med pEMBL-CMV-GFP Plasmiden. Vi tackar Christopher Cheng och Samuel J. Huang för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöds av Public Health Service beviljar (NIH R01 NS088399 och T32 EY232113).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
References
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
- Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
- Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
- Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
- Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
- Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
- Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
- Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
- NEB, . 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , 302-368 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- . Bacterial Transformation Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017)
- . Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017)
- Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
- Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
- Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
- Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
- Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
- Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).
