Summary
صمم المقايسة الخلوية وصف للتعرف على مستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4)-العوامل المتفاعلة التي تكبح أو حفز، أما بشكل تنافسي أو اللوستيريكالي، داخل الخلايا Ca2 + إطلاق سراح بدأها التنشيط CXCR4.
Abstract
ز إلى جانب البروتين مستقبلات (جبكرس) ذات أهمية كبيرة لصناعة المستحضرات الصيدلانية كما أنهم يشاركون في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان وتشمل أهدافا تم التحقق من صحتها جيدا للتدخل العلاجي. اكتشاف مركبات الرصاص، بما في ذلك الجزيئات الاصطناعية الصغيرة، التي تمنع الدالة المستقبلات على وجه التحديد، هو خطوة أولى هامة في تطوير العقاقير ويعتمد على فحوصات حساسة ومحددة، وقوى يستند إلى الخلية. هنا، يمكننا وصف مقايسة خلوية حركية مع قراءات فلورية تهدف في المقام الأول تحديد الخصوم مستقبلات محددة التي تمنع داخل الخلية Ca2 + إطلاق سراح أثارت عند تنشيط مستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4) التي لها يجند الذاتية، يجند chemokine الامتحانات 12 (CXCL12). ومن مزايا رئيسية لهذا الأسلوب أنه يمكن أيضا فحص مركبات تتمتع بخواص ناهضة ذاتية (أي، مركبات التماس زيادة في داخل الخلية Ca2 + تركيز في الغياب CXCL12) أو المركبات تحوير وظيفة مستقبلات عن طريق التفاعل مع مواقع الربط اللوستيريك (أي، المغيرون allosteric الإيجابية والسلبية (PAMs و NAMs، على التوالي)). وعلى الجانب السلبي، مركبات أوتوفلوريسسينت قد تتداخل مع قراءات للمقايسة، مما يعوق تفسير البيانات الموثوق بها. على الأرجح هذا التحليل يمكن أن تنفذ، مع الحد الأدنى من التكييف، مقايسة اكتشاف الأدوية للعديد من جبكرس الأخرى التي يؤدي التنشيط إلى إطلاق سراح من كاليفورنيا داخل الخلية2 +.
Introduction
جبكرس هي فوق هامة عائلة الخلية البروتينات السطحية التي تنشيط إشارة توصيل الشلالات عند ملزم يجند خارج الخلية. أنها يمكن أن يتم تنشيط بمجموعة كبيرة ومتنوعة من المحفزات بما في ذلك الببتيدات، هرمونات البروتين والامينات بيوجينيك والدهون، مما يؤدي إلى بدء مسارات الإشارات داخل الخلايا المتنوعة والاستجابات البيولوجية في نهاية المطاف1،2 . وعلاوة على ذلك، جبكرس تشارك في الكثير، إذا كانت العمليات الإنمائية والفسيولوجية، وليس كلها وكثير من الأمراض البشرية ترتبط باختلال هذه العملية إشارات أو مستقبلات overexpression. جبكرس من ذلك بين الأهداف الدوائية الأكثر تم التحقق من صحتها في الطب1،3.
عادة، يبدأ سير عمل اكتشاف المخدرات GPCR فحوصات الفحص الخلوي مما يتيح تحديد هوية المركبات مثل الجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة الببتيدات التي يمكن أن تعدل من نشاط هذه العملية خاصة. في اكتشاف الأدوية GPCR توجد العديد من أنواع مختلفة من الاختبارات للبحث عن هذه المركبات، معظمها متوافقة مع حملات منتصف-للفرز الفائق. تشمل الاختبارات الأكثر استخداماً مستقبلات ملزم التجارب، والأسفار أو التﻷلؤ على أساس فحوصات الكشف عن التقلبات في مستوى ما يسمى الثانوي الرسل (مثلاً، Ca2 +, دوري الادينوسين الأدينوزين (أمبير))، المظهرية فحوصات الكشف، وتجنيد أريستين β فحوصات4. اختيار نوع معين من التحليل قد تعتمد على عوامل متعددة، ولكن يتحدد أيضا بمعرفة مسبقة بشأن خصائص GPCR معين إرسال الإشارات. مؤثر ملزمة لهذه العملية الحث على تغيير conformational تحفيز تبادل غوانيدين diphosphate (الناتج المحلي الإجمالي) لثلاثي غوانيدين (غتب) على α-وحدة فرعية البروتينات هيتيروتريميريك ز. في وقت لاحق الفرعية-أنشئαG تنأى عن وحدة فرعيةβγ ز وكل مفارز سيتم بدء مزيد من مسارات الإشارات. التحلل المائي جزيء غتب ورابطة إعادة اللاحقة من Gα-الناتج المحلي الإجمالي ومفارزβγ ز سيتم استعادة البروتين ز إلى تكيف الخاملة5،6. تعتمد على تسلسل تشابه فرعيةα G يتم تعريف أنواع مختلفة من البروتينات ز (زق، زأنا، ز، ز12/13)7. إشارات عبر Gα يعطي وحدة فرعية ترتفع إلى عدة ردود نموذجية مثل الزيادة (عن طريق زs) أو نقصان (عن طريق زأنا) إنتاج cyclic AMP و Ca2 + تعبئة داخل الخلايا (عن طريق ز)5 ،7. زβγ وحدات فرعية أيضا قادرة على حمل مسارات المستجيب داخل الخلايا. على سبيل المثال، عند تفعيل زأنا-إلى جانب جبكرس، زβγ يمكن أن تحفز مباشرة phospholipase C (PLC-β) لإنتاج اينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) الذي يقوم بتشغيل الإصدار من Ca2 + من مخازن داخل الخلايا7 . وبعد تنشيط مستقبلات، هي فوسفوريلاتيد جبكرس بهذه العملية مؤنزم (جركس) الذي يعزز التفاعل مع β-أرريستينس. ينهي ز البروتين مما يشير إلى هذه العملية ويؤدي إلى مستقبلات الحساسية والاستيعاب في نهاية المطاف. Β-أريستينس أيضا قادرة على تشكيل المجمعات الجزيئية المتعددة التي يمكن أن تؤدي إلى أخرى مما يشير إلى مسارات مستقلة من البروتين G يشير إلى8.
ضمن فصيلة مستقبلات تشيموكيني، غأنا-هو CXCR4 المقرونة هذه العملية التي أثارت الكثير من الاهتمام كهدف واعدة لاكتشاف المخدرات. نظراً لدورها الثابت كمستقبل المشارك رئيسي لفيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1) 1 ودخول الفيروس والإصابة، مركبات استهداف CXCR4 وضعت في البداية ك مرشحين العقاقير المضادة فيروس نقص المناعة البشرية9. في الآونة الأخيرة، مجموعة متزايدة من الأدلة قد أشار إلى دور هام CXCR4 في توموريجينيسيس وسرطان خبيث يجعلها هدفا علاجية جيدا تم التحقق من صحتها في علم الأورام، فضلا عن10. وأعرب عن CXCR4 هو الغاية في أكثر من عشرين من أنواع السرطان البشري وضوابط ورم الخلايا البقاء على قيد الحياة، والانتشار، والهجرة، فضلا عن الأوعية المتصلة بالورم10. CXCR4 الخصوم من فئات كيميائية مختلفة قد سبق وصف11،12، لكن فقط جزيء صغير AMD3100 معتمد حاليا للاستخدام في العيادة كعامل تعبئة خلايا الجذعية المستخدمة أثناء فترة العلاج من سرطان الغدد اللمفاوية والورم النخاعي المرضى13،14. وتجري التجارب السريرية لتقييم سلامة وفعالية من عدة الخصوم CXCR4 الأخرى في مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان، ولكن مع تركيز قوي على الأورام12. ونظرا للعديد من التطبيقات المحتملة للخصوم CXCR4، يبرر البحث عن مركبات جديدة مع تحسين خصائص الحرائك الدوائية، وتحسين التوافر البيولوجي، أو يحتمل أن تكون أقل من الآثار الجانبية.
هنا، تستخدم في المقام الأول مقايسة خلوية حركية المستندة إلى الأسفار إلى وصف الشاشة لمركبات قادرة على تثبيط CXCR4. نيون قياس هذا الأسلوب يستند إلى زيادة عابرة داخل الخلية Ca2 + تركيز أثارت عند التنشيط CXCR4 قبل به مؤثر الذاتية، يجند تشيموكيني CXCL12 (المعروفة سابقا بخلية stromal المستمدة عامل 1α ( SDF1-α))، وتثبيط المحتملة لهذا CXCL12 الناجمة عن Ca2 + الرد بمركبات خاصة. وتستخدم في هذا التحليل، U87 جليوبلاستوما البشرية خلايا ستابلي التعبير عن مستقبلات CXCR4 البشرية. في الوقت نفسه، تفتقر هذه الخلايا الذاتية التعبير عن CXCR7، مستقبلات تشيموكيني ذات صلة التي تربط أيضا CXCL1215،،من1617. CXCR7 سابقا تبين أيضا أن تكون قادرة على تشكيل هيتيروديميرس مع CXCR4، وبالتالي تحوير مما يشير إلى خصائص هذا الأخير مستقبلات18. التقلبات في مستوى داخل الخلية Ca2 + توسط CXCR4 تخضع لتحميل CXCR4+ الخلايا مع إستر أسيتوكسيميثيل فلوو-2 (صباحا)، تقارب ارتفاع نفاذية خلية فلورسنت Ca2 +-ملزمة صبغ. فلوو-2 صباحا هو جزيء فلوري وحيدة الطول موجي يمكن متحمس في 490 نانومتر بينما يقاس به الأسفار الانبعاثات في 520 نانومتر. يزيد هذه الأسفار الانبعاثات عند Ca2 + ملزمة، مع مجموعة كبيرة ودينامية بين Ca2 +-منضمة وغير منضمة الدولة. الزيادة في فلوري إشارة عابرة، التي تحدث ضمن فاصل زمني من بضع دقائق، وسوف تسوس بعد ذلك. ارتفاع ذروة يرتبط زيادة الانبعاثات الفلورسنت مع مستوى تنشيط مستقبلات. المقايسة نفسها تتم باستخدام قارئ ميكروسكوبية الأسفار مزودة كاميرا تكثيف مكافحة التصحر (ICCD) التي تمتلك نظام متكامل بيبيتينج تسمح بتوحيد الخطوات بيبيتينج في التحليل (انظر الجدول للمواد) . وباﻹضافة إلى ذلك، قياس الإشارات الفلورسنت في جميع الآبار صفيحة المتزامن هو ميزة رئيسية أخرى للقارئ الأسفار التي يتم استخدامها. تحميل جزء من فحص المركبات قيد التحقيق (مثلاً، فريق من الجزيئات الصغيرة بتركيز ثابت أو في سلسلة تمييع) إضافة إلى قطع-2 صباحا خلال الأول CXCR4+ U87 الخلايا متبوعة ~ فترة الحضانة 10 دقيقة خلالها يتم قياس الأثر ناهضة من المركبات بشكل مستمر في الوقت الحقيقي. ثم، مؤثر الذاتية (أي، CXCL12) إضافة إلى الخلايا لاستحضار إلى CXCR4 بوساطة زيادة عابرة في مستوى Ca داخل الخلية2 +. أثناء هذا الجزء من المقايسة يمكن تقييم نشاط معادية محتملة من المركبات المختبرة. ويرد في الشكل 1نظرة تخطيطي لسير العمل العام للتحليل.
على الرغم من أن هذا Ca2 + تعبئة المقايسة استخدمت أساسا لتحديد فاعلية المثبطة للخصوم CXCR4 التنافسية (أي، والمركبات التي تمنع مؤثر الذاتية ربط وتحفز المستقبلات)، فإنه أيضا ويمكن تحديد مستقبلات يضع، والمركبات بالإضافة إلى ذلك، أن تمارس وظيفتها بالربط في مواقع اللوستيريك (أي، مواقع طبوغرافيا تختلف من موقع الربط أورثوستيريك تحتلها مؤثر الذاتية). وتشمل أمثلة على هذه الفئة الأخيرة من مركبات يضع allosteric و19،PAMs و NAMs20. في حين أن تمنع الخصوم مستقبلات محددة، فضلا عن NAMs CXCL12 الناجمة عن Ca2 + الاستجابة، PAMs من شأنه أن يعزز هذا الرد (انظر أيضا المناقشة القسم). على الرغم من الفحص الموضحة هنا على وجه التحديد أهداف CXCR4، فمن المتوقع أن يمكن تطبيق هذا الأسلوب إلى أخرى جبكرس مع جهد الحد الأدنى الأمثل، على الأقل إذا كانت إشارة عن طريق الإفراج عن كاليفورنيا داخل الخلية2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تجري جميع الخطوات الموصوفة في إطار البابين 1 و 2 تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحي مجلس الوزراء.
1-صون U87. خلايا CD4.hCXCR4
- تنمو الخلايا في قوارير الثقافة T75 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد.
ملاحظة: في المختبر خلية الخط المستخدمة في هذا البروتوكول خط خلية جليوبلاستوما U87 ستابلي يعبر عن الكتلة التمايز 4 (CD4) والإنسان CXCR4 وقد تم وصفه مسبقاً17. التعبير السطحي خلية من خلايا CD4 و CXCR4 ويرصد باستمرار التدفق الخلوي ومستويات التعبير تظل ثابتة على مر الزمن (~ 100% CD4+ و ~ 100% CXCR4+ الخلايا). وصف مفصل لتوليد خط الخلية المستخدمة وإجراءات التدفق الخلوي للتحقيق في مستويات التعبير مستقبلات ليست في نطاق هذا البروتوكول.- خلايا فرعية في كونفلوينسي 80-85 ٪. السماح لجميع المواد الكاشفة تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل استزراع خلية.
- إزالة المتوسطة الثقافة مكيفة من الخلايا وتغسل المونولاير الخلية مرة واحدة مع 5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- أضف 3 مل من 0.25% التربسين-يدتا وتوزيعها بالتساوي على أحادي الطبقة الخلية. ثم إزالة الفائض من التربسين-يدتا واحتضان يصل إلى 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ الخلايا لفصل.
- أضف 10 مل متوسطة النمو الكامل الطازج (دولبيكو للمتوسطة (دميم تعديل النسر) + 10% مصل بقرى الجنين (FBS) 0.01 م حبيس + + وكلاء الاختيار المناسب). ريسوسبيند الخلايا بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً. نقل تعليق خلية في أنبوب 50 مل عقيمة.
- حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام أسلوب الاختيار. في حالة الخلايا جليوبلاستوما U87، عموما صلاحية تصل إلى ~ 100%.
ملاحظة: يمكن تحديد أرقام الخلية في عدة طرق. نحن نستخدم بشكل روتيني نظام تحليل الآلي خلية استناداً إلى تريبان الأزرق تلطيخ (انظر الجدول للمواد) وفقا للمعيار في التعامل مع الإجراءات، ولكن الآداب الأخرى ينبغي أن تعمل بشكل جيد على قدم المساواة. - إضافة 2 × 106 أو 3 × 106 خلايا (قابلة للتطبيق) لوحدة تخزين نهائي من 25 مل نمو جديدة متوسطة في قارورة ثقافة T75 واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
ملاحظة: إذا كان 3 × 106 خلايا تستخدم الخلايا سوف تصل إلى 80-90% كونفلوينسي بعد يومين. إذا كان يتم استخدام 2 × 106 خلايا، أنها سوف تصل إلى كونفلوينسي نفسه بعد 3 أيام. معدل نمو الخلايا ينبغي أولاً أن تحدد تجريبيا إذا استخدمت خطوط الخلايا الأخرى.
2-بذر من الخلايا لفحص Ca2 + تعبئة
- في يوم الخلية باساجينج (يوم 0)، معطف الجدران الأسود البوليستيرين 96-جيدا لوحات مع مسح القاع (انظر الجدول للمواد) بمحلول جيلاتين 0.1% لتيسير مرفق خلية.
ملاحظة: قد أغفل طلاء اللوحات 96-جيدا مع الجيلاتين إذا كان يتم استخدام ألواح مغلفة مسبقاً، ومتوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد)،. من المستحسن تقييم استخدام ألواح مغلفة مسبقاً بدلاً من الطلاء اليدوي لكل خط الخلية قيد التحقيق من قبل المتابعة مع البروتوكول.- إعداد الحل الجيلاتين بإضافة 1 غرام جيلاتين إلى 100 مل برنامج تلفزيوني للحصول على حل 1%. تمييع العاشر 10 مع برنامج تلفزيوني قبل استخدامها مرة أخرى. لتحسين قابلية ذوبان الجيلاتين، الحرارة الحل إلى 37 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميليلتر 0.1 ٪ الجيلاتين الحل الواحد جيدا لوحة 96-جيدا ماصة متعددة باستخدام. احتضانها ح 2 في الرايت
- وفي الوقت نفسه، تعد الخلايا للبذر في لوحة 96-جيدا المغلفة.
- فصل الخلايا من قارورة الثقافة، ريسوسبيند لهم في متوسط نمو جديدة، وحسابها باستخدام تريبان الأزرق تلطيخ الأسلوب.
- زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في أنبوب 50 مل لمدة 5 دقائق في 400 غرام x في الرايت
- ريسوسبيند الخلايا في نمو جديدة متوسطة (دميم + 10% FBS + 1% حبيس، لا المضادات الحيوية) للحصول على كثافة خلية 0.1 × 106 (صالحة) خلايا/مل.
- إزالة الحل الجيلاتين من ألواح الجدران أسود بالأسفل واضحة تنقلب اللوحة والتجفيف في أنسجة. إضافة 200 ميليلتر/كذلك برنامج تلفزيوني إزالة الزائدة الجيلاتين واقلب اللوحة مرة أخرى.
- الاستغناء عن 200 ميليلتر من تعليق خلية (يقابل 0.2 × 105 خلايا) كل بئر في لوحة 96-جيدا المغلفة بالجيلاتين (من الآن أحد هذه اللوحة سوف كذلك يشار إليها باسم "لوحة القياس").
- احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
3-تحميل الخلايا مع نيون Ca2 + -صبغة حساسة
- في يوم 1 القيام الفعلية Ca2 + تعبئة المقايسة، بدءاً من تحميل خلايا المصنف مع Ca نيون2 +-ربط صبغ فلوو-2 صباحا.
- إعداد المقايسة المخزن المؤقت عن طريق إضافة 40 مل حبيس (1 م) 200 مل هانك متوازن الملح حل (حبس، 10 x، لا الفينول الحمراء، لا بيكربونات الصوديوم). إضافة الماء عالي النقاوة الحصول على وحدة تخزين نهائي ل 2 وإضافة 4 ز ألبومين المصل البقري (BSA). حل جيش صرب البوسنة عن طريق إثارة المغناطيسية. ضبط ال pH إلى 7.4 (مع هيدروكسيد الصوديوم) وتصفية الحل.
ملاحظة: خلال جميع الخطوات التالية يتم استخدام نفس المخزن المؤقت، ويشار إلى "المخزن المؤقت للمقايسة،". - إعداد حل أسهم (4 مم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) من كاليفورنيا فلورسنت2 +-حساسة لصبغ فلوو-2 صباحا. تجنب الإفراط في التعرض للضوء. حل 1 ملغ فلوو-2 صباحا (الوزن الجزيئي: 1,061 g/mol) في 235.6 ميليلتر [دمس].
- يعد إيجاد حل عملي لقطع-2 صباحا. لوحة المقايسة 96-بئر واحدة مزيج ميليلتر 12.5 فلوو-2 صباحا الأسهم الحل (4 مم) والفاعل النطاق ميليلتر 12.5 البوليول (مثلاً، f-127 بلورونيك) الحل (20% وزن/حجم في [دمس]، انظر الجدول للمواد). إضافة ميليلتر 22 هذا الخليط إلى المخزن المؤقت للمقايسة مل 11 في أنبوب 15 مل. هو تركيز النهائي فلوو-2 صباحا 4 ميكرومتر.
ملاحظة: يتم استخدام الفاعل النطاق كعامل تشتت لتحسين قابلية الذوبان مائي فلوو-2 صباحا، ونتيجة لذلك، تعزيز تحميل الخلية. لجعل الفاعل في [دمس]، حرارة العينة في 37 درجة مئوية والمزيج بانتظام للحصول على حل متجانسة. - إزالة المتوسطة النمو من خلايا المصنف سابقا في لوحة القياس 96-جيدا بالتقليب على اللوحة والتجفيف على منشفة ورقية.
- إضافة 100 ميليلتر تحميل الحل صبغ الواحدة وكذلك استخدام ماصة متعددة القنوات واحتضان لمدة 45 دقيقة في RT في الظلام.
- إعداد المقايسة المخزن المؤقت عن طريق إضافة 40 مل حبيس (1 م) 200 مل هانك متوازن الملح حل (حبس، 10 x، لا الفينول الحمراء، لا بيكربونات الصوديوم). إضافة الماء عالي النقاوة الحصول على وحدة تخزين نهائي ل 2 وإضافة 4 ز ألبومين المصل البقري (BSA). حل جيش صرب البوسنة عن طريق إثارة المغناطيسية. ضبط ال pH إلى 7.4 (مع هيدروكسيد الصوديوم) وتصفية الحل.
4-إعداد بولي بروبلين 96-جيدا لوحات تحتوي على CXCL12 تشيموكيني يجند أو المجمعات السكنية قيد التحقيق
- الحصول على جولة أسفل بولي بروبلين (PP) 96-جيدا لوحات (انظر الجدول للمواد).
- السماح لحل CXCL12 الأسهم (1 ملغ/مل) وحل الأسهم من المركبات قيد التحقيق حجته في الرايت
ملاحظة: أعد حل الأسهم CXCL12 الماء عالي النقاوة وتستكمل مع 0.01 ٪ Tween20 وتخزينها في-20 درجة مئوية كمختبرين تستخدم مرة واحدة. - إعداد 5 × الحل مركزة من CXCL12 في المخزن المؤقت للمقايسة (250 نانوغرام/مل الذي يساوي 31.25 nM) و 5 × إضعاف مركزة لكل مجمع (في فحص المخزن المؤقت).
- الاستغناء عن حلول الأسهم في لوحة 96-جيدا المناسب وفقا لتخطيط لوحة المعرفة مسبقاً. الاستغناء عن 75 ميليلتر/جيدا في اللوحة التي تحتوي على CXCL12 ("لوحة تشيموكيني")، الاستغناء عن 50 ميليلتر/جيدا في اللوحة التي تحتوي على هذه المركبات ("لوحة المركبة").
ملاحظة: كل المركبات وسوف CXCL12 وأخيراً تصبح المخفف x 5 عند صرفها في لوحة القياس. من المهم أيضا أن تشمل آبار المراقبة السلبية التي تتضمن فقط الإنزيم المخزن المؤقت في لوحة المركبة على حد سواء، فضلا عن لوحة تشيموكيني. أيضا آبار مراقبة إيجابية بحاجة إلى أن تدرج (أيالآبار مع CXCL12 في لوحة تشيموكيني، ولكن مع المخزن المؤقت للفحص في الآبار المقابلة للوحة المركبة).
- السماح لحل CXCL12 الأسهم (1 ملغ/مل) وحل الأسهم من المركبات قيد التحقيق حجته في الرايت
5-بروتوكول إعدادات القارئ الميكروسكوبية الأسفار
ملاحظة: قارئ الميكروسكوبية fluorescence المستخدمة في هذا البروتوكول المشار إليها في الجدول للمواد.
- التبديل في وحدة تبريد للقارئ لوحة fluorescence أولاً، ومن ثم التبديل على القارئ الأسفار نفسها. السماح للبدء لبضع دقائق وفتح البرمجيات الخاصة بالنظام.
- إنشاء بروتوكول الفحص استخدام السحب والإفلات القائمة التي تتضمن الخطوات التالية:
- في مربع "إعدادات"، حدد 'Read_Mode' مع الطول الموجي الإثارة: 470-495 نانومتر؛ الطول الموجي الانبعاثات: 515-575 نانومتر.
ملاحظة: أطوال موجية محددة مناسبة للاستخدام مع Ca2 +-fluo2 صبغة حساسة. - يتضمن المربع "مزيج مع TF" (نقل السوائل) لخلط التلقائي للمركبات في لوحة المركبة، التي سوف توضع في موقف الجهاز المصدر 2 (راجع الخطوة رقم 6، 4). حدد 15 ميليلتر للحل في كل بئر ويستنشق ومختلطة ثلاث مرات تلقائياً. ضبط ارتفاع نصائح ماصة في 20 ميليلتر تحت سطح السائل. تعيين سرعة الشفط وصرفها في 50 ميليلتر/s.
ملاحظة: ارتفاع نصائح ماصة يشير إلى وحدة التخزين التي تركت تحت نصائح ماصة. على سبيل المثال، إذا احتوت على الآبار للوحة المركبة 50 ميليلتر، ارتفاعه 30 ميليلتر يناظر 20 ميليلتر تحت سطح السائل. حجم حل مركب لمزيج، سرعة الاختلاط، وموقف ماصة نصائح أثناء الخلط، والعدد من خلط دورات يمكن جميع تعديلها باستخدام البرمجيات. - في المربع "نقل السوائل"، تعرف أن 20 ميليلتر لكل بئر من لوحة المركبة ستنقل إلى لوحة القياس. ضع نصائح ماصة في ميليلتر 20 أدناه السائل السطحية أيارتفاع 30 ميليلتر من خلال التطلع للمركبات وارتفاع 60 ميليلتر خلال صرفها في لوحة القياس. تعيين سرعة تطلع في 50 ميليلتر/s، وسرعة صرفها في 25 ميليلتر/s.
ملاحظة: لوحة مركب يحتوي على 50 ميليلتر من حل كل بئر (راجع الخطوة 4.1.3)، وبالتالي ارتفاع 30 ميليلتر يناظر موقف 20 ميليلتر تحت سطح السائل. لوحة القياس سوف تحتوي على 80 ميليلتر من المخزن المؤقت لفحص كل بئر (راجع الخطوة 6.3)، وبالتالي ارتفاع 60 ميليلتر يتوافق مع موقف مماثل من النصائح. - حدد الزر "القراءة مع فريق العمل". خلال الفترة الأولى، حدد يقرأ 60 (قياسات الفلورسنت) مع وقت الفاصل زمني لقراءة تعريف س. 1 أن تسجل ما يلي: 10 قبل الاستغناء عن المركبات في لوحة القياس، ويقرأ 50 بعد ذلك. تحديد الفاصل الزمني الثاني مع وقت الفاصل زمني لقراءة من 30 ثانية و 18 على ما يلي.
ملاحظة: أثناء هذه الخطوة الأسفار وسوف يقاس كينيتيكالي (على فترات زمنية محددة) ل ~ 10 دقيقة في المجموع. - تتضمن الزر "تلميحات حول المياه والصرف الصحي" في البروتوكول ثلاث مرات. في كل خطوة من خطوات الغسيل، حدد نوع السائل: السائل (ماء عالي النقاوة) أو السوائل ب (الإيثانول 70%)، عدد دورات الغسيل (1)، المضخة السرعة (سريع)، وتغسل العدد من السكتات الدماغية (5) خلال كل خطوة.
ملاحظة: خلال الأول وآخر خطوة الغسيل بالسوائل يستخدم، خلال السائل الخطوة الثانية يغسل يستخدم ب. - وتشمل وظيفة "وقفه بيبيتور". تعيين بيبيتور إلى وقفه ل 300 s.
ملاحظة: بهذه الخطوة بما في ذلك البروتوكول، الرأس بيبيتور، والتي تتكامل في جهاز قارئ لوحة الأسفار، سوف يتوقف لمدة 5 دقائق قبل المتابعة في البروتوكول. - يتضمن المربع "مزيج مع فريق العمل" للسماح بالاختلاط التلقائي لحل CXCL12 في لوحة تشيموكيني، والتي سوف توضع في موقف الجهاز المصدر 3 (راجع الخطوة رقم 6، 4). حدد 15 ميليلتر للحل في كل بئر ويستنشق ومختلطة ثلاث مرات تلقائياً. أثناء الشفط والاختلاط، ضع نصائح ماصة 20 ميليلتر تحت سطح السائل. يتم تعيين سرعة الشفط والاستغناء عن 50 ميليلتر/s.
ملاحظة: مماثلة فيما يتعلق بالخطوة 5.2.2، ويمكن تعديل هذه المعلمات. - في المربع "نقل السوائل" اللاحقة، أن 25 ميليلتر من كل تعريف جيدا تشيموكيني سيتم نقل اللوحة إلى لوحة القياس. موقف نصائح ميليلتر 20 أدناه السائل السطحية أيفي الطول 55 ميليلتر خلال تطلع من لوحة تشيموكيني يحتوي على 75 ميليلتر/بئر (راجع الخطوة 4.1.3)، وعلى ارتفاع 80 ميليلتر خلال صرفها في لوحة القياس. تعيين سرعة تطلع في 50 ميليلتر/s، وسرعة صرفها في 25 ميليلتر/s.
- تتضمن الزر "القراءة مع فريق العمل". خلال الفترة الأولى، حدد ما يلي: 145 مع وقت الفاصل زمني لقراءة تعريف س. 1 أن تسجل ما يلي: 5 قبل الاستغناء عن CXCL12 في لوحة القياس، ويقرأ 140 بعد ذلك. تحديد الفاصل الزمني الثاني مع وقت الفاصل زمني لقراءة 6 s وحدد ما يلي: 20.
ملاحظة: أخذت معا، طوال كامل البروتوكول يتم تسجيل القراءات 243 (قياسات الفلورسنت): 78 في خطوة 5.2.4 و 165 أثناء الخطوة 5.2.9. - على غرار الخطوة 5.2.5، تتضمن الزر "يغسل نصائح" ثلاث مرات في البروتوكول.
ملاحظة: بما في ذلك هذه الخطوة في نهاية البروتوكول يسمح أنه يمكن إعادة استخدام النصائح لإجراء فحص آخر دون الحاجة إلى تغيير النصائح.
- في مربع "إعدادات"، حدد 'Read_Mode' مع الطول الموجي الإثارة: 470-495 نانومتر؛ الطول الموجي الانبعاثات: 515-575 نانومتر.
- ضبط درجة حرارة الجهاز عند 37 درجة مئوية بالنقر فوق الزر "تعيين درجة حرارة المرحلة" تحديد 37 درجة مئوية.
6-تشغيل الفحص الأسفار
- بعد القياس اللوحة قد المحتضنة مع تحميل المخزن المؤقت لمدة 45 دقيقة (راجع الخطوة 3.1.5)، إزالة المخزن المؤقت بواسطة تنقلب اللوحة والجافة في أنسجة.
- يغسل خلايا المصنف عن طريق إضافة 150 ميليلتر/جيدا من المخزن المؤقت للمقايسة واحتضان لمدة 2 دقيقة.
- إزالة المخزن المؤقت مرة أخرى عن طريق التقليب على اللوحة. إضافة من المخزن المؤقت للمقايسة مع ماصة الأقنية 80 ميليلتر/جيدا.
- وضع جميع لوحات في الجهاز في موقفهم المناسبة: لوحة المركبة في موضع المصدر 2 ولوحة تشيموكيني في موضع المصدر 3 ولوحة القياس في موضع القراءة. وضع مربع أسود نصائح الموضع نصائح المصدر 1. أغلقت الباب للجهاز واحتضان لمدة 5 دقائق قبل المتابعة في البروتوكول.
- حدد الزر "البروتوكول إشارة اختبار" لتحديد الخلفية وحدات خفيفة نسبيا (رلوس) والأسفار الفرق على اللوحة. نافذة جديدة سوف يطفو على السطح. حدد "اختبار الإشارات".
ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، تتحدد رلوس الخلفية بالكاميرا ICCD، التي تتكامل في حجرة البصريات من جهاز قارئ الأسفار. هذه رلوس تنجم عن الإثارة من Ca2 +-صبغة حساسة (فلوو-2) بالضوء التي تنبعث منها الثنائيات (LEDs) (الصمام إخراج الطول الموجي نانومتر 470-495). قيم رلوس 8,000-10,000 أيضا مناسبة لهذا التطبيق. رلوس يمكن، إذا لزم الأمر، تكييفها عن طريق تغيير كثافة الإثارة (تحديد كثافة الصرف)، أو بوابة الكاميرا (حدد البوابة المفتوحة). ومن الناحية المثالية ينبغي الفرق على اللوحة أقل من 7.5%. - حدد "تحديث" إذا كان يتم الحصول على قيم أساسية من 8,000-10,000 رلوس. حفظ البروتوكول الرئيسية عن طريق النقر فوق الزر حفظ.
ملاحظة: قبل القيام بذلك، الإعدادات من اختبار البروتوكول إشارة سترحل إلى البروتوكول الرئيسي. - تشغيل الفحص بالضغط على الزر "تشغيل".
7-بيانات التحليل والجودة
- بعد الانتهاء من الفحص فتح مربع "تحليل" في مجال البرمجيات الخاصة بالنظام.
- انتقل إلى "تكوين المؤسسات الإصلاحية" واختر "ردا على خط الأساس". تحديد خط الأساس 1 البدء في قياس 1 وانتهاء عند قياس 5؛ سيتم حساب الأسفار يعني في كل بئر بين قياس 1 و 5.
ملاحظة: يتم تقسيم جميع القياسات المزيد من معين جيدا بهذا خط الأساس المحددة جيدا 1.- تحديد خط الأساس 2 للبدء في قياس 78 حتى قياس 83 (هو الاستغناء عن CXCL12 بعد قياس 83؛ ومرة أخرى fluorescence يعني يحسب في كل جيدا بين معامل تصحيح القياس 78 و 83 وهذا يطبق على جميع القياسات التالية قياس 83).
- تنشيط الخانة "إظهار كنسبة مئوية" و "طرح الخلفية".
- انتقل إلى "تكوين الحد الحركية". لتقييم تأثير المثبطة للمركبات في CXCL12 الناجمة عن Ca2 + الاستجابة، اختر ماكس-دقيقة بدءاً من قياس 84 (أيقياس الأولى هو الاستغناء عن بعد التي CXCL12) إلى 243 (أي، القياس النهائي).
ملاحظة: عن طريق اختيار ماكس-مين الفرق بين استجابة الحد الأدنى والحد الأقصى على خط الأساس بين قياس والقياس 84 يقال 243. إذا تم اختيار ماكس-دقيقة بدءاً من بين 11 القياس والقياس 78، يقال الفرق بين استجابة الحد الأدنى والحد الأقصى على خط الأساس بالنسبة للأساس 1. يمكن استخدام هذه القيمة لتحليل النشاط ناهضة المحتملة من المركبات، انظر المناقشة). - وسوف تصور البيانات في البرامج الخاصة بالنظام. إذا لزم الأمر، تصدير البيانات الخام لتحليل إضافي والتصور في حزم البرامج المشتركة الأخرى في التحليل.
- انتقل إلى "تكوين المؤسسات الإصلاحية" واختر "ردا على خط الأساس". تحديد خط الأساس 1 البدء في قياس 1 وانتهاء عند قياس 5؛ سيتم حساب الأسفار يعني في كل بئر بين قياس 1 و 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تأثير التحفيز CXCL12 على Ca2 + تعبئة داخل الخلايا في U87. CD4.CXCR4+ و U87. وتم تقييم الخلايا CD4 مع المقايسة Ca2 + تعبئة. بدلاً من 20 ميليلتر مركب الاختبار أن تضاف عادة أثناء الخطوة بيبيتينج الأولى من البروتوكول (الشكل 1)، تمت إضافة الإنزيم المخزن المؤقت إلى قطع-2 صباحا محملة U87. CD4.CXCR4+ الخلايا في لوحة القياس. أثناء الخطوة الثانية الاستغناء عن تركيزات مختلفة من CXCL12 (0.2-102.4 شمال البحر الأبيض المتوسط، وتركيز النهائية) تم الاستغناء في لوحة القياس. ويتجلى بزيادة الجرعة في الأسفار، ربط مع زيادة الجرعة تعتمد على الإصدار من Ca2 +، (الشكل 2A). هنا، يمثل عينة مراقبة سلبية هذه الآبار التي في كل الإضافات أضيفت فقط الإنزيم المخزن المؤقت إلى لوحة القياس (أي، 0 نانومتر CXCL12)، مما أسفر عن عدم وجود استجابة (الشكل 2A). حمل كميات متزايدة من CXCL12 مستويات متزايدة من الأسفار التي تسوس على مر الزمن (الشكل 2A). من هذه البيانات، تم إنشاء منحنى استجابة جرعة استناداً إلى "استجابة ماكس-دقيقة على خط الأساس" بين القياس 84 (أيقياس الأولى بعد إضافة CXCL12) وقياس 243 (أي.، القياس النهائي في البروتوكول ). استخدام الانحدار غير الخطية، القيمة50 EC (أي، تركيز بحاجة إلى استحضار الاستجابة القصوى نصف) مصممة ويناظر 1.14 شمال البحر الأبيض المتوسط (الشكل 2). لا الفلورسنت Ca2 +-ذات الصلة قد أثارت استجابة من قبل CXCL12، حتى في تركيزات عالية (102.4 nM)، عندما U87. وقد استخدمت خلايا CD4 تفتقر إلى الفنية CXCR4 التعبير. وهذا يدل على المستقبلات-خصوصية قياس أثارت من قبل CXCL12 (الشكل 2).
مفتاح التطبيق لهذا التحليل يستند إلى الخلية هو تحديد الجزيئات الصغيرة التي تستهدف على وجه التحديد CXCR4 وقادرة على تثبيط CXCL12 الناجمة عن Ca2 + التعبئة. إذا كان يتم التعرف على المركبات النشطة ("يضرب")، يمكن وصف كذلك باختبار تخفيف المسلسل من المجمع وتحليل فاعلية المثبطة بمزيد من التفصيل. ويتضح أثر بيسيكلام AMD3100، خصم مستقبلات محددة CXCR4 جزيء صغير راسخة مع قوية مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 نشاط21،22، على سبيل مثال، في الشكل 3. سلسلة تركيز AMD3100 (n = 4، 3 ميكرومتر وصولاً إلى 1.37 نانومتر التركيز النهائي في سلسلة تمييع 1/3) تم الاستغناء عن U87. CD4.CXCR4+ الخلايا أثناء الخطوة الأولى من البروتوكول. ثم سمح المجمع لاحتضان مع الخلايا ل ~ 10 دقيقة خلالها إشارة fluorescence تم تسجيلها بشكل مستمر. ثم 6.4 نيوتن متر CXCL12 (50 نانوغرام/مل، وتركيز النهائي) أضيفت إلى جميع الآبار لصفيحة خلية في نفس الوقت لحمل CXCR4 بوساطة Ca2 + التعبئة. ويبين الشكل 3 ألفالجرعة تعتمد على تثبيط هذه الاستجابة بتخفيف مختلفة من AMD3100. وفي هذه الحالة، يتم عرض فقط الجزء من الرسم البياني بعد إضافة CXCL12. كما تم تطبيق مراقبة سلبية (الخط الأزرق) المخزن مؤقت فقط في التحليل (لا قبل الحضانة مع AMD3100، لا CXCL12 إضافة إلى الآبار)، أدى إلى عدم الاستجابة المتوقعة. يتوافق مع عنصر إيجابي (الخط الأحمر) للعينات في أي 6.4 نانومتر CXCL12 تمت إضافة إلى الآبار دون حضانة AMD3100 السابقة (الشكل 3A). استناداً إلى هذه المعرفة السلبية والإيجابية تسيطر Z ' القيمة في هذا التحليل عادة ما بين 0.5 و 1. من أجل تحديد فاعلية المثبطة AMD3100 منحنى استجابة لجرعة تم إنشاؤها بواسطة الانحدار غير الخطي الناتج إلى قيمة50 IC محسوبة من 770.8 شمال البحر الأبيض المتوسط (الشكل 3B). ولزيادة توضيح سلوك مركب غير نشط، أدرج مارافيروك في هذه التجربة. مارافيروك جزيء صغيرة على وجه التحديد تثبيط مستقبلات تشيموكيني سي سي 5 (CCR5) مما حجب (CCR5)-طردية من الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-123 . حتى عند تركيزات عالية (تركيز 10 ميكرون النهائي) لوحظ أي تأثير المثبطة لهذا المركب على CXCR4 بوساطة Ca2 + الاستجابة (الشكل 3A).
أخيرا، لإثبات أن هذه التعبئة المقايسة2 + Ca يمكن تطبيقها أيضا على دراسة أخرى جبكرس، إضعاف مسلسل ليجند تشيموكيني سي سي 5 (CCL5)، يجند الذاتية ل CCR5، تمت إضافة إلى خلايا معربا عن CCR5 (U87. CD4.CCR5+) باستخدام بالضبط نفس الشروط التجريبية وإعدادات الأجهزة. تعتمد على جرعة فلورسنت Ca2 + رد يتضح بعد إضافة إضعاف المسلسل CCL5 (الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض لها تأثير على CXCR4، ما قبل الاحتضان مع 100 نانومتر (تركيز النهائي) من مارافيروك بشدة تحول دون هذه الاستجابة (3D الشكل).
رقم 1: نظرة عامة التخطيطي لسير العمل المقايسة. في الخلايا اليوم 0 الإعراب عن هذه العملية للفائدة (في هذه الحالة CXCR4) هي تبذر في الجدران الأسود لوحات 96-جيدا مع أسفل واضحة وتزرع بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2. ويتم في يوم 1 المستندة إلى الأسفار Ca2 + المقايسة. خلايا يتم تحميلها أولاً مع Ca نيون2 +-صبغة حساسة (فلوو-2 صباحا) والمحتضنة لمدة 45 دقيقة في RT في الظلام. "تشيموكيني لوحة" و "لوحة المركبة" معدّة (PP = بولي بروبلين). بعد الحضانة مع تحميل صبغ، تغسل خلايا المصنف مرة واحدة مع الإنزيم المخزن المؤقت (150 ميليلتر في البئر) بعد ذلك يتم إضافة 80 ميليلتر/جيدا من المخزن المؤقت للمقايسة. ثم هي المحتضنة لوحات جميع لمدة 5 دقائق في الجهاز عند 37 درجة مئوية قبل البدء في التحليل. ثم يتم الاستغناء عن التركيز المطلوب في الآبار من لوحة القياس عند المركبات ذات الأهمية (مثل، الجزيئات الصغيرة) ويسمح لاحتضانها ل ~ 10 دقيقة حين الأسفار ويقاس بشكل مستمر. المقبل، تركيز ثابت لمؤثر الذاتية لهذه العملية (CXCL12 هنا) إضافة إلى استحضار Ca2 + الإصدار وكذلك يتم تسجيل الأسفار على مر الزمن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: نشاط مؤثر من CXCL12 في CXCR4+ الخلايا وخصوصية استجابة المكتشفة. (أ) تأثير الجرعة تعتمد على CXCL12 على Ca2 + التعبئة في U87. الخلايا CD4.CXCR4+ . (ب) استناداً إلى استجابة ماكس-دقيقة على خط الأساس بين القياس 84 و 243 من أجله منحنى استجابة لجرعة وتحسب قيمة50 EC (n = 4، يعني ± التنمية المستدامة). (ج) أي رد كان فعل CXCL12 عندما أنه تم الاستغناء عن على U87. خلايا CD4 التي تفتقر إلى CXCR4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: رسم توضيحي لتأثير خصم CXCR4 (AMD3100) ومركب غير نشط (مارافيروك) على CXCR4+ الخلايا وتنشيط CCR5 بما مؤثر الذاتية، CCL5- (أ) تعتمد على الجرعة المثبطة تأثير AMD3100 على Ca2 + تعبئة أثارت قبل إضافة 6.4 نانومتر CXCL12 إلى U87. الخلايا CD4.CXCR4+ . مارافيروك (في 10 ميكرون التركيز النهائي) أظهر أي تأثير المثبطة في CXCL12 الناجمة عن Ca2 + الرد. (ب) بناء على رد ماكس-دقيقة على خط الأساس بين القياس 84 و 243، تم إنشاء منحنى استجابة لجرعة مثبطة وحسبت القيمة50 IC لتكون 770.8 نانومتر (n = 4، يعني ± التنمية المستدامة). (ج) الجرعة تعتمد على تفعيل CCR5 بما مؤثر الذاتية، CCL5. (د) تثبيط CCR5 بوساطة Ca2 + رد ما قبل الحضانة للخلايا مع 100 نانومتر مارافيروك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ca2 +-مقايسة تعبئة الموضحة هنا ثبت سابقا أن يكون أداة قيمة تحديد وتوصيف الخصوم مستقبلات استهداف CXCR417. ومع ذلك، من المتوقع أن هذا الأسلوب يمكن تطبيقها أكثر عموما على مجموعة كبيرة من جبكرس الأخرى التي تؤدي إلى Ca2 + إصدار سيتوسوليك عند انتهاء التنشيط، كما يتضح لمستقبلات تشيموكيني ذات الصلة CCR5. بينما في حالة CCR5 يمكن تطبيقها بالضبط نفس الشروط التجريبية، عدة خطوات في البروتوكول (مثلاً، عدد الخلايا في الطلاء، تحميل الخلايا مع صبغة فلورسنت) ستكون هناك حاجة إلى إعادة الأمثل قبل نقل المقايسة إلى جبكرس أخرى من أجل الحصول على نسبة الإشارة إلى الضوضاء مواتية. مسألة هامة هنا هو أيضا اختيار مناسب في المختبر الخلوية المضيف السماح بالتعبير رفيع المستوى من GPCR الفائدة واقتران وظيفية إلى Ca2 + المسار. في حالة CXCR4، وقد تم اختيار الخلايا جليوبلاستوما البشرية U87 نظراً ل: (1) عدم التعبير الذاتية من CXCR7 (chemokine ذات صلة مستقبل الذي يحتل مؤثر نفسه ك CXCR4)، (2) قدرتها على زوجين التنشيط CXCR4 إلى Ca2 +-مما يشير إلى المسار، (3) النطاق الديناميكي مواتية لاستجابة الفلورسنت التي تم الحصول عليها بعد تحميل الخلايا مع Ca2 +-صبغة حساسة، و (4) ألواح تمسكهم ممتازة للفحص التقليل إلى أدنى حد الخلية اضطراب طوال فترة الإجراءات. قد تحتاج كل من هذه المعلمات يتحدد تجريبيا لكل رواية هذه العملية للفائدة وكل نظام التعبير الخلوية.
عند إعداد تحليل مماثل لآخر في هذه العملية، يمكن النظر في عدة خطوات بديلة أو الكواشف في البروتوكول. على سبيل المثال، الأخرى Ca2 +-fluorophores حساسة (مثل، فلوو-4، 3-فلوو) يمكن أن تستخدم كبديل ل fluorophore (فلوو-2) المستخدمة في هذا البروتوكول. في حالة وجود قد حذف الخلايا المنضمة فضفاضة، والغسيل من الخلايا عن طريق إدخال الأصباغ لا يغسل التقليل إلى أدنى حد الخلية إزاحة24. وبالإضافة إلى ذلك، باستثناء خطوة الغسيل من البروتوكول سيزيد الإنتاجية للمقايسة. على الرغم من أن يمكن أيضا إجراء هذا الفحص مع خلايا عرض التعبير الذاتية من CXCR4، على سبيل المثال بما في ذلك عدة أنواع من السرطان البشري خلية خطوط10،25، ينبغي ملاحظة أن الخطوط مع الخلية transfected ثابت GPCR عالية ويمكن الحصول على مستويات التعبير التي تبقى مستقرة على مر الزمن. وسيؤدي هذا في أكثر وضوحاً القياسات المقايسة، الاعتداء نافذة أكبر لتفسير البيانات الموثوقة، ويتفق الأداء على مدى فترات أطول. عند استخدام الخلايا اندوجينوسلي الإعراب عن CXCR4 أنه سيكون أصعب بكثير لتحقيق هذه النتيجة.
عيب رئيسي للفحص أنها تعتمد على قياس الأسفار. ومن ثم، مركبات أوتوفلوريسسينت يمكن أن تتداخل مع المقايسة القياس، والذي يستثني منهم من التحليل بسبب تفسير البيانات لا يمكن الاعتماد عليها. أيضا، تتم هذه التعبئة المقايسة2 + Ca مثالي باستخدام هاتف خلوي فحص نظام مجهزة نظام بيبيتينج المتكامل الذي يسمح بخلط موحد وتطلب من المركبات ومستقبلات مؤثر في لوحة القياس في جميع الآبار في وقت واحد. بيد الفحص يمكن تكييفها وفقا للاستخدام مع أخرى، أقل الأسفار مكلفة الميكروسكوبية القراء مع قدرات قياس الحركية. ثم سيلزم إضافة مركبات ومؤثر تتم يدوياً باستخدام الممصات متعددة القنوات، التي ستزيد العملي على وقت ويقلل من الإنتاجية للمقايسة. وعلاوة على ذلك، سيكون الحصول على عدد مماثل من قياسات الأسفار خلال فاصل زمني معين للمقايسة الحركية صعوبة تحقيق كتدبير العديد من القراء الميكروسكوبية إشارات-بئر بينما نظم الفحص الراقية قياس جميع الآبار في نفس الوقت.
الخصوم مستقبلات منع ملزمة لمستقبلات والتنشيط لاحقاً بواسطة مؤثر الذاتية (CXCL12) حاليا تشكل الفئة الرئيسية من المركبات التي تستهدف على وجه التحديد CXCR411،12. AMD3100، جزيء الصغيرة التي تم استخدامها لتوضيح أداء Ca2 + تعبئة المقايسة، واحدة من أبرز الأمثلة على الخصوم CXCR426. وإلى جانب الخصوم مستقبلات، رفع الجزيئات التي تنظم هذه العملية إشارات مختلفة المصلحة العامة، وكذلك. وتشمل هذه الجزيئات يضع معكوس، فضلا عن PAMs هذه العملية و NAMs19،،من2027. ميزة مثيرة لاهتمام من التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة أن فإنه لا يمكن تحديد مستقبلات الخصوم، ولكنه أيضا يضع والمغيرون allosteric. ومع ذلك، بعض التعديلات الطفيفة للمقايسة والقيود بحاجة إلى أن تؤخذ في الاعتبار.
PAMs و NAMs ربط مواقع مستقبلات طبوغرافيا مميزة من موقع الربط أورثوستيريك تحتلها يجند مستقبلات الذاتية. بينما PAMs تعزيز فاعلية و/أو كفاءة ligand(s) للمستقبلات الذاتية، تمنع NAMs رجولية و/أو كفاءة من19،ligand(s) الذاتية20. وقد PAMs أي نشاط جوهري مؤثر. وهم فقط نشط حضور مؤثر الذاتية، خلافا ليضع ما يسمى اللوستيريك. لأنه سوف تستثير allosteric GPCR المغيرون آثار جانبية أقل من مستقبلات الكلاسيكية الخصوم عند تطبيقه في ظروف سريرية28،29، فأدوات قيمة دوائية. في أعمالنا المقايسة، يضع allosteric سوف تستثير بزيادة عابرة من إشارة fluorescence فور، بالإضافة إلى CXCR4+ الخلايا. ثم ينبغي أن تحدده خصوصية مستقبلات هذا الإشارة اختبار المجمع نفسه مع التحليل نفسه، ولكن في الخلايا التي تفتقر إلى CXCR4. عند فحص PAMs على وجه التحديد، ينبغي استخدام تركيز أقل من مؤثر الذاتية في المقايسة للحث على Ca2 + استجابة فلورسنت. على الرغم من أن هذا المبلغ أقل من مؤثر سوف تولد إشارة فلورسنت صغيرة، فإنه يترك نافذة أكبر للكشف عن تحفيز مستقبلات إضافية. عادة، يتم اختيارها بتركيز مؤثر مطابق لقيمة30 -EC10EC لتحفيز مستقبلات30،31. لا يؤدي إضافة بام خلال الجزء الأول من الفحص في مقياس فلورسنت زيادة. ومع ذلك، ستزيد Ca2 + إشارة الفلورسنت بعد التحفيز اللاحقة للمستقبلات مع به مؤثر الذاتية. وبالمثل، نام لا يغير من قياس الفلورسنت قبل إضافة مؤثر، ولكن تحول دون الاستجابة للمستقبلات بعد إضافة مؤثر. ومن ثم سوف تبدو الشخصية نشاط نام وخصم مستقبلات مشابهة. وكلاهما سيؤدي إلى تثبيط استجابة الفلورسنت بعد إضافة مؤثر. ولذلك، مواصلة الدراسات التجريبية مطلوبة لتميز بين خصم نام. هنا، المسمى مستقبلات ملزم الدراسات حيث تتنافس المركبات غير مسمى مع مقدار ثابت من CXCL12 للربط في17،CXCR432 يمكن أن تكون استراتيجية قيمة لتميز بين خصم، الذي يحول دون مؤثر من الربط المستقبلات، ومن حركة عدم الانحياز التي من شأنها ليس كما أنها لا حصة الموقع ملزم مستقبلات نفس المسمى.
وقد لوحظ النشاط المستقل (أو القاعدية أو التأسيسية) يجند من جبكرس للعديد جبكرس33 على الرغم من أن مستوى النشاط القاعدي منخفض عموما بدلاً من ذلك عندما يتم التعبير عن جبكرس ريكومبينانتلي27. يمكن تعزيز النشاط GPCR القاعدية التي تحدث بشكل طبيعي ووصف الطفرات33 وطفرة نقطة مما يؤدي إلى زيادة CXCR4 القاعدية وكان نشاط سابق34. اقتران هذا المسخ CXCR4 active مؤثرا على مسار الاستجابة فرمون في الخميرة وتجارب [35S] GTPγS الملزمة، فقد تبين أن T140، خصم CXCR4 المستندة إلى ببتيد مع قوية لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية النشاط17،35 إلى حد كبير انخفاض هذا النشاط القاعدي وهكذا تبين أن تتصرف ك مؤثر معكوس34. من المذكرة، لاحظ المؤلفون نفسه في Fura-2 يستند إلى الأسفار Ca2 + تعبئة مقايسة انخفاض عابر صغير في كاليفورنيا2 +-الأسفار ذات الصلة بعد إضافة T140 إلى خلايا معربا عن المسخ CXCR4، مما يشير إلى انخفاض قدرة القاعدية مستقبلات نشاط34. ومع ذلك، عند تحليل فريق إضافي من دوري على أساس بينتابيبتيدي CXCR4 العكسي يضع مصممة من T140، كان الكشف عن انخفاض النشاط القاعدي مع بتعبئة الإنزيم2 + Ca أقل وضوحاً36. عندما تم تحليل تأثير T140 على التعبير عن نوع البرية CXCR4 الخلايا باستخدام مقايسة Ca2 + التعبئة كما هو موضح في هذه المخطوطة، لوحظ أي تغيير في إشارة fluorescence القاعدية17. وعلاوة على ذلك، الأسفار تقلبات سريعة وعابرة والزيادات في كاليفورنيا القاعدية2 + ، على سبيل المثال، لم يلاحظ في الخلايا معربا عن active مؤثرا زαq-إلى جانب مستقبلات4. أخذت معا، سيكون تأثير معكوس يضع صعبة جداً، أن لم يكن من المستحيل تحديد وتقييم موثوق بها مع لدينا المقايسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر إريك أفضل وشوفس جيرت للمساعدة التقنية الممتازة. تم دعم هذا العمل من خلال "وفين كو" (منحة لا. PF/10/018)، صندوق voor أونديرزوك ويتينشابيليجك (فو، منح لا. G.485.08)، وفي مؤسسة دورميور فادوز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).
