تعبئة مقايسة2 + من Ca المستندة إلى الأسفار حركية لتحديد يضع إلى جانب البروتين مستقبلات ز، والخصوم، والمغيرون Allosteric
Summary
صمم المقايسة الخلوية وصف للتعرف على مستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4)-العوامل المتفاعلة التي تكبح أو حفز، أما بشكل تنافسي أو اللوستيريكالي، داخل الخلايا Ca2 + إطلاق سراح بدأها التنشيط CXCR4.
Abstract
ز إلى جانب البروتين مستقبلات (جبكرس) ذات أهمية كبيرة لصناعة المستحضرات الصيدلانية كما أنهم يشاركون في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان وتشمل أهدافا تم التحقق من صحتها جيدا للتدخل العلاجي. اكتشاف مركبات الرصاص، بما في ذلك الجزيئات الاصطناعية الصغيرة، التي تمنع الدالة المستقبلات على وجه التحديد، هو خطوة أولى هامة في تطوير العقاقير ويعتمد على فحوصات حساسة ومحددة، وقوى يستند إلى الخلية. هنا، يمكننا وصف مقايسة خلوية حركية مع قراءات فلورية تهدف في المقام الأول تحديد الخصوم مستقبلات محددة التي تمنع داخل الخلية Ca2 + إطلاق سراح أثارت عند تنشيط مستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4) التي لها يجند الذاتية، يجند chemokine الامتحانات 12 (CXCL12). ومن مزايا رئيسية لهذا الأسلوب أنه يمكن أيضا فحص مركبات تتمتع بخواص ناهضة ذاتية (أي، مركبات التماس زيادة في داخل الخلية Ca2 + تركيز في الغياب CXCL12) أو المركبات تحوير وظيفة مستقبلات عن طريق التفاعل مع مواقع الربط اللوستيريك (أي، المغيرون allosteric الإيجابية والسلبية (PAMs و NAMs، على التوالي)). وعلى الجانب السلبي، مركبات أوتوفلوريسسينت قد تتداخل مع قراءات للمقايسة، مما يعوق تفسير البيانات الموثوق بها. على الأرجح هذا التحليل يمكن أن تنفذ، مع الحد الأدنى من التكييف، مقايسة اكتشاف الأدوية للعديد من جبكرس الأخرى التي يؤدي التنشيط إلى إطلاق سراح من كاليفورنيا داخل الخلية2 +.
Introduction
جبكرس هي فوق هامة عائلة الخلية البروتينات السطحية التي تنشيط إشارة توصيل الشلالات عند ملزم يجند خارج الخلية. أنها يمكن أن يتم تنشيط بمجموعة كبيرة ومتنوعة من المحفزات بما في ذلك الببتيدات، هرمونات البروتين والامينات بيوجينيك والدهون، مما يؤدي إلى بدء مسارات الإشارات داخل الخلايا المتنوعة والاستجابات البيولوجية في نهاية المطاف1،2 . وعلاوة على ذلك، جبكرس تشارك في الكثير، إذا كانت العمليات الإنمائية والفسيولوجية، وليس كلها وكثير من الأمراض البشرية ترتبط باختلال هذه العملية إشارات أو مستقبلات overexpression. جبكرس من ذلك بين الأهداف الدوائية الأكثر تم التحقق من صحتها في الطب1،3.
عادة، يبدأ سير عمل اكتشاف المخدرات GPCR فحوصات الفحص الخلوي مما يتيح تحديد هوية المركبات مثل الجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة الببتيدات التي يمكن أن تعدل من نشاط هذه العملية خاصة. في اكتشاف الأدوية GPCR توجد العديد من أنواع مختلفة من الاختبارات للبحث عن هذه المركبات، معظمها متوافقة مع حملات منتصف-للفرز الفائق. تشمل الاختبارات الأكثر استخداماً مستقبلات ملزم التجارب، والأسفار أو التﻷلؤ على أساس فحوصات الكشف عن التقلبات في مستوى ما يسمى الثانوي الرسل (مثلاً، Ca2 +, دوري الادينوسين الأدينوزين (أمبير))، المظهرية فحوصات الكشف، وتجنيد أريستين β فحوصات4. اختيار نوع معين من التحليل قد تعتمد على عوامل متعددة، ولكن يتحدد أيضا بمعرفة مسبقة بشأن خصائص GPCR معين إرسال الإشارات. مؤثر ملزمة لهذه العملية الحث على تغيير conformational تحفيز تبادل غوانيدين diphosphate (الناتج المحلي الإجمالي) لثلاثي غوانيدين (غتب) على α-وحدة فرعية البروتينات هيتيروتريميريك ز. في وقت لاحق الفرعية-أنشئαG تنأى عن وحدة فرعيةβγ ز وكل مفارز سيتم بدء مزيد من مسارات الإشارات. التحلل المائي جزيء غتب ورابطة إعادة اللاحقة من Gα-الناتج المحلي الإجمالي ومفارزβγ ز سيتم استعادة البروتين ز إلى تكيف الخاملة5،6. تعتمد على تسلسل تشابه فرعيةα G يتم تعريف أنواع مختلفة من البروتينات ز (زق، زأنا، ز، ز12/13)7. إشارات عبر Gα يعطي وحدة فرعية ترتفع إلى عدة ردود نموذجية مثل الزيادة (عن طريق زs) أو نقصان (عن طريق زأنا) إنتاج cyclic AMP و Ca2 + تعبئة داخل الخلايا (عن طريق ز)5 ،7. زβγ وحدات فرعية أيضا قادرة على حمل مسارات المستجيب داخل الخلايا. على سبيل المثال، عند تفعيل زأنا-إلى جانب جبكرس، زβγ يمكن أن تحفز مباشرة phospholipase C (PLC-β) لإنتاج اينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) الذي يقوم بتشغيل الإصدار من Ca2 + من مخازن داخل الخلايا7 . وبعد تنشيط مستقبلات، هي فوسفوريلاتيد جبكرس بهذه العملية مؤنزم (جركس) الذي يعزز التفاعل مع β-أرريستينس. ينهي ز البروتين مما يشير إلى هذه العملية ويؤدي إلى مستقبلات الحساسية والاستيعاب في نهاية المطاف. Β-أريستينس أيضا قادرة على تشكيل المجمعات الجزيئية المتعددة التي يمكن أن تؤدي إلى أخرى مما يشير إلى مسارات مستقلة من البروتين G يشير إلى8.
ضمن فصيلة مستقبلات تشيموكيني، غأنا-هو CXCR4 المقرونة هذه العملية التي أثارت الكثير من الاهتمام كهدف واعدة لاكتشاف المخدرات. نظراً لدورها الثابت كمستقبل المشارك رئيسي لفيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1) 1 ودخول الفيروس والإصابة، مركبات استهداف CXCR4 وضعت في البداية ك مرشحين العقاقير المضادة فيروس نقص المناعة البشرية9. في الآونة الأخيرة، مجموعة متزايدة من الأدلة قد أشار إلى دور هام CXCR4 في توموريجينيسيس وسرطان خبيث يجعلها هدفا علاجية جيدا تم التحقق من صحتها في علم الأورام، فضلا عن10. وأعرب عن CXCR4 هو الغاية في أكثر من عشرين من أنواع السرطان البشري وضوابط ورم الخلايا البقاء على قيد الحياة، والانتشار، والهجرة، فضلا عن الأوعية المتصلة بالورم10. CXCR4 الخصوم من فئات كيميائية مختلفة قد سبق وصف11،12، لكن فقط جزيء صغير AMD3100 معتمد حاليا للاستخدام في العيادة كعامل تعبئة خلايا الجذعية المستخدمة أثناء فترة العلاج من سرطان الغدد اللمفاوية والورم النخاعي المرضى13،14. وتجري التجارب السريرية لتقييم سلامة وفعالية من عدة الخصوم CXCR4 الأخرى في مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان، ولكن مع تركيز قوي على الأورام12. ونظرا للعديد من التطبيقات المحتملة للخصوم CXCR4، يبرر البحث عن مركبات جديدة مع تحسين خصائص الحرائك الدوائية، وتحسين التوافر البيولوجي، أو يحتمل أن تكون أقل من الآثار الجانبية.
هنا، تستخدم في المقام الأول مقايسة خلوية حركية المستندة إلى الأسفار إلى وصف الشاشة لمركبات قادرة على تثبيط CXCR4. نيون قياس هذا الأسلوب يستند إلى زيادة عابرة داخل الخلية Ca2 + تركيز أثارت عند التنشيط CXCR4 قبل به مؤثر الذاتية، يجند تشيموكيني CXCL12 (المعروفة سابقا بخلية stromal المستمدة عامل 1α ( SDF1-α))، وتثبيط المحتملة لهذا CXCL12 الناجمة عن Ca2 + الرد بمركبات خاصة. وتستخدم في هذا التحليل، U87 جليوبلاستوما البشرية خلايا ستابلي التعبير عن مستقبلات CXCR4 البشرية. في الوقت نفسه، تفتقر هذه الخلايا الذاتية التعبير عن CXCR7، مستقبلات تشيموكيني ذات صلة التي تربط أيضا CXCL1215،،من1617. CXCR7 سابقا تبين أيضا أن تكون قادرة على تشكيل هيتيروديميرس مع CXCR4، وبالتالي تحوير مما يشير إلى خصائص هذا الأخير مستقبلات18. التقلبات في مستوى داخل الخلية Ca2 + توسط CXCR4 تخضع لتحميل CXCR4+ الخلايا مع إستر أسيتوكسيميثيل فلوو-2 (صباحا)، تقارب ارتفاع نفاذية خلية فلورسنت Ca2 +-ملزمة صبغ. فلوو-2 صباحا هو جزيء فلوري وحيدة الطول موجي يمكن متحمس في 490 نانومتر بينما يقاس به الأسفار الانبعاثات في 520 نانومتر. يزيد هذه الأسفار الانبعاثات عند Ca2 + ملزمة، مع مجموعة كبيرة ودينامية بين Ca2 +-منضمة وغير منضمة الدولة. الزيادة في فلوري إشارة عابرة، التي تحدث ضمن فاصل زمني من بضع دقائق، وسوف تسوس بعد ذلك. ارتفاع ذروة يرتبط زيادة الانبعاثات الفلورسنت مع مستوى تنشيط مستقبلات. المقايسة نفسها تتم باستخدام قارئ ميكروسكوبية الأسفار مزودة كاميرا تكثيف مكافحة التصحر (ICCD) التي تمتلك نظام متكامل بيبيتينج تسمح بتوحيد الخطوات بيبيتينج في التحليل (انظر الجدول للمواد) . وباﻹضافة إلى ذلك، قياس الإشارات الفلورسنت في جميع الآبار صفيحة المتزامن هو ميزة رئيسية أخرى للقارئ الأسفار التي يتم استخدامها. تحميل جزء من فحص المركبات قيد التحقيق (مثلاً، فريق من الجزيئات الصغيرة بتركيز ثابت أو في سلسلة تمييع) إضافة إلى قطع-2 صباحا خلال الأول CXCR4+ U87 الخلايا متبوعة ~ فترة الحضانة 10 دقيقة خلالها يتم قياس الأثر ناهضة من المركبات بشكل مستمر في الوقت الحقيقي. ثم، مؤثر الذاتية (أي، CXCL12) إضافة إلى الخلايا لاستحضار إلى CXCR4 بوساطة زيادة عابرة في مستوى Ca داخل الخلية2 +. أثناء هذا الجزء من المقايسة يمكن تقييم نشاط معادية محتملة من المركبات المختبرة. ويرد في الشكل 1نظرة تخطيطي لسير العمل العام للتحليل.
على الرغم من أن هذا Ca2 + تعبئة المقايسة استخدمت أساسا لتحديد فاعلية المثبطة للخصوم CXCR4 التنافسية (أي، والمركبات التي تمنع مؤثر الذاتية ربط وتحفز المستقبلات)، فإنه أيضا ويمكن تحديد مستقبلات يضع، والمركبات بالإضافة إلى ذلك، أن تمارس وظيفتها بالربط في مواقع اللوستيريك (أي، مواقع طبوغرافيا تختلف من موقع الربط أورثوستيريك تحتلها مؤثر الذاتية). وتشمل أمثلة على هذه الفئة الأخيرة من مركبات يضع allosteric و19،PAMs و NAMs20. في حين أن تمنع الخصوم مستقبلات محددة، فضلا عن NAMs CXCL12 الناجمة عن Ca2 + الاستجابة، PAMs من شأنه أن يعزز هذا الرد (انظر أيضا المناقشة القسم). على الرغم من الفحص الموضحة هنا على وجه التحديد أهداف CXCR4، فمن المتوقع أن يمكن تطبيق هذا الأسلوب إلى أخرى جبكرس مع جهد الحد الأدنى الأمثل، على الأقل إذا كانت إشارة عن طريق الإفراج عن كاليفورنيا داخل الخلية2 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 +-مقايسة تعبئة الموضحة هنا ثبت سابقا أن يكون أداة قيمة تحديد وتوصيف الخصوم مستقبلات استهداف CXCR417. ومع ذلك، من المتوقع أن هذا الأسلوب يمكن تطبيقها أكثر عموما على مجموعة كبيرة من جبكرس الأخرى التي تؤدي إلى Ca2 + إصدار سيتوسوليك عند انتهاء التنشيط، كما يتضح لمستقبلات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر إريك أفضل وشوفس جيرت للمساعدة التقنية الممتازة. تم دعم هذا العمل من خلال “وفين كو” (منحة لا. PF/10/018)، صندوق voor أونديرزوك ويتينشابيليجك (فو، منح لا. G.485.08)، وفي مؤسسة دورميور فادوز.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
