一种基于动力学荧光的 Ca2 +动员法, 用于识别 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗器和构调制器
Summary
所描述的细胞检测是为鉴定 CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4)-相互作用的代理, 抑制或刺激, 无论是竞争性或 allosterically, 细胞内 Ca2 +释放启动的 CXCR4 激活。
Abstract
G 蛋白偶联受体 (受体) 对于制药业来说是非常重要的, 因为它们涉及许多人类疾病, 包括良好的治疗干预目标。发现铅化合物, 包括小的合成分子, 特别抑制受体的功能, 是药物开发的一个重要的初步步骤, 依赖于敏感的, 特定的, 和强健的细胞检测方法。在这里, 我们描述了一个荧光读数的动态细胞分析, 主要用于识别受体特异拮抗剂, 抑制细胞内 Ca2 +释放诱发后, 激活的 CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4) 由其内源配体, CXC 趋化因子配体 12 (CXCL12)。该方法的一个主要优点是, 它还能筛选出具有内在竞赛特性的化合物 (即, 在没有 CXCL12 的情况下, 化合物诱导胞内 Ca2 +浓度增加) 或化合物通过与构绑定站点 (即、正负构调制器 (PAMs 和 NAMs) 的交互来调节受体的功能。在下降的一侧, autofluorescent 化合物可能干扰检测的读数, 从而妨碍可靠的数据解释。最有可能的是, 这种分析可以实施, 以最小的适应, 作为一个通用的药物发现化验的许多其他受体, 其中激活导致释放胞内 Ca2 +。
Introduction
受体是细胞表面蛋白的重要超家族, 激活信号转导级联后细胞外配体结合。它们可以由多种刺激激活, 包括肽, 蛋白质荷尔蒙, 生物胺和脂质, 这导致各种细胞内信号通路的启动和最终的生物反应1,2.此外, 受体参与了许多 (如果不是所有的) 发育和生理过程, 许多人类疾病与功能失调的 GPCR 信号或受体过度表达有关。因此, 受体是医学中最有效的药理靶点之一1,3。
通常情况下, GPCR 药物发现工作流程开始于细胞筛选化验, 从而能够识别小分子、单克隆抗体和能调节特定 GPCR 活动的肽等化合物。在 GPCR 药物发现, 有许多不同类型的化验, 以寻找这种化合物, 其中大部分是兼容中-高通量筛选运动。最常用的化验方法包括受体结合实验、荧光或发光测定法检测所谓二次信使水平的波动 (例如、Ca2 +、循环腺苷磷酸 (AMP))、表型筛选化验和β-arrestin 招聘化验4。对某一特定类型的化验的选择可能取决于多种因素, 但也由先验知识决定给定 GPCR 的信令性质。激动剂结合到一个 GPCR 诱导构象变化催化磷酸胍 (GDP) 的交换磷酸胍 (GTP) 在α亚基的 heterotrimeric G 蛋白。随后, gα-GTP 亚基离解从 gβγ亚基和两个亚基将启动进一步的信号通路。水解的 GTP 分子和随后重新联合的 gα-GDP 和 Gβγ亚基将恢复 G 蛋白进入其非活动构象5,6。基于 gα亚基的序列相似性定义了不同类型的 g 蛋白 (gs, gi, Gq, g12/13)7。通过 gα亚基发出信号会产生几个典型的响应, 例如增加 (通过 gs) 或减少 (通过 gi) 循环放大器生产和胞内 Ca2 +动员 (通过 Gq)5 ,7。Gβγ子单元也能够诱导细胞内效应通路。例如, 在激活 gi耦合的受体后, gβγ可以直接刺激磷脂酶 C (PLC β) 产生三磷酸肌醇 (IP3), 触发 Ca2 +从胞内存储7 的释放.继受体活化后, 受体通过 GPCR 激酶 (GRKs) 磷酸化, 促进与β arrestins 的相互作用。这一过程终止 G 蛋白信号, 导致受体脱敏和最终内化。β-arrestins 也能够形成多分子复合物, 可以触发其他信号通路独立的 G 蛋白信号8。
在趋化因子受体的亚家族中, Gi耦合 CXCR4 是一种 GPCR, 它引起了许多人的兴趣, 作为药物发现的一个有希望的目标。鉴于其作为人体免疫机能丧失病毒 1 (HIV-1) 病毒进入和感染的主要共同受体的作用, 最初将 CXCR4 作为抗艾滋病毒药物候选者, 被开发成了9。最近, 越来越多的证据表明, CXCR4 在肿瘤发生和肿瘤转移中的重要作用, 使其成为肿瘤治疗的有效靶点, 也是10。CXCR4 在二十多个类型的人类癌症中得到高度表达, 并控制肿瘤细胞的存活、增殖和迁移, 以及肿瘤相关的血管生成10。不同化学类的 CXCR4 拮抗剂以前被描述为11、12, 但目前只有小分子 AMD3100 被批准用于临床中作为淋巴瘤治疗中使用的干细胞动员剂。和骨髓瘤患者13,14。目前正在进行临床试验, 以评估其他几种 CXCR4 拮抗剂在不同的人类疾病中的安全性和有效性, 但重点是肿瘤学12。鉴于许多潜在的应用 CXCR4 拮抗剂, 寻找新的化合物具有改进的药代动力学性质, 改善生物利用度, 或潜在较少的副作用是必要的。
本文介绍了一种基于动态荧光的细胞检测方法, 主要用于筛查能抑制 CXCR4 的化合物。这种方法的荧光测量是基于胞内 Ca2 +浓度在 CXCR4 活化作用下的瞬态增加, 即趋化因子配体 CXCL12 (以前称为基质细胞衍生因子 1α (SDF1-α)), 并可能抑制此 CXCL12-induced Ca2 +响应的特定化合物。本试验采用 U87 人胶质瘤细胞稳定表达人 CXCR4 受体的方法。同时, 这些细胞缺乏内源性表达的 CXCR7, 一个相关的趋化因子受体, 也绑定 CXCL1215,16,17。CXCR7 以前也被证明能够与 CXCR4 形成 heterodimers, 从而调节后一种受体18的信令特性。通过将 CXCR4+单元格与 fluo-2 乙酰甲基 (AM) 酯 (CXCR4)、细胞渗透性的高亲和性荧光 Ca2+ 结合染料一起加载, 监视由由由由被测者介导的胞内 Ca2 + 级的波动。Fluo-2 AM 是一种单波长荧光分子, 可在 490 nm 激发, 而其发射荧光量为 520 nm。此发射荧光在 ca2 +绑定上增加, 在 ca2 +绑定和未绑定状态之间具有较大的动态范围。荧光信号的增加是瞬态的, 在几分钟的时间间隔内发生, 之后会衰减。荧光发射的峰值高度进一步与受体活化水平有关。该检测本身是使用一个荧光微板块读取器, 配备了增强 CCD (iccd/cop) 相机, 拥有一个集成的吹打系统, 允许标准化的吹打步骤在化验 (见材料表).此外, 在微板块的所有井中同时测量荧光信号也是使用荧光读取器的另一个关键优点。在分析的第一部分中, 被调查的化合物 (例如, 在固定浓度或稀释系列中的小分子小组) 被添加到 fluo-2 加载的 CXCR4+ U87 细胞中, 随后是10分钟的孵化期。在此过程中, 化合物的潜在竞赛效应不断地实时测量。然后, 将内源性激动剂 (即, CXCL12) 添加到细胞中, 以唤起胞内 Ca2 +的 CXCR4-mediated 瞬时增加。在这部分的分析中, 可以评估测试化合物的潜在拮抗活性。在图 1中介绍了该检测的一般工作流的示意图。
尽管此 Ca2 +动员分析主要用于确定和确定竞争性 CXCR4 拮抗剂 (即) 的抑菌效力, 但它也可以识别受体激动剂, 此外, 通过结合在构站点 (即, 地形不同于内源性激动剂所占的 orthosteric 结合部位) 发挥作用的化合物。后一类化合物的例子包括构激动剂和 PAMs 和 NAMs19,20。虽然受体特定的拮抗剂以及 NAMs 会抑制 CXCL12-induced Ca2 +响应, 但 PAMs 会增强此响应 (请参见讨论部分)。虽然此处描述的检测具体针对 CXCR4, 但预计此方法可应用于其他受体, 且最小的优化工作, 至少如果它们通过释放胞内 Ca2 +发出信号。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文所述的 Ca2 +-动员检测以前被证明是一种有价值的工具, 用于识别和描述针对 CXCR417的受体拮抗剂。但是, 预计此方法可以更广泛地应用于其他受体的大组, 在激活后触发胞浆 Ca2 +释放, 如相关的趋化因子受体 CCR5 所示。而在 CCR5 的情况下, 可以应用相同的实验条件, 协议中的几个步骤 (例如, 在电镀时的细胞数, 与荧光染料的细胞的加载) 需要重新优化, 然?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢埃里克芳廷承袭和 Geert Schoofs 的出色技术援助。这项工作得到了库鲁汶 (格兰特) 的支持。PF/10/018), 全宗与客厅里 Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, 授予 no。G. 485.08) 和基金会 Dormeur 瓦杜兹。
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
