Summary
Detta dokument beskriver utarbetande och utvärdering av navelsträngen matrix-derived mesenkymala stamceller spheroids med bilaterala knäskålssenan defekt modell i en råtta. Denna modell var var en godtagbar hälsoförsämring och hittade för att identifiera skillnader mellan obehandlade och behandlade senor, och mellan de två behandlingarna testas.
Abstract
Regenerativ medicin ger romanen alternativ till villkor som utmanar traditionella behandlingar. Prevalens och sjuklighet av tendinopathy mellan arter, har kombinerat med begränsad helande egenskaper av denna vävnad, du uppmanas sökandet för cellulära behandlingar och drivs utvecklingen av experimentella modeller för att studera deras effekt. Navelsträngen matrix-derived mesenkymala stamceller (UCM-MSC) är tilltalande kandidater eftersom de är riklig, lätt att samla, kringgå de etiska farhågor och risk för teratoma bildning, ändå likna primitiva embryonala stamceller närmare än Adult vävnad-derived MSCs. betydande intresse har fokuserat på kitosan som en strategi för att förbättra egenskaperna för MSCs genom sfäroid bildas. Detta papper Detaljer tekniker att isolera UCM-MSCs förbereda spheroids på chitosan film och analysera effekten av sfäroid bildas på ytan markör uttryck. Därför beskrivs skapa en bilaterala knäskålssenan skada modell råttor för i vivo implantation av UCM-MSC spheroids bildas på chitosan film. Inga komplikationer observerades i studien avseende sjuklighet, betona stigande effekter eller vävnad infektion. Funktionella poängsumman av de opererade råttorna på 7 dagar var lägre än för normala råttor, men återgick till det normala inom 28 dagar efter operation. Histologiska noter av vävnad-healing bekräftat förekomsten av en propp i behandlade defekter utvärderade på 7 dagar, frånvaron av främmande kropp reaktion och framåt helande i 28 dagar. Denna bilaterala patella senan defekt modell var styr interindividuell variation via skapandet av en intern kontroll i varje råtta, associerade med acceptabel sjuklighet, och tillät detektering av skillnaderna mellan obehandlade senor och behandlingar.
Introduction
Senan skada är en av de vanligaste orsakerna till betydande smärta och muskel atrofi över arter1. Inom veterinärmedicinen är senor och ligament skador av särskilt intresse för hästar, som 82% av alla skador i kapplöpningshästar involverar rörelseapparaten, och 46 procent av dem påverkar senor och ligament2,3. Ärrvävnad bildas påverkar läkta senor biomekaniska egenskaper och förklarar bevakad prognosen för återgång till athletic användning efter flexor sena skador; Re-skadan uppstår inom 2 år i upp till 67% av hästar behandlades konservativt4. Regenerativ medicin ger romanen alternativ till ett tillstånd som utmanar traditionella behandlingar. Terapi med autologa stamceller har producerat några uppmuntrande resultat5,6 men begränsas av den sjuklighet som är associerad med vävnad insamling, fördröjd administrering på grund av bearbetning/omprogrammering av celler och påverkan av den patientens hälsotillstånd (såsom ålder) i egenskaperna för stem cells7,8. Dessa begränsningar ge en motivering för att utreda allogena stamceller som ett off-the-shelf alternativ. Fostrets adnexa-derived celler är tilltalande kandidater eftersom de kringgå etiska betänkligheter och risk för teratoma bildning förknippas med embryonala stamceller. Bland fostrets adnexa är navelsträngen matrix (UCM), också heter Whartons gelé, riklig och lätt att samla in.
Oavsett cell källa är det nödvändigt att upprätta en cell bank för prövningar regenerativ medicin att förbättra stemness. Ur en funktionell synvinkel, kan stemness definieras som risken för självförnyelse och flera härstamning differentiering9. Bevis på stemness beroende proliferation och differentiering analyser, tillsammans med uttrycket av genen markörer Oct4, Sox2, och Nanog9. En strategi för att förbättra stemness är beroende av användningen av biomaterial som ogiltiga fyllmedel och bärare ökad proliferation och differentiering av UCM-MSCs. Denna strategi eliminerar oro för manipulation av transkriptionell faktorer att omprogrammera mogna celler i inducerade pluripotenta celler. Bland biomaterial betraktas som potentiella bärare för stamceller, är chitosan tilltalande för sina biokompatibilitet och nedbrytbarhet10. Detta naturliga aminopolysaccharide bildas av alkaliska deacetylering av chitinen, den näst vanligaste naturliga polysackarid, primärt erhålls som en minimiimportpriserna skaldjur10. Vi har tidigare undersökt samspelet mellan MSCs och chitosan ställningar, och observerade bildandet av spheroids11,12,13,14,15, 16. vi rapporterade också om överlägsenhet av kondrogenes om chitosan matriser12,13,14,15,16,17, 18. Mer nyligen, två oberoende studier beskrivs spheroids bildandet av fettvävnad och moderkakan vävnad härrör MSCs odlade på en chitosan film19,20. Denna formation av spheroids inte bara förbättrat stemness, men också förbättrat lagring av stamceller efter i vivo implantation20.
Prevalens och sjuklighet av tendinopathy över arter har föranlett utvecklingen av experimentella modeller för att studera patofysiologin bakom tendinopathies och testa nya terapier såsom stamceller injektioner. Hästar är kollagenas-inducerad tendinit en gemensam modell för att demonstrera effekten använder MSCs i senan reparation21. Relevansen av detta tillvägagångssätt är begränsad, eftersom injektioner orsaka akut inflammatoriska förändringar, medan kliniska tendinopathies brukar resultera från kronisk överansträngning22,23. Dessutom kemisk inducering av senan sjukdom inducerar en helande svar och replikerar inte nedsatt läkningsprocessen närvarande i kliniska fall22,23. Excision av ett segment av ytliga digitala flexor senan har beskrivits som en kirurgisk modell av tendinit i hästar24. Mer nyligen, användes en minimalt invasiv metod att begränsa de traumatiska skador till den centrala kärnan i de ytliga digitala flexor tendon25. Kirurgiska modeller gör inte simulera den trötthet mekanism som kan leda till naturliga senan sjukdom, och tenderar att saknar reproducerbarhet i omfattningen av skada skapade25. Oavsett modell, sjuklighet och kostnaden i samband med höstdagjämningen modeller av senan finns sjukdomar ytterligare begränsningar, som motiverar ett intresse för gnagare modeller som ett första steg i vivo utvärdering av nya behandlingar.
En av de främsta fördelarna med experimentella modeller hos gnagare består av kostnaden och möjligheten att styra interindividuell variabilitet. Gnagare kan vara standardiserat med avseende på olika fysiologiska faktorer på grund av deras snabba tillväxt och kort relativt livslängd, begränsa källor till variation och därför minska antalet djur som krävs för att upptäcka skillnader. Strategier för att framkalla senan sjukdomar hos gnagare har förlitat sig på kemiska induktion, men också på kirurgiska skapandet av partiell senor defekter21. Kirurgiska modeller kan simulera naturlig tendinopathies bättre än kemiska modeller, men kan leda till högre sjuklighet och totalhavererar den skadada senan. I det avseendet verkar råttor bättre kandidater än möss för dessa modeller, eftersom deras storlek tillåter skapandet av större defekter, därigenom underlätta utvärderingen av vävnad healing. Sprague-Dawley-råttor har använts i experimentella studier av tendinopathies i fyra stora senan grupper: rotatorkuffen, flexor, Achilles och patellar senor26. Bland dessa är modeller som innebär att knäskålssenan särskilt tilltalande på grund av den större storleken av denna senan och enkel åtkomst till den27. Knäskålssenan fäster i quadriceps-muskeln vid tibial ischii. Inom denna extensor mekanismen är patella en sesamoid ben som leder handlingen av quadriceps och skisserar proximala omfattningen av knäskålssenan. Förekomsten av beniga ankare på proximala och distala graderna av knäskålssenan underlättar biomekaniska tester. Modeller som involverar knäskålssenan vanligtvis lita på ensidiga kirurgiska defekter, med en kontralateral intakt sena tjänstgör som en kontroll28,29. Den vanligaste knäskålssenan defekt modellen innebär excising den centrala delen (1 mm i bredd) av knäskålssenan från distala spetsen av knäskålen till införandet av den tibial ischii, medan den kontralaterala knäskålssenan lämnas intakt. Åtgärder av utfall har inkluderat histologi, icke-förstörande biomekanisk testning eller biomekaniska tester till misslyckande, ultraljudsundersökningar, ex vivo fluorescens imaging, brutto observation och funktionella tester28,30 ,31. Unilaterala modeller tillåter inte jämförelse av en föreslagen behandling med konservativ behandling av en liknande skada inom samma djur. Likaså kräver jämförelse mellan flera behandlingar separat djur. En bilaterala modell skulle eliminera Inter-individuella variationer och minska antalet djur som krävs för en studie32. Men bilaterala skador kan öka sjuklighet och bilaterala hälta kunde hindra behandling utvärdering. Ett fåtal studier kort rapportera användning av bilaterala knäskålssenan defekter i råttor men fokus på effekterna av behandlingar i stället för perioperativ hantering och sjuklighet av den modell33,34.
Denna studie långsiktiga mål är att utveckla en strategi för att förbättra stemness och i vivo överlevnad av UCM-MSCs avsett att prövningar transplantation. För att uppnå detta mål, har vi nyligen rapporterade förbättrad stemness av UCM-MSCs genom bildandet av spheroids på chitosan film och inkubering under hypoxiska miljö35. Dessa in vitro- egenskaper var associerade med förbättrade biomekaniska egenskaper av knäskålssenan defekter behandlas med luftkonditionerade UCM-MSCs. baserat på dessa resultat, råtta bilaterala knäskålssenan defekt modellen verkar lämplig att testa kandidaten behandlingar för sena skador36. Syftet med studien rapporterade här är att ge detaljerade protokoll för isolering och karakterisering av UCM-MSCs, utarbetandet av ett biologiska leveranssystem för stamceller, skapande och behandling av bilaterala patella senan defekter och postoperativ återhämtning och utvärdering av vävnad healing inom defekterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Western University of Health Sciences.
1. isolering och Expansion av MSCs från Equine navelsträngen matris
- Erhålla moderkakan från en vuxen mare (gravid) efter observerade fölning och aseptiskt isolera navelsträngen från moderkakan. Håll navelsträngen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1% penicillin-streptomycin (P/S) vid 4 ° C under överföringen till bearbetning.
- Tvätta navelsträngen två gånger med rumstemperatur PBS med 1% P/S i en 50 mL tub. Avsnitt navelsträngen i 2-tums-långa fragment om 150 mm plåt och wash i rumstemperatur PBS med 1% P/S i en 50 mL tub två eller tre gånger, tills de flesta av blodet sköljs ut.
- Klippa navelsträngen längsled för att exponera fartyg. Ta bort fartyg, inklusive 2 artärer, en ven och en allantoiska stjälk från sladden med pincett och sax. Samla in navelsträngen matris (Wharton's Jelly), vilket är den geléliknande matrix omgivande fartygen, på 150 mm plåt genom att skrapa med en skalpell och finhacka gelé i fina bitar.
- Plats Whartons gelé från 2 – 3 navelsträngen fragment (cirka 12 – 15 g) i en 50 mL tub med 15 mL 0,1% (w/v) kollagenas typ IA lösning i PBS. Inkubera vid 37 ° C under varsam skakning för 3-4 h tills upplöst.
- Centrifugera smält vävnad vid 300 x g i 15 min och sug ut supernatant. Återsuspendera smält vävnad i 15 mL av rumstemperatur PBS med 1% P/S, blanda genom pipettering, Centrifugera vid 150 x g i 5 min och Aspirera supernatanten (tvätt). Upprepa handtvättar mer.
- Återsuspendera tvättas cellerna i 15 mL rumstemperatur PBS med 1% P/S, blanda genom pipettering, sila av med 100 µm cell SIL, Centrifugera vid 150 x g i 5 min, och sug ut supernatant.
- Förbered odlingsmedium (CM) genom att blanda låg glukos Dulbeccos modifierade örnens Medium (LG-DMEM) med fetalt bovint serum (FBS) och 1% P/S. sterilisera medium genom filtrering.
- Återsuspendera ansträngda celler i 10 mL CM före värmas till 37 ° C, blanda genom pipettering, till en 25 cm2 vävnadsodling mätkolv och inkubera i 5% CO2 på 90% luftfuktighet och 37,0 ° C. Förändring CM varje 3 dagar tills kulturen når 70 – 80% confluence, när kulturen kommer att vara passaged.
- För att passage kulturen, aspirera CM från kolven, tvätta två gånger med 5 mL av rumstemperatur PBS och lossa med 3 mL av 0,25% trypsin/etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) vid 37 ° C i 5 min.
- Neutralisera trypsin/EDTA med 6 mL CM före värmas till 37,0 ° C och blanda genom pipettering, överför till en 15 mL tub, Centrifugera vid 150 x g i 5 min, sug ut supernatant. Återsuspendera fristående celler i 1 mL CM, blanda genom pipettering. Räkna de viabla celler med hjälp av trypan blå och hemocytometer. Uppehållen i en 25 cm2 vävnadsodling kolv på 5 000 celler/cm2och inkubera i 5% CO2 på 90% luftfuktighet och 37,0 ° C.
2. beredning av Spheroids med UCM-MSCs odlade på Chitosan filmer
- För att bereda 100 mL 1% (w/v) chitosan lösning, tillsätt 1 g av kitosan i 99 mL destillerat vatten (dH2O) och blanda väl med en magnetisk omrörare.
- Tillsätt 670 µL isättika och fortsätt blanda tills chitosan löses upp och blir trögflytande. Detta tar vanligtvis 3-4 h.
- Tillsätt 500 µL av chitosan lösning i varje brunn Skyltens 12-väl vävnadsodling och snurra på plattan för att fördela chitosan lösning jämnt och täcka hela bottenytan.
- Torka chitosan lösning belagda plattan under laminärt flöde skåp utan en täcka över natten för 24 h. När torkat, blir tunn film bildade och anslutit sig till plattan.
- Neutralisera chitosan film genom att tillsätta 1 mL 0,5 N lösning av natriumhydroxid (NaOH) i varje brunn och inkubera i 2 h i rumstemperatur. Aspirera NaOH från varje brunn och tvätta varje brunn med 1 mL av dH2O tre gånger. Tvätta vart väl med 1 mL 70% etanol (EtOH) en gång.
- För att sterilisera chitosan film, tillsätt 1 mL 70% EtOH i varje brunn och inkubera över natten i laminär skåp. Aspirera återstående EtOH från varje brunn i följande dag. Tvätta vart väl med 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning tre gånger. Sterilisera chitosan film med ultraviolett ljus under laminärt flöde skåp över natten utan en cover.
- Till formuläret spheroids av UCM-MSCs, utsäde expanderat och anpassade celler i varje brunn på 5 000 celler/cm2och inkubera i 5% CO2 på 90% luftfuktighet och 37,0 ° C.
Obs: Celler kan inkuberas under hypoxi eller normoxia, beroende på prövarens intresse.
3. redovisning av ytmarkörer analyseras via flödescytometri
-
Beredning av en enda cellsuspension
- Kantbockade
- Ta bort mediet från varje brunn och tvätta två gånger med rumstemperatur PBS.
- Lossa celler med 500 µL av en cell dissociation reagens i varje brunn 12-well platta för 5 – 10 min i rumstemperatur.
- Efter inkubation, tillsätt 1 ml färgning buffert (PBS som innehåller 0,5% BSA) i varje brunn och blanda genom pipettering för att lossa cellerna.
- Över cellsuspension till 15 mL koniska rör och centrifugera vid 150 x g under 5 minuter.
- Chitosan plattan
- Samla alla spheroids av utvärderingsenheten medium med pipett med 1000 µL spets. Överföra insamlade medel i en 15 mL koniska rör. Efter att samla medium, tvätta väl genom att tillsätta 1 mL PBS, och överföra tvättade PBS till samma 15 mL koniska rör.
- Centrifugera spheroids vid 150 x g i 5 min och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 500 µL av cell dissociation reagens (t.ex., accutase) och inkubera i 5 – 10 min i rumstemperatur. Blanda pipettering med en 1 mL spets tills spheroids dissociera och inte längre synliga.
- Tillsätt 1 mL av färgning buffert i den enda cellsuspension och centrifugera vid 150 x g under 5 minuter.
- Kantbockade
-
Tvätta cellerna
- Ta bort supernatanten från koniska röret och Slamma upp cellerna i 3 mL kallt färgning buffert. Hålla celler på is i hela experimentet från detta steg.
- Centrifugera vid 300 x g för 5 min (tvätt).
- Tvätta två gånger.
-
Färgning celler
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min och ta bort supernatanten.
- Räkna viabla celler med hjälp av en trypan blå och hemocytometer. Återsuspendering 1 x 106 celler i 50 µL blockerande buffert (PBS som innehåller 10% häst serum) och inkubera i 30 min på is.
- Lägg till 10 µL fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugerade antikroppar (CD44, CD90, CD105, CD34, stora histocompatibility komplex (MHC) klass II eller isotypen kontroll för varje antikropp) och 40 µL av färgning buffert och inkubera skyddade från ljus för 1 h på is.
- Tillsätt 3 mL kallt färgning buffert och blanda, Centrifugera vid 300 x g i 5 min och Aspirera supernatanten (tvätt).
- Upprepa handtvättar.
- Återsuspendering cellpelleten i 0,5 mL av färgning buffert
- Tillsätt 5 µL 7-AAD (livskraft färgämne) och inkubera i 30 min på is
- Analysera färgade cellprover med flödescytometer. Utesluta skräp av deras mindre SSC och FSC och identifiera viabla celler med lägre upptag av 7-AAD. Rita FL1 och FL2 på den y - och x-axeln, respektive. Använda isotypen kontroll för att skapa en grind över den diagonala linjen. Mäta andelen positivt färgade celler i området. Räkna minst 20.000 evenemang/prov (kompletterande Figur1).
- Mäta andelen celler som färgas med antikroppar av gating viabla celler och auto-fluorescens och subtrahera procentandelen celler fläckade isotypen kontroll.
4. bilaterala knäskålssenan defekt modell hos råtta
- Välj Sprague-Dawley-råttor (vuxen hane, 4 – 5 månader gammal, kroppsvikt 350 – 375 g). Observera den relativt storleken råttor används för denna modell.
- Söva och tillämpa konstgjord öga smörjmedel råtta med 8% sevofluran i 2 L/min 100% syre levereras via mask, fram till försvinnandet av nypa-tå reflex i induktion kammaren.
- Administrera en intramuskulär injektion av meloxikam (1 mg/kg) som föregripande analgesi.
- Plats råtta mellan två 0,5 L vattenflaskor fylld med varmt vatten och täckt med en trasa för att bibehålla kroppstemperaturen och ställning, samtidigt förhindra hudskada. Tejpa varje extremitet till bordet. För att minska risken för hypotermi, täcka kroppen med bubbelplast (figur 1).
- Underhålla anestesi med kontinuerligt flöde av 5% sevofluran i 1 L och 100% Oxygen via näsan konen, med djuret på dorsala koordinationsrubbning på vatten värmedyna.
- För att undvika hud trauma, inte klippa de kirurgiska platserna. I stället gäller hår remover grädde över båda kväver. Använda en tungspatel ta bort grädde och hår.
- Skrubba operationsområdet med klorhexidin diglukonat skrubba och skölj med 70% etanol 3 gånger.
- Incisionsfilm huden med en steril #15 skalpell blad i en proximalt distala riktning, den craniomedial aspekten av att kväva. Starta snittet ca 1 cm proximalt nivån på patella och utvidga det ca 5 mm distalt om den tibial tuberkel.
- Återspegla huden för att exponera knäskålssenan genom att frigöra den underliggande subkutana vävnaden med #15 skalpell blad.
-
Med hjälp av bladet #15 skalpell, punktskatt den centrala tredjedelen av varje knäskålssenan (1 mm) från den distala delen av knäskålen till tibial ischii.
- Justera en 0,99 mm diameter Kirschner tråd mot senan som en mall att standardisera storleken på felet i varje lem (figur 2).
- Gör 2 fullhudsskador snitt på varje sida av Kirschner tråd med #15 skalpell blad att isolera den centrala delen av senan (figur 3). Resect i centrala avsnittet proximalt och distalt med fina Iris sax (figur 4).
- Innan du stänger fascian i kväva, infoga koagel (blandade cellsuspension och AVS) för lämplig behandlingsgrupper som beskrivs i 5.5. Stäng fascian med korsband mönster och huden med ett intrakutant mönster med 5-0 polyglactin 910 suturer (figur 5).
- Upprepa proceduren på den kontralaterala kväva.
Obs: En defekt tilldelas slumpmässigt till en behandling (stamceller luftkonditionerade på chitosan eller odlade på standard tallrikar). Kontralaterala defekten lämnas tom, att tjäna som intern kontroll. - Efter operation, administrera 4 tabletter av enrofloxacin (2 mg/tablett, oralt, en gång dagligen) och en tablett av meloxikam (2 mg/tablett, oralt, en gång dagligen) i 7 dagar. Dessa doser var rekommenderas av laboratorium djur veterinär och godkända i IACUC protokoll.
5. leverans av MSCs inom knäskålssenan defekten
- Söva en frisk råtta som inte används för knäskålssenan defekt skapelse med 8% sevofluran i 2 L/min 100% syre levereras via mask, fram till försvinnandet av nypa-tå reflex i induktion kammaren.
- Samla 5 mL blod av hjärt punktering från sövda Sprague-Dawley råtta (vuxen hane, 4 – 5 månader gammal, kroppsvikt 350 – 375 g), i en 5 mL spruta med en 20 G nål innehållande 1 mL syra-citrat-dextros (5:1 v/v).
- Euthanize råtta efter hjärt punktering och blodinsamling, genom intracardial injektion av pentobarbital (100 mg/kg), medan under den samma narkos.
- Centrifugera provet vid 350 x g i 15 min i rumstemperatur. Överför supernatanten och lagra alikvoter (120 µL varje) vid-20 ° C fram till användning.
- Omedelbart före i vivo implantation, Tina alikvoten som ovan och blanda 20 µL med 0,5 x 106 MSCs (från antingen 1,9 eller 3.1.2.1) lossnat från standard plattor med trypsin/EDTA, eller samla in från chitosan plattor genom spolning (med PBS/medium).
- Tillsätt 6 µL 10% kalciumklorid (CaCl2) i den återstående 100 µL av tinade plasma i en brunn av plattan med 96 brunnar att aktivera plasma och inducera bildandet av en blodpropp (aktiverat luftkonditionerade plasma: ACP).
- Blanda cellsuspension (20 µL) och AVS (100 µL) att bilda en propp (figur 6). Placera koagel inom knäskålssenan defekten skapade innan du stänger fascian i kväva (se steg 4.10.3).
6. funktionella resultatet
- Övervaka råttor dagligen för tecken på smärta, baserat på råtta grimas skala (RGS)37,38 och svullnad över implantationsställen.
Obs: Ett poängsystem (0 – 6) utvecklades för att utvärdera ambulatory funktionen baserat på 3 aktiviteter, inklusive tidsinställda bakbenen stående med frambenen som stöds (0-3), tidsinställda utan hjälp bakbenen stående (0 – 2) och möjligheten att klättra en 17 cm plast buren vägg (0 – 1) ( (Se tabell 1). - Utvärdera råttor för de två bakben stående aktiviteterna på morgonen och i aftonen av varje tidpunkt att beräkna en genomsnittlig poäng.
- Utvärdera råttor för förmågan att framgångsrikt klättra en 17 cm plast buren vägg med båda bakbenen nå toppen.
7. brutto utseende och histopatologi av i knäskålssenan
- Avliva råttor på 7 dagar (för att utvärdera inflammation) eller 28 dagar (att utvärdera vävnad healing) efter behandling av intracardial injektion av pentobarbital (100 mg/kg) under anestesi med 8% sevofluran och 2 L 100% syre levereras via mask.
- Skörda patella-senan-tibia ischii enheter av sax och skalpell efter dödshjälp. Ta bort mjuka vävnader och ligament runt kväva, utom knäskålssenan.
- Undersöka varje prov för brutto utseende och förtjockning av senan (figur 7).
- Orientera preparatet genom att placera en kirurg 's Knut av 5.0 Polydioxanon på den proximala och laterala delen av senan. Fixa varje prov i 10% neutral buffrad formalin lösning och få tvärgående sektioner (5 µm) från mitten av delen av varje senan.
- Fläcken avsnitten med hematoxylin och eosin och Masson's Trichrome färgning efter standardprotokoll.
- Granska avsnittet för att upptäcka förekomsten av hematom inom den defekt, samt patologiska förändringar såsom inflammation.
- Utvärdera den histologiska poängen av sektioner med tidigare publicerade poängsystem, baserat på kollagen grade, graden av angiogenes, och brosk bildas (tabell 2)39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den aktuella studien presenteras resultat som genomsnitt ± SD (standardavvikelse). Cellerna var isolerade från navelsträngar av 6 ston, och andelen isolerade cellinjer som uttrycker varje cell surface markör under standard eller chitosan luftkonditionering jämfördes med en Friedman test, som en icke-parametrisk variansanalys med upprepade åtgärder. För senan defekt modellskapande, 8 råttor användes för 7 dagar efter operation bedömning och 12 råttor användes för 28 dagar bedömning. Resultaten av funktionella resultat presenteras som menar ± SEM (standardfelet för medelvärdet) och jämfört med t-test. UCM valdes som en cellulär källa på grund av dess överflöd, enkel insamling och överlägsen spridning i förhållande till andra fostrets adnexa källor40. Celler som isolerats från UCM odlade på standard tallrikar underhålls en fibroblast-liknande form i hela utbyggnaden. Celler bildas spheroids när odlade på chitosan tallrik (figur 8).
Flertalet celler odlade under standart villkorar uttryckt CD44 (98,6 ± 1,62%), CD90 (88,7 ± 3,04%), och CD105 (77,9 ± 6,84%), medan uttrycket av CD34 (0,07 ± 0,17%) och MHC II (1.33 ± 1,12%) var mycket låga. Under luftkonditionerade kultur, uttrycksnivåerna för CD44 (97,0 ± 2.12%) och CD34 (1,13 ± 1,58%) inte skiljer sig från standard kulturer, medan uttrycksnivåerna för CD90 (33,3 ± 37,1%) och CD105 (54,0 ± 19,0%) minskade och MHC II (2,84 ± 0,98%) ökade35.
Efter isolering och karakterisering av UCM-MSCs i vitro, konditionerat celler biologiska beteende var jämfört celler odlade under standart villkorar i bilaterala knäskålssenan defekt modell hos råttor. Obehandlade defekter i varje råtta tjänstgjorde som interna kontroller. Postoperativ svullnad var minimal i alla råttor och löst inom 48 h. Enligt RGS visas ingen av råttorna tecken på smärta eller ångest som orbital åtdragning, näsa/kinden plattas eller örat/morrhår förändringar. Alla råttor konsumeras en normal rad 3 – 4 pellets eller 15 – 20 gram foder dagligen under hela studien. Den funktionella totalpoängen, inklusive bistod och utan hjälp bakbenen stående samt klättring noter var högre i normala råttor jämfört manövrerade råttor på 7 dagar (n = 8, p < 0,0001, tabell 3). Men den funktionella totalpoängen återgått till det normala inom 28 dagar efter operation (n = 12, p = 0,78). Rat bilaterala knäskålssenan defekt modeller har därför visat sig vara effektiva för att begränsa interindividuell variation och minska det nödvändiga antalet djur utan att orsaka betydande sjuklighet (Video 1–5).
Cirka 37% av senor samlas in på 28 dagar verkade påtagligt förtjockad (figur 7). Denna förtjockning var jämnt fördelad mellan Tom och behandlade defekter. Total histologiska Poäng ökade med tiden i obehandlad defekter (n = 20, p = 0.0034). När varje komponent av den helande poängen utvärderades självständigt, den enda parametern som förändras med tiden bestod av brosk-formationen, vilken ökade mellan 7 och 28 dagar (n = 20, p < 0,0001). Angiogenes tenderade att öka med tiden (p = 0,3), men kollagenbildning skilde sig inte (p = 0,69). Vid Histologisk undersökning observerades inflammation i alla senor vävnadssnitt undersökt 7 dagar efter operation, oavsett förekomsten av behandling. Ett hematom var närvarande i alla behandlade defekter. Histologiska angiogenes noter (tabell 2, figur 9) varierade från 0 till 1, vilket tyder på måttlig arteriole och kapillär infiltration, medan kollagen klass noter (tabell 2, figur 10) varierade från 2 till 3 Sammantaget tyder på måttlig till omfattande kollagenbildning. Brosk bildas noter (tabell 2, figur 11) varierade från 0 till 2 föreslår ingen brosk bildning, till måttlig brosk bildandet av 25% till 50% i området senan avsnitt. Alla histologiska siffror orienteras med vänster sida som den främre aspekten, och toppen som den mediala aspekten av den tvärgående delen av den halva delen av senan.
Figur 1: placering av råttor och förberedelse för aseptisk kirurgi. Varje råtta placerades mellan två 0,5 L vattenflaskor fylld med varmt vatten och täckt med en trasa för att bibehålla kroppstemperaturen och ställning, samtidigt förhindra hudskada. Extremiteterna av varje råtta var tejpade till tabellen och dess kropp var täckt med bubbelplast. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kirurgiska modell av knäskålssenan defekt (anpassning). En 0,99 mm diameter Kirschner tråd är justerad mot senan som en mall att standardisera storleken på felet i varje lem.
Figur 3: kirurgiska modell av knäskålssenan defekt (snitt). Två fullhudsskador snitt görs på varje sida av Kirschner tråd att isolera en central del av senan.
Figur 4: kirurgiska modell av knäskålssenan defekt (resektion). Den centrala delen är resected proximalt och distalt, skapa en defekt på storleken av Kirschner tråd. Opererande området visas inom streckade linjen låda.
Figur 5: postoperativ utseende av opererade kväver. Fascia avslutades med ett korsband mönster och huden var stängd med ett intrakutant mönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: beredning av aktiverade luftkonditionerade plasma för leverans av UCM-MSCs. Stamceller inställdes i konditionerat plasma före aktivering. Den resulterande clot infogades i knäskålssenan defekter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Brutto utseende av normal (C, D) och förtjockad (A, B) senor. (A, C) Bakre vyer; (B, D) Laterala visningar; Blockpilar identifiera skenbenet och tunna pilar identifiera senor.
Figur 8: morfologi av celler odlade på vävnadsodling plattan under 19% syrenivå (standardgrupp: A) och chitosan film under 5% syrenivå (betingad grupp: B). isolerade celler var spindeln formade på standard grupp (A) och bildade spheroids på luftkonditionerade grupp (B). Skalstapeln = 400 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 9: representativa ljus micrographs som används för klassificering av angiogenes. Efter 7 dagar av healing, fick senor med ingen behandling betyget 0 (A, D), medan de med antingen luftkonditionerade celler (C, F) eller standard celler (B, E) fick betyget 0,5 och 0, respektive. 28 dagar fick obehandlade senor (G, J) betyget 0, medan de med luftkonditionerade celler (jag,L) eller standard celler (H,K) fick massor av 1,0 och 0,5, respektive. Pilarna identifiera blodkärl i senan provet. Pilarna pekar på blodkärlen i 100 X förstoring motsvarar de samma pilar som pekar på att blodkärlen i 400 x förstoring. Normala senan vävnad (M, N). Massons trikrom fläcken (A, B, C, G, H, I, M); hematoxylin och eosin fläcken (D, E, F, J, K, L, N); Skalstapeln = 100 µm (A-N). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: representativa ljus micrographs används för kollagen sortering. Efter 7 dagar av healing fick senor med ingen behandling betyget 2,5 (A, D) medan de med behandling (B, C, E, F) fick betyget 3.0. 28 dagar fick obehandlade senor (G, J) betyget 3.0, medan de med luftkonditionerade celler (I, L) eller standard celler (H, K) fick massor av 1,0 och 3,0, respektive. Desorganisation av senan fibrer kan uppskattas i 400 X inläggningar (H, K). Normala senan vävnad (M, N). Massons trikrom fläcken (A, B, C, G, H, I, M); hematoxylin och eosin fläcken (D, E, F, J, K, L, N); Skalstapeln = 100 µm (A-N). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: representativa ljus micrographs som används för klassificering av brosk. Efter 7 dagar av healing, senor med ingen behandling (A, D), de med antingen luftkonditionerade celler (C, F) eller standard celler (B, E), alla fick betyget 0. 28 dagar fick obehandlade senor (G, J) betyget 1.0, medan de med luftkonditionerade celler (I, L) eller standard celler (H, K) fick score 0 och 2.0, respektive. Pilarna pekar på kondrocyter i senan provet. De pilar som pekar på en kondrocyter i 100 X förstoring motsvarar de samma pilar som pekar på en kondrocyter i 400 X förstoring. Normala senan vävnad (M, N). Massons trikrom fläcken (A, B, C, G, H, I, M); hematoxylin och eosin fläcken (D, E, F, J, K, L, N); Skalstapeln = 100 µm (A-N). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: utvärdering av ambulatorisk funktion hos råttor. Tidsinställda utan hjälp bakbenen stående (1 – 5 s: betyg 1) observerades 4 h postoperativt. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: utvärdering av ambulatorisk funktion i råttor. Tidsinställda bakbenen stående med frambenen assisterad (0 – 5 s: Poäng 0) noterades 4 h post operativt. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 3: utvärdering av ambulatorisk funktion hos råttor. Tidsinställda utan hjälp bakbenen stående (1 – 5 s: betyg 1), tidsinställda bakbenen stående med frambenen assisterad (5 – 10 s: betyg 1) noterades 14 dagar post operativt. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 4: utvärdering av ambulatorisk funktion i råttor. Tidsinställda bakbenen stående med frambenen assisterad (10 – 15 s: betyg 2), utan möjlighet att klättra en 17 cm plast buren vägg (ingen klättring: Poäng 0) noterades 27 dagar post operativt. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 5: utvärdering av ambulatorisk funktion i råttor. Tidsinställda bakbenen stående med frambenen assisterad (5 – 10 s: betyg 1), med möjlighet att klättra en 17 cm plast buren vägg (ja: Poäng 1) noterades 14 dagar post operativt. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
| Funktionstest | 0 | 1 | 2 | 3 | Poäng |
| Bakbenen utmärker assisterad | 0 – 5 s | > 5 – 10 s | > 10-15 s | > 15 s | |
| Bakbenen stå utan hjälp | 0 – 1 s | > 1 – 5 s | > 5 s | ||
| Klättringsförmåga | Nej | Ja | |||
| Totalt |
Tabell 1: poängsystem för att utvärdera ambulatory funktion hos råttor. Ett poängsystem (0 – 6) utvecklades för att utvärdera ambulatory funktionen baserat på 3 aktiviteter inklusive tidsinställda bakbenen stående med frambenen som stöds (0 – 3), tidsinställda utan hjälp bakbenen stående (0 – 2) och möjligheten att klättra en 17 cm plast buren vägg (0 – 1).
| Kollagen grade | |||||
| 0 | Normala kollagen orienterade tangentiellt | ||||
| 1 | Lindriga förändringar med kollagenfibrer mindre än 25% oorganiserad | ||||
| 2 | Måttliga förändringar med kollagenfibrer mellan 25% och 50% oorganiserad | ||||
| 3 | Markanta förändringar med mer än 50% oorganiserat kollagen | ||||
| Graden av angiogenes | |||||
| 0 | Måttlig infiltration av vävnad med arterioler | ||||
| 1 | Förekomsten av kapillärer | ||||
| 2 | Ingen vaskulatur infiltration | ||||
| Brosk bildas | |||||
| 0 | Ingen brosk bildning | ||||
| 1 | Isolerade Hyalint brosk knölar | ||||
| 2 | Måttlig brosk bildandet av 25% till 50% | ||||
| 3 | Omfattande brosk bildas, mer än 50% av fältet inblandade | ||||
Tabell 2: Histologi scoring kvaliteter. Histologiska Poäng avsnitt var graderade baserat på kollagen grade, graden av angiogenes och brosk bildas (anpassad från Rosenbaum o.a. 39)
| Grupp | Menar ± SEM |
| Normal (n = 3) | 6.00 ± 0,48 |
| 7 dagar efter operation (n = 8) | 2,25 ± 0,30 |
| 28 dagar efter operation (n = 12) | 5.83 ± 0,24 |
Tabell 3: Funktionella värderingar för normala råttor och obehandlad råttor. Funktionella resultat av normala råttor och obehandlad råttor 7 och 28 dagar var postoperativt graderade. n = antal råttor.
Kompletterande Figur1: Gating strategi och exempel på ytan markör uttryck: Skräp uteslöts baserat på små FSC och SSC (A). Levande celler valdes baserat på negativ färgning med 7-AAD upptäcks av FL3 (B). Isotypen matchad kontroll (C) användes som negativ kontroll för att skapa en grind av CD44-FITC positiva celler (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Equine celler valdes för detta projekt eftersom vi så småningom tänker testa kandidat metoder i hanteringen av naturliga tendinopathies hos hästar. Sena skador hos hästar är verkligen lockande som naturliga modeller av tendinopathy i mannen på grund av biologiska likheten mellan equine ytliga digitala flexor och hälsenan i människor41. De cell ytmarkörer CD44, CD90, CD105, CD34 och MHC II valdes för immunophenotyping av celler, enligt de kriterier som rekommenderas av den internationella föreningen för cellterapi42. I en färsk studie var eqUCM-MSCs positiva för CD44 och negativa för CD34 och MHC II, oavsett kultur. Celler odlade under standart villkorar var också positivt för CD90 och CD105, därmed uppfyller kriterierna för MSCs när det gäller uttryck för yta markörer. Denna studie är dessutom den första rapporten om bildandet av spheroids när eqUCM-MSCs är odlade på chitosan film, bekräftar tidigare rapporter om mänskliga MSCs19,20. 3D cell kultur tekniker har undersökts utförligt i årtionden som syftar till att skapa en miljö som liknar den fysiologiska nischen. Faktiskt, denna studie visade förbättrad stemness gen uttrycksnivåerna för Oct4, Sox2, och Nanog, och förbättrad differentiering potential, vilket är förenligt med andra rapporter19,20. Andra rapporterade förbättrad immunmodulerande egenskaper43 och Hyalint brosk regenerering44 använda MSCs spheroids. Bland olika 3D kultur tekniker såsom spinner kolvar, roterande cell bioreaktorer, icke-anhängare plattan verkar naturliga och syntetiska matriser, chitosan filmer tilltalande för flera skäl. Denna metod kräver inte dyr utrustning och är kostnadseffektiv jämfört med icke-anhängare plattor med syntetiska matriser, eftersom chitosan är en biprodukt av fiskeindustrin. Det är tekniskt enkelt att odla celler på chitosan filmer. Kombinerat, skulle dessa fördelar tillåta klinisk tillämpning på en stor skala45.
Den bilaterala knäskålssenan modellen föreslås här verkar acceptabel när det gäller sjuklighet. Inga komplikationer observerades i en färsk studie studie. Vi var särskilt bekymrad över risken för stressande effekter induceras av defekter som är tillräckligt stor för att tillåta detekterbara biomekaniska och histologiska förändringar. Dessa farhågor föranledde valet av råttor över möss för denna studie utifrån tidigare studier relaterade till storlek och löptid på senan för prekliniska skada modeller. Central-tredje knäskålssenan defekt eller 'fönster fel' har beskrivits i kaniner46 och råttor30,31 för att studera senan healing och bröstförstoring. Knäskålssenan 'fönster defekt' modell har hittats reproducerbara för att studera senan reparation hos råttor med histologi31,39, biomekanisk testning30,31, och ex vivo fluorescens Imaging31. I denna studie, storleken på felet var motsvarar den centrala tredjedelen av knäskålssenan, och var standardiserat med en 0,99 mm diameter Kirschner tråd som en mall. Dessa dimensioner var tillräckliga för att studera senan healing utan orsakar postoperativ bristning. På grund av deras större anatomisk storlek kontra möss rymmer råttor större defekter, förbättra reproducerbarheten för skada, behandling leverans och åtgärder av resultatet.
Analgesi protokollet administreras till råttorna i denna studie var effektiva i att kontrollera smärta, bedömt med RGS37,38. Detta poängsystem valdes här eftersom den var tidigare validerats som upptäcka postoperativ beteendeförändringar som återspeglar smärta i råttor37,38. RGS är baserad på tecken som är relativt enkelt att identifiera, till exempel orbital åtstramning, näsa/kinden plattas och öra/morrhår förändringar. Råttor upprätthåller också ett normalt matintag i hela studien, vilket ytterligare stöder effekten av detta analgesi protokoll. Tidigare rapporter har faktiskt funnit ett samband mellan smärta och kroppsvikten hos råttor som behandlades med icke-steroida antiinflammatoriska medel, såsom meloxikam47. Denna agent valdes i denna studie och föregripande administration härleddes från studier på råttor37,48 och hundar49, där administrationen av antiinflammatoriska medel omedelbart före operationen har befunnits dämpa kirurgiskt inducerad smärta. Funktion utvärderades som en ytterligare indikator av postoperativ smärta, med hjälp av ett poängsystem som utformad för att utvärdera användningen av båda bäcken lemmar. De tre aktiviteter väljs här ge en allmän bedömning av utbudet av rörelse och vilja att bära vikt på bäcken armar och ben. Detta poängsystem härleddes från både statisk och dynamisk funktionell återhämtning studier i råtta50,51 och syftade till att jämföra tidsförloppet för de funktionella resultat som observerats. Resultat indikerar att den bilaterala sena defekten inducerade en tillfällig minskning av funktion på 7 dagar, med återgång till det normala inom 28 dagar. Den funktionen poängen visas känsligare att upptäcka smärta sekundär till ortopediska förhållanden än RGS. Liknande funktionella tester har använts för att utvärdera senan healing såsom i Achilles funktionella Index28, tass och stegsensor åtgärder51, eller andra makroskopiska scoring system52.
Denna modell var utformad för att minska antalet djur som registrerats i studien, medan differentiera utfall mellan obehandlade senor och två stamceller-baserade behandlingar. Effekterna av de behandlingar som testas i denna studie diskuteras i en annan publikation36. Den modellen som används här tillåtna detektion av behandling skillnader med hjälp av en intern kontroll i varje råtta, kombinerat med oförstörande biomekanisk testning av senor på 28 dagar (data presenteras inte här).
Aktiverade luftkonditionerade plasma valdes på grund av dess gemensamma användning som bärare för stamceller, biokompatibilitet, tillgänglighet och nuvarande kliniska tillämpningar i förvaltningen av tendinopathies53,54. Det kan ha bidragit till läkning av behandlade senor, men tillåtna lokala lagring av stamceller, och det stör inte jämförelsen mellan behandlingsgrupperna, eftersom båda ingår samma mängd aktiverad luftkonditionerade plasma. Histologisk funktioner i obehandlad senor överensstämmer med tidigare beskrivningar av senan healing, där nekrotisk vävnad och störd kollagen buntar avlägsnas genom fagocytos och lytisk enzymer av makrofager under fasen inflammation, som varar upp till 10 dagar efter skada54,55,56. Under proliferativa fas är cellulär proliferation och vaskularitet av reparationsytan störst på 28 dagar efter att senan reparera57,58. Vi hittade ett samband mellan den skenbara förtjockning av senor, tvärsnittsarea och lägre elasticitetsmodul av exemplar. Baserat på dessa resultat, verkar den histologiska poängen spegla vävnadsförändringar som inte kanske är önskvärt och leder inte till biomekaniska styrka, såsom desorganisation av kollagenfibrer, angiogenes och kondrogenes. I framtiden kommer denna modell förmåga att diskriminera behandlingar baserade på histologiska egenskaper kan förbättras genom att integrera kompletterande kriterier såsom förekomsten av tenocytes, extracellular matrisorganisation, proteoglykan innehåll, och distribution av elastin fibrer52,59.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Dr Su, PhD, för hennes statistisk analys av data. Författarna också tacka Dr McClure, DVM, PhD DACLAM, för hennes råd på anestesi och smärta hanteringsprotokoll används i studien. Projektet stöddes av bidrag från Western University of Health Sciences kontoret av Vice President för forskning (12678v) och USDA avsnitt 1433 medel (2090).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 10x | Hyclone | SH30258.01 | Consumable |
| Collagenase type IA | Worthington | LS004197 | Consumable |
| DMEM low glucose | Hyclone | SH30021.FS | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | Consumable |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Hyclone | SV30010 | Consumable |
| Trypsin 0.25% | Hyclone | SH30042.01 | Consumable |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | Consumable |
| Trypan blue | Hyclone | SV30084.01 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | Consumable |
| Chitosan | Sigma | C3646 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | Consumable |
| Bovine Serum Albumin | Hyclone | SH30574.01 | Consumable |
| Round bottom polystyrene tube | Corning | 149591A | Consumable |
| Mouse anti-horse CD44 (FITC) | AbD serotec | MCA1082F | Consumable |
| Mouse anti-rat CD90 (FITC) | AbD serotec | MCA47FT | Consumable |
| Mouse anti-horse MHC-II (FITC) | AbD serotec | MCA1085F | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | AbD serotec | MCA928F | Consumable |
| Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | abcam | ab11415 | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | abcam | ab91356 | Consumable |
| Mouse anti-human CD34 (FITC) | BD | BDB560942 | Consumable |
| Mouse IdG1 kappa (FITC) | BD | BDB555748 | Consumable |
| 7-AAD | BD | BDB559925 | Consumable |
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD | Equipment | |
| Vacutainer 5 mL | Med Vet International | RED5.0 | Consumable |
| Acid-citrate-dextrose | Sigma | C3821 | Consumable |
| Calcium Chloride | Sigma | C5670 | Consumable |
| Sevoflurane | JD Medical | 60307-320-25 | Consumable |
| Rats | Charles River | Strain code: 400 | Experimental animal |
| Rat surgical kit | Harvard apparatus | 728942 | Equipment |
| Surgical Blade #15 | MEDLINE | MDS15115 | Consumable |
| Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet) |
Bio Serv | F06801 | Consumable |
| Polyglactin 910, 5-0 | Ethicon | J436G | Consumable |
| Eosin alchol shandon | Thermo scientific | 6766007 | Consumable |
| Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 143907 | Consumable |
References
- Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
- Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
- Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
- Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
- Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
- Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
- Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness? Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
- VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
- Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
- Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
- Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
- Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
- Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
- Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
- Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
- Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
- Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
- Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
- Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
- van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
- Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
- Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
- Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
- Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
- Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
- Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
- Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
- Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
- Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
- Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
- Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
- Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
- Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
- Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
- Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
- Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
- Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
- Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
- Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
- Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
- Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
- Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
- Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
- Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
- Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
- Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
- Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
- Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
- Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
- Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).
