En kinetisk fluorescens-baserede Ca2 + mobilisering Assay at identificere G Protein-koblet Receptor agonister og antagonister allosteriske modulatorer
Summary
Den beskrevne cellulære assay er designet til identifikation af CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenter, der hæmmer eller stimulere enten konkurrencedygtige eller allosterically, den intracellulære Ca2 + release initieret af CXCR4 aktivering.
Abstract
G protein koblede receptorer (GPCRs) er af stor betydning for den farmaceutiske industri, som de er involveret i mange menneskelige sygdomme og omfatter godt validerede mål for terapeutisk intervention. Opdagelsen af blyforbindelser, herunder små syntetiske molekyler, der specifikt hæmmer den receptor funktion, er et vigtigt første skridt i udvikling af lægemidler og er afhængig af følsomme, specifikke og robust cellebaserede assays. Her, vi beskriver en kinetisk cellulære assay med en fluorescerende udlæsning primært designet til at identificere receptor-specifikke antagonister, der hæmmer den intracellulære Ca2 + release fremkaldt ved aktivering af CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) af sin endogene ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). En vigtig fordel ved denne metode er, at det også gør screening af forbindelser udrustet med iboende agonistiske egenskaber (dvs., forbindelser fremkalde en stigning i intracellulære Ca2 + koncentration i mangel af CXCL12) eller forbindelser modulerende receptor’s funktion via interaktion med allosteriske bindingssteder (dvs., positive og negative allosteriske modulatorer (PAMs og NAMs, henholdsvis)). På den negative side, kan autofluorescent forbindelser interferere med assayets udlæsning, dermed hæmmer pålidelige data fortolkning. Mest sandsynligt kan dette assay gennemføres med minimale tilpasninger, som et generisk lægemiddel discovery assay for mange andre GPCRs, hvoraf aktivering fører til en frigivelse af intracellulære Ca2 +.
Introduction
GPCRs er en vigtig superfamilien af celle overflade proteiner, der aktiverer signaltransduktion kaskader af ekstracellulære ligand bindende. De kan aktiveres af en lang række stimuli herunder peptider, protein hormoner, biogene aminer og lipider, hvilket resulterer i indledningen af diverse intracellulær signalering veje og i sidste ende biologiske svar1,2 . Derudover GPCRs er involveret i mange, hvis ikke alle, udviklingsmæssige og fysiologiske processer og mange menneskelige sygdomme er forbundet med dysfunktionelle GPCR signalering eller receptor overekspression. GPCRs er derfor blandt de mest validerede farmakologiske mål i medicin1,3.
Typisk, en GPCR drug discovery arbejdsprocessen starter med cellulære screening-assays muliggør identificering af forbindelser som små molekyler, monoklonale antistoffer og peptider, der kan modulere aktiviteten af et bestemt GPCR. I GPCR drug discovery mange forskellige typer af assays findes for at søge efter sådanne forbindelser, er hvoraf de fleste kompatibel med midten af til high throughput screening kampagner. De mest anvendte assays omfatter receptor binding eksperimenter, fluorescens eller luminescence baseret assays afsløre udsving i niveauet af såkaldte sekundære budbringere (fx, Ca2 +, cyklisk adenosin fra (AMP)), fænotypisk screening-assays og β-arrestin ansættelse-undersøgelser vedrørende4. Valg for en bestemt type af analysen kan afhænge af flere faktorer, men også afhænger af forudgående viden om signaling egenskaberne af en given GPCR. Agonist binding til en GPCR inducerer en konformationel ændring katalysere udveksling af guanidin ud (BNP) for guanidin trifosfat (GTP) på α-subunit af heterotrimeric G proteiner. Efterfølgende Gα-GTP subunit dissocieres fra Gβγ subunit og begge underenheder vil indlede yderligere signaling veje. Hydrolyse af GTP-molekyle og efterfølgende re sammenslutning af Gα– BNP og Gβγ subunits vil gendanne G protein i sin inaktive kropsbygning5,6. Baseret på sekvensen ligheden af Gα -underenhed forskellige typer af G proteiner er defineret (Gs, Gjeg, Gq, G12/13)7. Signalering via Gα subunit giver anledning til flere typiske reaktioner såsom stigningen (via Gs) eller formindske (via G,jeg) af cykliske AMP produktion og intracellulære Ca2 + mobilisering (via Gq)5 ,7. Gβγ underenheder er også i stand til at fremkalde intracellulære effektor veje. For eksempel, ved aktivering af G,jeg-koblede GPCRs, Gβγ kan direkte stimulerer fosfolipase C (PLC-β) til at producere inositol trifosfat (IP3) der udløser frigivelsen af Ca2 + fra intracellulære butikker7 . Efter receptor aktivering, GPCRs er fosforyleret af GPCR kinaser (GRKs), som fremmer interaktion med β-arrestins. Denne proces afsluttes G protein signalering og fører til receptoren desensibilisering og til sidst internalisering. Β-arrestins er også i stand til at danne multi molekylære komplekser, der kan udløse andre signaling veje uafhængigt af G protein signalering8.
Inden for underfamilie af chemokine receptorer, Gjeg-koblede CXCR4 er en GPCR, der har rejst meget interesse som en lovende mål for drug discovery. Givet sin etablerede rolle som en større Co receptor for human immundefekt virus 1 (HIV-1) blev viral entry og infektion, forbindelser målretning CXCR4 oprindeligt udviklet som anti-HIV medicin kandidater9. For nylig, en voksende mængde af beviser har henvist til en vigtig rolle for CXCR4 i tumordannelse og kræft metastaser gør det et godt valideret terapeutiske mål inden for onkologi samt10. CXCR4 er stærkt udtrykt i mere end 20 typer af menneskelige kræft og kontrol tumor celle overlevelse, spredning, og migration og tumor-relaterede angiogenese10. CXCR4 antagonister af forskellige kemiske klasser tidligere har beskrevet11,12, men kun den lille molekyle AMD3100 er nu godkendt til brug i klinikken som en stamcelle mobilisering agent bruges under behandling af lymfom og myelomatose patienter13,14. Kliniske forsøg er løbende at vurdere sikkerheden og virkningen af flere andre CXCR4 antagonister i forskellige menneskelige sygdomme, men med et stærkt fokus på onkologi12. I betragtning af de mange potentielle anvendelser for CXCR4 antagonister, er søgen efter nye forbindelser med forbedret farmakokinetiske egenskaber, forbedret biotilgængelighed eller potentielt mindre bivirkninger berettiget.
Heri, en kinetisk fluorescens-baserede cellulære assay primært bruges til at screene for forbindelser i stand til at hæmme CXCR4 er beskrevet. Fluorescerende måling af denne metode er baseret på den forbigående stigning i den intracellulære Ca2 + koncentration fremkaldt ved CXCR4 aktivering af sin endogene agonist, chemokine ligand CXCL12 (tidligere kendt som stromale celle afledte faktor 1α ( SDF1-α)), og den potentielle hæmning af denne CXCL12-induceret Ca2 + svar af særlige forbindelser. I denne analyse anvendes U87 menneskelige glioblastom celler stabilt at udtrykke den menneskelige CXCR4 receptor. På samme tid mangler disse celler endogene udtryk for CXCR7, en relaterede chemokine receptor, som binder også CXCL1215,16,17. CXCR7 har tidligere også vist sig at være i stand til at danne heterodimers med CXCR4, hvorved modulerende signaling egenskaberne for denne sidstnævnte receptor18. Udsving i niveauet af intracellulære Ca2 + medieret af CXCR4 overvåges ved at indlæse CXCR4+ celler med fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, en celle-gennemtrængelige høj affinitet fluorescerende Ca2 +-bindende farvestof. Fluo-2 AM er et enkelt bølgelængde fluorescerende molekyle, der kan være glade på 490 nm mens dens emission Fluorescens er målt ved 520 nm. Denne emission fluorescens øger ved Ca2 + bindende, med et stort dynamikområde mellem Ca2 +-bundne og ubundne stat. Stigningen i fluorescerende signal er forbigående, forekommer med et interval på et par minutter, og vil henfalde bagefter. Tophøjde af fluorescerende emissioner yderligere korrelerer med niveau af receptor aktivering. Selve analysen udføres ved hjælp af et fluorescens mikrotiterplade læser udstyret med en intensiveret CCD (ICCD) kamera, der besidder en integreret pipettering system, der giver mulighed for standardisering af pipettering trin i analysen (jf. Tabel af materialer) . Derudover er samtidig måling af de fluorescerende signal i alle brønde på en mikrotiterplade en anden vigtig fordel af fluorescens-læseren, der bruges. Under først del af analysen forbindelser under undersøgelsen (fx, et panel af små molekyler på en fast koncentration eller i en fortyndingsrække) er tilføjet til fluo-2 AM indlæst CXCR4+ U87 celler efterfulgt af en ~ 10 min inkubationstiden hvor den potentielle agonistisk effekt af forbindelser måles kontinuerligt i realtid. Derefter, den endogene agonist (dvs.CXCL12) er føjet til cellerne til at fremmane en CXCR4-medieret forbigående stigning i niveauet af intracellulære Ca2 +. Under denne del af analysen kan den potentielle antagonistiske aktivitet af de testede forbindelser evalueres. En skematisk oversigt over analysens generelle arbejdsgang er præsenteret i figur 1.
Selv om denne Ca2 + mobilisering assay er primært blevet brugt til at identificere og bestemme den hæmmende styrken af konkurrencedygtige CXCR4 antagonister (dvs., forbindelser, der forhindrer den endogene agonist for at binde og stimulere receptor), det også kan identificere receptor agonister og derudover forbindelser at udøve deres funktion ved at binde på allosteriske websteder (dvs., websteder, der topografisk afviger fra det orthosteric bindingssted besat af den endogene agonist). Eksempler på den sidstnævnte kategori af forbindelser allosteriske agonister og PAMs og NAMs19,20. Mens receptor-specifikke antagonister samt NAMs ville hæmme CXCL12-induceret Ca2 + reaktionen, PAMs ville styrke dette svar (Se også diskussion sektion). Selvom analysen beskrevet heri specifikt mål CXCR4, det forventes, at denne metode kan anvendes på andre GPCRs med minimal optimering indsats, i det mindste hvis de signal via frigivelse af intracellulære Ca2 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 +-mobilisering assay beskrevet heri har tidligere vist sig at være et værdifuldt redskab til at identificere og karakterisere receptor antagonister målretning CXCR417. Det forventes dog, at denne metode kan være mere generelt anvendes til en stor gruppe af andre GPCRs, der udløser en cytosole Ca2 + release ved deres aktivering, som illustreret til relaterede chemokine receptor CCR5. For CCR5 præcis de samme forsøgsbetingelser kunne anvendes, skal flere trin i proto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Eric Fonteyn og Geert Schoofs for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde er blevet støttet af KU Leuven (give nr. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, give nr. G.485.08), og Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
