Un test pour identifier les agonistes des récepteurs couplés aux protéines G, antagonistes et MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES cinétiques basés sur la Fluorescence Ca2 + mobilisation

Summary

Le test cellulaire décrit est conçu pour l’identification des récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4)-interaction des agents qui inhibent ou stimulent, soit compétitif ou façon allostérique,^{le Ca 2 +} intracellulaire initiée par activation CXCR4.

Abstract

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont d’une grande importance pour l’industrie pharmaceutique car ils sont impliqués dans plusieurs maladies humaines et comprennent bien validées cibles d’intervention thérapeutique. Découverte de composés de plomb, y compris les petites molécules synthétiques, inhibent spécifiquement la fonction de receveur, est un premier pas important dans le développement de médicaments et s’appuie sur des analyses cellulaires sensibles, spécifiques et robustes. Nous décrivons ici une analyse cinétique cellulaire avec un afficheur fluorescent principalement destinée à identifier les antagonistes des récepteurs spécifiques qui inhibent la libération^{2 +} Ca intracellulaire évoquée lors de l’activation du récepteur chimiokines CXC 4 (CXCR4) par ses ligand endogène, le ligand de chimiokines CXC 12 (CXCL12). Un avantage majeur de cette méthode est qu’elle permet aussi de dépister des composés dotés des propriétés agonistes intrinsèques (c’est-à-dire, composés provoquant une augmentation de Ca^{2 +} concentration intracellulaire en l’absence de CXCL12) ou composés modulant la fonction du récepteur via l’interaction avec des sites de liaison allostérique (c.-à-d., des MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs et négatifs (PAMs et NAMs, respectivement)). Sur le côté, auto-fluorescente composés pourraient interférer avec une lecture de l’essai, entravant ainsi l’interprétation des données fiables. Probablement ce dosage peut être implémenté, avec des adaptations minimes, comme un test de découverte de médicaments génériques pour de nombreux autres RCPG dont l’activation entraîne une libération de Ca intracellulaire^{2 +}.

Introduction

RCPG est une super-famille important de protéines de surface de cellules qui activent les cascades de transduction de signal lors de la liaison du ligand extracellulaire. Ils peuvent être activés par une grande variété de stimuli, y compris les peptides, hormones protéiques, les amines biogènes et lipides, qui se traduit par l’ouverture de diverses voies de signalisation intracellulaire et réponses biologiques éventuellement^1,2 . En outre, RCPG est impliqués dans un grand nombre, si pas tous, les processus physiologiques et du développement et plusieurs maladies humaines sont associées à dysfonctionnelle surexpression de signalisation ou récepteur de RCPG. RCPG est donc parmi les cibles pharmacologiques plus validés en médecine^1,3.

Typiquement, un flux de travail découverte de drogue GPCR commence avec des essais de criblage cellulaire permettant l’identification de composés tels que de petites molécules, des anticorps monoclonaux et des peptides qui peuvent moduler l’activité de l’un RCPG particulière. Dans la découverte de médicaments GPCR beaucoup de différents types de tests existe pour rechercher ces composés, dont la plupart est compatible avec les campagnes de milieu – de criblage à haut débit. Les analyses les plus utilisés sont des expériences de liaison du récepteur, fluorescence ou luminescence base de tests de détection des fluctuations du niveau de ce que l’on appelle messagers secondaires (p. ex., Ca^{2 +}, adénosine monophosphate cyclique (AMP)), phénotypiques tests de dépistage et β-arrestine recrutement assays⁴. Le choix d’un type particulier de test peut dépendre de plusieurs facteurs, mais est également déterminé par la connaissance préalable des propriétés de signalisation d’un RCPG donnée. Agoniste liant aux un RCPG induit un changement conformationnel catalysant l’échange de diphosphate de guanidine (PIB) pour triphosphate (GTP) de la guanidine sur la sous-unité α des protéines G hétérotrimériques. Par la suite, la sous-unité de GTP – G_αse dissocie de la sous-unité_βγ G et les deux sous-unités lancera également les voies de signalisation. Hydrolyse de la GTP-molécule et re-l’association subséquente du G_α– PIB et sous-unités_βγ G restaurera la protéine G dans sa conformation inactive^5,6. Basé sur la similarité de séquence de la sous-unité_α G désignent les différents types de protéines G (G,_s, G_je, G_q, G_12/13)⁷. Signalisation via le G_α sous-unité donne lieu à plusieurs réponses typiques tels que l’augmentation (via G_s) ou diminuer (via G_j’ai) de la production d’AMP cyclique et des mobilisation intracellulaire de Ca^{2 +} (via G_q)^{5 ,},⁷. Sous-unités_βγ G sont également capables d’induire des voies effecteurs intracellulaires. Par exemple, lors de l’activation de G_j’ai-GPCRs couplés, G_βγ peuvent stimuler directement la phospholipase C (PLC-β) pour produire le triphosphate d’inositol (IP-₃) qui déclenche la libération de Ca^{2 +} des réserves intracellulaires⁷ . Suite à l’activation des récepteurs, les RCPG est phosphorylés par kinases GPCR (krg) qui favorise l’interaction avec le β-arrestins. Ce processus termine G protéines de signalisation et mène à l’internalisation et finalement la désensibilisation du récepteur. Β-arrestins sont également capables de former des complexes moléculaires multiples qui peuvent déclencher des autres voies de signalisation indépendantes de protéine G⁸de signalisation.

Au sein de la sous-famille des récepteurs de chimiokines, le G_j’ai-couplé CXCR4 est un RCPG qui a soulevé beaucoup d’intérêt comme une cible prometteuse pour la découverte de médicaments. Compte tenu de son rôle établi comme un corécepteur majeur pour le virus d’immunodéficience humaine 1 (VIH-1) l’entrée virale et infection, composés ciblant CXCR4 étaient initialement développés comme de candidats médicaments anti-VIH⁹. Plus récemment, un nombre croissant de preuves a conduit à un rôle important pour CXCR4 dans la tumorigenèse et cancer du sein métastase, ce qui en fait une cible thérapeutique validée en oncologie ainsi¹⁰. CXCR4 est fortement exprimée dans plus d’une vingtaine de types de cancer chez l’homme et la survie des cellules tumorales contrôles, prolifération et migration ainsi que l’angiogenèse tumorale liés¹⁰. CXCR4 antagonistes des différentes classes chimiques ont été précédemment décrits^11,12, mais seulement la petite molécule qu’amd3100 n’est actuellement homologué pour une utilisation en clinique comme agent de mobilisation des cellules souches utilisée pendant le traitement du lymphome et myélome patients^13,14. Les essais cliniques sont en cours pour évaluer l’innocuité et l’efficacité de plusieurs autres antagonistes CXCR4 dans les maladies humaines différentes, mais avec un fort accent sur l’oncologie¹². Étant donné les nombreuses applications potentielles pour CXCR4 antagonistes, la recherche de nouveaux composés avec des propriétés pharmacocinétiques améliorées, une biodisponibilité améliorée ou potentiellement moins d’effets secondaires est justifiée.

Dans les présentes, un cinétique dosage cellulaire à base de fluorescence est principalement utilisé pour dépister composés capables d’inhiber CXCR4 est décrite. La mesure fluorescente de cette méthode repose sur l’augmentation transitoire de la concentration^{2 +} Ca intracellulaire évoquée lors de l’activation de CXCR4 par son agoniste endogène, le ligand de chimiokine CXCL12 (autrefois appelés cellules stromales dérivées (1α) facteur SDF1-α)) et l’inhibition éventuelle de cette réponse^{2 +} Ca induite par CXCL12 de composés particuliers. Dans cet essai, U87 glioblastome humain cellules exprimant le récepteur CXCR4 humain de manière stable sont utilisés. Dans le même temps, ces cellules ne possèdent pas une expression endogène de CXCR7, un récepteur de chimiokine connexes qui lie également CXCL12^15,16,17. CXCR7 a auparavant également avéré capable de former des hétérodimères avec CXCR4, modulant ainsi les propriétés de signalisation de ce récepteur ce dernier¹⁸. Fluctuations du niveau d’intracellulaire Ca^{2 +} médiée par CXCR4 sont surveillées en chargeant le CXCR4 des cellules avec ester acétoxyméthyl fluo-2 (AM), une cellule perméable haute affinité fluorescent Ca^{2 ++} -lie de colorant. Fluo-2 AM est une molécule fluorescente de longueur d’onde unique qui peut être excitée à 490 nm tandis que sa fluorescence d’émission est mesurée à 520 nm. Cette fluorescence d’émission augmente à la fixation Ca^{2 +} , avec une large gamme dynamique entre le Ca^{2 +}-lié et non consolidé État. L’augmentation du signal fluorescent est transitoire, qui se produisent dans un intervalle de quelques minutes et décroîtra par la suite. La hauteur du pic des corrélats fluorescent d’émission supplémentaires au niveau de l’activation du récepteur. L’analyse elle-même est réalisée à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence équipé d’une caméra CCD intensifié (ICCD) qui possède un système de pipetage intégré qui permet la normalisation du pipetage lors de l’essai (voir Table des matières) . En outre, la mesure simultanée du signal fluorescent dans tous les puits d’une microplaque est un autre avantage majeur du lecteur de fluorescence qui est utilisé. Au cours de la première partie du dosage les composés incriminés (p. ex., un panel de petites molécules à une concentration fixe ou dans une série de dilutions) sont ajoutés à la fluo-2 AM chargé CXCR4⁺ U87 cellules suivie d’un ~ 10 min d’incubation au cours de laquelle l’effet agoniste potentiel des composés est continuellement mesurée en temps réel. Ensuite, l’agoniste endogène (c’est-à-direCXCL12) est ajouté aux cellules pour évoquer une augmentation transitoire induite par le CXCR4 au niveau intracellulaire Ca^{2 +}. Durant cette partie de l’analyse de l’activité antagoniste potentielle des composés testés peut être évaluée. Un aperçu schématique du déroulement général de l’essai est présenté dans la Figure 1.

Bien que ce test Ca^{2 +} mobilisation a d’abord été utilisé pour identifier et déterminer la puissance inhibitrice des antagonistes compétitifs de CXCR4 (c.-à-d., les composés qui empêchent l’agoniste endogène pour lier et stimuler le récepteur), elle aussi peuvent identifier les agonistes des récepteurs et, en outre, les composés qui exercent leurs fonctions en se liant à des sites allostériques (c.-à-d., les sites qui diffèrent sur le plan topographique du site de liaison d’orthosteric occupé par l’agoniste endogène). Exemples de cette dernière catégorie de composés agonistes allostériques et PAMs et NAMs^19,20. Considérant que les antagonistes des récepteurs spécifiques, mais aussi les NAMs inhiberait la réponse induite par CXCL12 Ca^{2 +} , PAMs renforcerait cette réponse ( Voir aussi section). Bien que le test décrit ci-après spécifiquement des cibles CXCR4, on prévoit que cette méthode peut être appliquée aux autres RCPG avec un effort minimal d’optimisation, au moins si ils le signal par l’intermédiaire de la libération d’intracellulaire Ca^{2 +}.

Protocol

Remarque : Toutes les étapes décrites aux chapitres 1 et 2 sont effectués dans des conditions stériles dans une enceinte à flux laminaire. 1. maintien de U87. Cellules CD4.hCXCR4 Cultiver les cellules T75 flacons de culture à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.Remarque : La lignée cellulaire in vitro utilisée dans le présent protocole est une lignée de cellules de glioblastome U87 exprimant de manière stable cluster de différenci…

Representative Results

L’effet de stimulation CXCL12 sur la mobilisation de Ca2 + intracellulaire en U87. CD4.CXCR4+ et U87. Cellules CD4 a été évaluée avec le test de Ca2 + mobilisation. Au lieu de 20 µL de substance d’essai qui serait normalement ajouté au cours de la première étape de pipetage du protocole (Figure 1), le tampon a été ajouté à la fluo-2 AM chargé U87. Cellules CD4.CXCR4+ dans la plaque de la mesure. Au …

Discussion

Le Ca^{2 +}-test de mobilisation décrit ci-après a déjà démontré pour être un outil précieux pour identifier et caractériser les antagonistes des récepteurs CXCR4¹⁷de ciblage. On prévoit, toutefois, que cette méthode peut être plus généralement appliquée à un groupe important d’autres RCPG qui déclenchent une libération de Ca^{2 +} cytosolique lors de leur activation, comme illustré pour le récepteur de chimiokine connexes CCR5. Considérant que dans le cas d…

Materials

Fluo-2 AM	Abcam	ab142775	fluorescent Ca2+ sensitive dye
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G	pluronic acid
Gelatin	Sigma	G9391
AMD3100	Sigma	A5602-5 mg	specific CXCR4 antagonist
Maraviroc	kind gift of AnorMed		antiretroviral drug, CCR5 antagonist
Chemokine ligand CXCL12	PeproTech	300-28A
Chemokine ligand CCL5	PeproTech	300-06
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco (Life Technologies)	10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco (Life Technologies)	41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1 M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red	Gibco (Life Technologies)	25200-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Falcon tubes, 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
Tissue culture flask (T75)	Corning	353024
Black plate, 96-well, clear bottom, with lid	Costar/Fisher Scientific	10530753	assay plate (96-well), for cell seeding
Polypropylene (PP) plates	Thermo Scientific (VWR)	732-2661	plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom
FLIPR Tetra high throughput cellular screening system	Molecular Devices		Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera
FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm	Molecular Devices	0200-6128	Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye
FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm	Molecular Devices	0200-6203	emission filter compatible with the fluorescent dye
FLIPR Tetra 96 Head	Molecular Devices	0310-4536	96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader
ScreenWorks	Molecular Devices		software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra
Vi-CELL	Beckman Coulter		cell viability analyzer
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile	Corning	3340	Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.