Summary
Questo articolo descrive la preparazione e la valutazione di cordone ombelicale cellule staminali mesenchimali derivate matrice sferoidi con un modello di difetto bilaterale del tendine patellar in un ratto. Questo modello è stato associato con una morbilità accettabile ed è stato trovato per rilevare le differenze tra i tendini non trattati e trattati e tra i due trattamenti testato.
Abstract
Medicina rigenerativa fornisce romanzo alternative a condizioni che sfidano i trattamenti tradizionali. La prevalenza e la morbosità di tendinopathy tra le specie, combinata con le proprietà curative limitate di questo tessuto, hanno richiesto la ricerca di terapie cellulari e azionato lo sviluppo di modelli sperimentali per studiare la loro efficacia. Cordone ombelicale matrix-derivate cellule staminali mesenchimali (UCM-MSC) sono candidati attraenti perché sono abbondanti, facili da raccogliere, eludere le preoccupazioni di ordine etico e il rischio di formazione di teratoma, ma assomigliano più molto attentamente a cellule staminali embrionali primitive rispetto adulto tessuto-derivato MSCs. significativo interesse si è focalizzato su chitosano come strategia per migliorare le proprietà di MSCs attraverso la formazione della sferoide. Questa carta dettagli tecniche per isolare UCM-MSCs, preparare sferoidi su pellicola di chitosano e analizzare l'effetto di formazione della sferoide sull'espressione di superficie dell'indicatore. Di conseguenza, creazione di un modello di lesione bilaterale del tendine patellar in ratti è descritto per l'impianto in vivo di UCM-MSC sferoidi formata sulla pellicola di chitosano. Nessuna complicazione è stata osservata nello studio rispetto alla morbosità, sottolineare crescenti effetti, o l'infezione del tessuto. Il Punteggio totale funzionale dei ratti operati alle 7 giorni era inferiore a quello dei ratti normali, ma hanno rinviato al normale entro 28 giorni dopo la chirurgia. Istologici punteggi di guarigione del tessuto ha confermato la presenza di un coagulo nei trattati difetti valutati a 7 giorni, assenza di reazione da corpo estraneo e progredendo guarigione a 28 giorni. Questo modello di difetto del tendine della rotula bilaterale controlla la variabilità inter-individuale tramite creazione di un controllo interno in ogni ratto, era associato con la morbosità accettabile e ha permesso la rilevazione delle differenze tra i tendini non trattati e trattamenti.
Introduction
Lesione del tendine è una delle più comuni cause di atrofia del muscolo e dolore significativo tra specie1. In medicina veterinaria, tendine e lesioni ai legamenti sono di particolare interesse per i cavalli, come 82% di tutte le lesioni in cavalli da corsa coinvolgere il sistema muscolo-scheletrico, e 46% di quelli interessare tendini e legamenti2,3. Formazione di tessuto cicatriziale colpisce le proprietà biomeccaniche dei tendini guariti e spiega la prognosi custodita per ritorno all'uso atletico dopo lesioni del tendine del flessore; re-infortunio si verifica entro 2 anni in fino al 67% di cavalli trattati conservativamente4. Medicina rigenerativa fornisce alternative romanzo ad una condizione che sfida i trattamenti tradizionali. Terapia con cellule staminali autologhe ha prodotto alcuni risultati incoraggianti5,6 , ma è limitata dalla morbosità connessa con la raccolta di tessuto, amministrazione in ritardo a causa di elaborazione/riprogrammazione delle cellule e l'influenza della lo stato di salute del paziente (ad esempio età) sulle proprietà delle staminali cellule7,8. Queste limitazioni forniscono una spiegazione razionale per lo studio di cellule staminali allogeniche in alternativa disponibile immediatamente. Cellule derivate da annessi fetali sono candidati attraenti perché essi eludere le preoccupazioni di ordine etico e rischio di formazione di teratoma è associata con le cellule staminali embrionali. Tra annessi fetali, matrice del cordone ombelicale (UCM), anche denominato gelatina di Wharton, è abbondante e facile da raccogliere.
Indipendentemente dall'origine delle cellule, migliorando la staminalità è indispensabile istituire una banca di cellule per trapianto allogenico medicina rigenerativa. Da un punto di vista funzionale, staminalità può definirsi il potenziale di differenziazione di auto-rinnovamento e multi-lignaggio9. Prova di staminalità si basa sulla proliferazione e differenziamento saggi, con l'espressione di gene marcatori Oct4, Sox2 e Nanog9. Una strategia per migliorare la staminalità si basa sull'uso di biomateriali per servire come Sub riempitivi e vettori migliorando la proliferazione e la differenziazione di UCM-MSCs. Questo approccio elimina le preoccupazioni relative alla manipolazione di fattori trascrizionali per riprogrammare cellule mature in cellule pluripotenti indotte. Tra biomateriali considerati come potenziali vettori per le cellule staminali, chitosano è attraente per la sua biocompatibilità e degradabilità10. Questo aminopolysaccharide naturale è formata da deacetilazione alcalina della chitina, il secondo più abbondante polisaccaride naturale, ottenuta principalmente come un sottoprodotti di crostacei10. In precedenza abbiamo studiato le interazioni tra MSCs e chitosano scaffold e osservato la formazione di sferoidi11,12,13,14,15, 16. abbiamo anche segnalato sulla superiorità di Condrogenesi il chitosano matrici12,13,14,15,16,17, 18. Più recentemente, due studi indipendenti hanno descritto sferoidi formazione di tessuto adiposo e placenta tessuto derivato MSCs coltivate su una pellicola di chitosano19,20. Questa formazione di sferoidi non solo migliorato la staminalità, ma anche migliorato la conservazione di cellule staminali dopo in vivo l'impianto20.
La prevalenza e la morbosità di tendinopathy attraverso le specie hanno richiesto lo sviluppo di modelli sperimentali per studiare la fisiopatologia delle tendinopatie e testare nuove terapie come iniezioni di cellule staminali. Nei cavalli, indotta da collagenosi tendinite è un modello comune per dimostrare l'efficacia utilizzando MSCs nel tendine riparazione21. La rilevanza di questo approccio è limitata, come iniezioni causano cambiamenti infiammatori acuti, mentre tendinopatie cliniche sono generalmente frutto di cronica affaticare22,23. Inoltre, induzione chimica della malattia del tendine induce una risposta di guarigione e non replica il processo di guarigione alterato presente in casi clinici22,23. L'asportazione di un segmento del tendine flessore superficiale è stato descritto come un modello chirurgico di tendinite in cavalli24. Più recentemente, è stato utilizzato un approccio mini-invasivo per limitare il danno traumatico al nucleo centrale del tendine flessore superficiale25. Modelli chirurgici non simulare il meccanismo di affaticamento che può condurre alla malattia naturale del tendine e tendono alla mancanza di riproducibilità nell'entità del danno creato25. Indipendentemente dal modello, morbilità e costi associati modelli equine del tendine malattie sono ulteriori limitazioni, che giustificano un interesse nei modelli del roditore come un primo passo per la valutazione in vivo di nuove terapie.
Uno dei principali vantaggi dei modelli sperimentali in roditori è costituito dal costo e la capacità di controllare la variabilità inter-individuale. Roditori possono essere standardizzate riguardo ai vari fattori fisiologici a causa dei loro tassi di crescita rapida e relativamente brevi durate, limitazione delle fonti di variazione e riducendo pertanto il numero di animali necessari per rilevare le differenze. Strategie per indurre malattie del tendine in roditori hanno contato su induzione chimica, ma anche sulla creazione chirurgica di parziale del tendine difetti21. Modelli chirurgici possono simulare naturale tendinopatie meglio di modelli chimici, ma possono portare a più alta morbilità e fallimento catastrofico del tendine danneggiato. A tale proposito, ratti sembrano candidati migliori rispetto ai topi per questi modelli, come la loro dimensione consente la creazione di più grandi difetti, facilitando così la valutazione della guarigione dei tessuti. Ratti Sprague-Dawley sono stati utilizzati in studi sperimentali di tendinopatie in quattro gruppi principali del tendine: cuffia dei rotatori, flessori, Achille e tendini patellar26. Tra questi modelli che coinvolgono il tendine rotuleo sono particolarmente attraente per la taglia più grande di questo tendine e la facilità di accesso allo stesso27. Il tendine rotuleo si attacca il muscolo quadricipite alla tuberosità tibiale. All'interno di questo meccanismo dell'estensore, la rotula è un osso sesamoide che dirige l'azione del quadricipite e delinea il limite prossimale del tendine rotuleo. La presenza di ancoraggi ossute gli extent prossimali e distali del tendine patellar facilita prove biomeccaniche. Modelli che tipicamente coinvolgono il tendine rotuleo si basano sui vizi chirurgiche unilaterale, con un tendine intatto controlaterale che serve come un controllo28,29. Il modello più diffuso di difetto tendine rotuleo coinvolge asportare la parte centrale (1 mm di larghezza) del tendine rotuleo dall'apice distale della rotula per l'inserimento della tuberosità tibiale, mentre il tendine rotuleo controlaterale è lasciato intatto. Misure dei risultati hanno incluso l'istologia, prove biomeccaniche distruttive o prove biomeccaniche per fallimento, formazione immagine di ultrasuono, ex vivo imaging di fluorescenza, lordo osservazione e test funzionali28,30 ,31. Modelli unilaterale non permettere il confronto di un trattamento proposto con l'amministrazione conservatrice di una ferita simile all'interno dello stesso animale. Allo stesso modo, il confronto tra diversi trattamenti richiede animali separati. Un modello bilaterale sarebbe eliminare le variazioni inter-individuali e ridurre il numero di animali necessari per un Studio32. Tuttavia, le lesioni bilaterali possono aumentare la morbosità e zoppia bilaterale potrebbe ostacolare la valutazione della terapia. Alcuni studi segnalano brevemente l'uso bilaterale del tendine patellar difetti di ratti ma si concentrano sugli effetti di trattamenti anziché amministrazione peri-attiva e morbosità del modello33,34.
Obiettivo a lungo termine di questo studio è quello di sviluppare una strategia per migliorare la sopravvivenza di staminalità e in vivo di UCM-MSCs destinati al trapianto allogenico. Per raggiungere questo obiettivo, recentemente abbiamo segnalato staminalità migliorata di UCM-MSCs dalla formazione di sferoidi sulla pellicola di chitosano e incubazione sotto ambiente ipossico35. Queste proprietà in vitro sono state associate con migliorate proprietà biomeccaniche del tendine rotuleo difetti trattati con condizionata UCM-MSCs. basato su questi risultati, il modello di difetto bilaterale del tendine patellar del ratto sembra adatto a testare il candidato trattamenti per tendine lesioni36. Lo scopo dello studio segnalato qui è quello di fornire protocolli dettagliati per isolamento e caratterizzazione di UCM-MSCs, preparazione di un sistema di consegna biologico per le cellule staminali, creazione e trattamento di difetti del tendine della rotula bilaterale e post-operatorio recupero e valutazione di guarigione all'interno dei difetti dei tessuti.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Western University of Health Sciences.
1. isolamento ed espansione di cellule staminali mesenchimali da cordone ombelicale equino Matrix
- Ottenere la placenta da un mare adulto (incinto) dopo osservato parto e asetticamente isolare il cordone ombelicale dalla placenta. Tenere il cordone ombelicale in tampone fosfato salino (PBS) con 1% di penicillina-streptomicina (P/S) a 4 ° C durante il trasferimento fino al trattamento.
- Lavare il cordone ombelicale due volte con temperatura ambiente PBS con 1% P/S in un tubo da 50 mL. Sezione il cordone ombelicale in frammenti 2-pollice-lungo su 150 mm piastra e lavare a temperatura ambiente PBS con 1% P/S in un tubo da 50 mL due o tre volte, fino a quando la maggior parte del sangue è risciacquato.
- Tagliare il cordone ombelicale longitudinalmente per esporre i vasi. Rimuovere le navi, incluse 2 arterie e una vena un gambo allantoico da cavo con pinze e le forbici. Raccogliere la matrice del cordone ombelicale (gelatina di Wharton), ovvero i vasi circostanti di matrice gelatinosa, su un piatto di 150mm raschiando con un bisturi, e tritare la gelatina in pezzi pregiati.
- Gelatina di Wharton posto da 2 – 3 del cordone ombelicale frammenti (circa 12 – 15 g) in un tubo da 50 mL con 15 mL di soluzione di tipo IA collagenosi 0,1% (p/v) in PBS. Incubare a 37 ° C con agitazione delicata per 3-4 h fino a completa dissoluzione.
- Centrifugare il tessuto digerito a 300 x g per 15 min e aspirare il surnatante. Risospendere tessuto digerito in 15 mL di temperatura PBS con 1% P/S, Miscelare pipettando, centrifugare a 150 x g per 5 min e aspirare il surnatante (lavaggio). Ripetere il lavaggio due volte più.
- Risospendere lavato cellule in 15 mL di temperatura PBS con 1% P/S, Miscelare pipettando, ceppo di con filtro di 100 µm cella, centrifuga a 150 x g per 5 min e aspirare il surnatante.
- Preparare il terreno di coltura (CM) con glucosio basso Dulbecco Medium dell'Aquila per volta (LG-DMEM) con siero bovino fetale (FBS) e 1% P/S. sterilizzare il medium di filtrazione.
- Risospendere le cellule sforzate in 10 mL di CM pre-riscaldato a 37 ° C, Miscelare pipettando, trasferire in un matraccio di cultura del tessuto2 25cm e incubare 5% CO2 al 90% di umidità e 37,0 ° C. Cambiamento CM ogni 3 giorni fino a quando la cultura raggiunge la confluenza di 70 – 80%, quando la cultura sarà essere attraversata.
- Per la cultura del passaggio, aspirare CM dalla boccetta, lavare due volte con 5 mL di PBS di temperatura e staccare con 3 mL di 0,25% acido di tripsina/etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 37 ° C per 5 min.
- Neutralizzare la tripsina/EDTA con 6 mL di CM pre-riscaldato a 37,0 ° C, Miscelare pipettando, trasferire in una provetta da 15 mL, centrifuga a 150 x g per 5 min e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule indipendenti in 1 mL di CM, Miscelare pipettando. Contare le cellule vitali utilizzando trypan blu e un emocitometro. Reseeding in un matraccio di cultura del tessuto2 25cm a 5.000 cellule/cm2ed incubare 5% CO2 al 90% di umidità e 37,0 ° C.
2. preparazione di sferoidi con UCM-MSCs coltivate sulle pellicole di chitosano
- Per preparare 100 mL di soluzione di chitosano 1% (p/v), aggiungere 1 g di chitosano in 99 mL di acqua distillata (dH2O) e mescolare bene con un agitatore magnetico.
- 670 µ l di acido acetico glaciale e continuare a mescolare fino a quando il chitosano si scioglie e diventa viscoso. Questo di solito prende 3-4 h.
- Aggiungere 500 µ l di soluzione di chitosano in ciascun pozzetto della piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti, e agitare la piastra per distribuire uniformemente la soluzione di chitosano e coprire tutta la superficie di fondo.
- Asciugare la piastra di soluzione rivestito di chitosano sotto flusso laminare senza una copertura durante la notte per 24 h. Una volta essiccato, film sottile sarà formata e aderito alla piastra.
- Neutralizzare il chitosano pellicola aggiungendo 1 mL di soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 0,5 N in ogni pozzetto e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. NaOH da ciascun pozzetto di aspirare e lavare ogni bene con 1 mL di dH2O tre volte. Lavare ogni bene con 1 mL di etanolo al 70% (EtOH) una volta.
- Per sterilizzare chitosano film, aggiungere 1 mL di 70% EtOH in ciascun pozzetto ed incubare durante la notte a flusso laminare mobile. Aspirare EtOH rimanenti da ogni pozzetto nel giorno seguente. Lavare ogni bene con 1 mL di PBS sterile tre volte. Sterilizzare il chitosano film con luce ultravioletta sotto flusso laminare durante la notte senza una copertura.
- A sferoidi forma di UCM-MSCs, semi espansa e attraversate le cellule in ogni pozzetto a 5.000 cellule/cm2e incubare in 5% CO2 al 90% di umidità e 37,0 ° C.
Nota: Le cellule possono essere incubate sotto ipossia o normoxia, a seconda dell'interesse del ricercatore.
3. espressione di marcatori di superficie analizzata tramite flusso Cytometry
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Preparazione di una sospensione singola cella
- Piastra standard
- Rimuovere il mezzo da ogni pozzetto e lavare due volte con PBS di temperatura.
- Staccare le cellule con 500 µ l di reagente di dissociazione una cella in ogni pozzetto di una piastra 12-pozzetti per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di buffer (PBS contenente 0.5% BSA) la macchiatura in ciascun pozzetto e Miscelare pipettando per staccare le cellule.
- Trasferire la sospensione di cellule in provetta conica da 15 mL e centrifugare a 150 x g per 5 min.
- Piastra di chitosano
- Raccogliere tutti gli sferoidi di aspirante medio utilizzando una pipetta con una punta di 1.000 µ l. Termovettore raccolti in una provetta conica da 15 mL. Dopo aver raccolto medio, lavare bene aggiungendo 1 mL di PBS e trasferire PBS lavato lo stesso tubo conico da 15 mL.
- Centrifugare sferoidi a 150 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 500 µ l del reagente di dissociazione delle cellule (per esempio, accutase) e incubare per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente. Mescolare di pipettaggio utilizzando una punta da 1 mL fino a sferoidi dissociano e non sono più visibili.
- Aggiungere 1 mL di tampone colorazione nella sospensione unicellulare e centrifugare a 150 x g per 5 min.
- Piastra standard
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Celle di lavaggio
- Rimuovere il surnatante dal tubo conico e risospendere le cellule in 3 mL di buffer di colorazione fredda. Mantenere le cellule sul ghiaccio in tutto esperimento da questo passaggio.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min (lavaggio).
- Lavare due volte.
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Macchiatura delle celle
- Centrifugare a 300 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.
- Conta cellule vitali utilizzando un trypan blu e un emocitometro. Risospendere 1 x 106 cellule in 50 µ l blocco buffer (PBS contenente 10% di siero equino) e incubare per 30 min in ghiaccio.
- Aggiungere 10 µ l della fluorescina isotiocianato di fluoresceina (FITC) coniugato anticorpi (CD44, CD90, CD105, CD34, (istocompatibilità complex MHC) di classe II o controllo di isotipo per ciascun anticorpo) e 40 µ l di tampone di colorazione, quindi incubare protetta dalla luce per 1h sul ghiaccio.
- Aggiungere 3 mL di buffer di colorazione fredda e mescolare, centrifugare a 300 x g per 5 min e aspirare il surnatante (lavaggio).
- Ripetere il lavaggio due volte.
- Risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di tampone di colorazione
- Aggiungere 5 µ l di 7-AAD (tintura di vitalità) e incubare per 30 min in ghiaccio
- Analizzare i campioni delle cellule macchiato da citometro a flusso. Escludere i detriti da loro piccoli SSC e FSC e identificare cellule vitali con assorbimento inferiore di 7-AAD. Plot FL1 e FL2 su y - e assi x, rispettivamente. Isotype controllo consente di creare un cancello sopra la linea diagonale. Misurare la percentuale di cellule positivamente marcate nella zona. Contare almeno 20.000 eventi/campione (complementare figura 1).
- Misurare la percentuale di cellule colorate con gli anticorpi di gating cellule vitali e auto-fluorescenza e sottrarre la percentuale di cellule colorate con controllo di isotipo.
4. bilaterale del tendine Patellar difetto modello nel ratto
- Selezionare ratti Sprague-Dawley (adulti maschi, 4-5 mesi, 350 – 375 g di peso corporeo). Notare le dimensioni relativamente grandi dei ratti utilizzato per questo modello.
- Anestetizzare e applicare lubrificante occhio artificiale il ratto con sevoflurane 8% a 2 L/min 100% ossigeno erogato tramite maschera, fino alla scomparsa del riflesso di pizzico-punta nella camera di induzione.
- Somministrare un'iniezione intramuscolare di Meloxicam (1 mg/kg) come preemptive analgesia.
- Posto il ratto tra due bottiglie da 0,5 L acqua riempita con acqua calda e coperto con un panno per mantenere la temperatura corporea e la posizione, evitando la ferita della pelle. Nastro ogni estremità alla tabella. Per ridurre il rischio di ipotermia, coprire il corpo con pluriball (Figura 1).
- Mantenere l'anestesia con flusso continuo di sevoflurane 5% nella miscela di ossigeno 100% 1L via cono di naso, con l'animale in decubito dorsale, il rilievo di riscaldamento dell'acqua.
- Per evitare traumi cutanei, non agganciare i siti chirurgici. Al contrario, applicare crema di rimozione dei capelli sopra entrambi soffoca. Per rimuovere la crema ed i capelli, utilizzare un abbassalingua.
- Strofinare il sito chirurgico con chlorhexidine digluconate macchia e risciacquare con etanolo al 70% 3 volte.
- Incidere la pelle con una lama per bisturi #15 sterile in senso prossimale a distale, l'aspetto craniomedial della soffocano. Avviare l'incisione di circa 1 cm prossimale al livello della patella ed estenderlo distale al tubercolo tibia di circa 5 mm.
- Riflettere la pelle per esporre il tendine rotuleo liberando il tessuto sottocutaneo sottostante con una lama per bisturi #15.
-
Utilizzando la lama per bisturi #15, asportare il terzo centrale di ogni tendine rotuleo (1 mm) dalla funzione distale della rotula alla tuberosità tibiale.
- Allineare un filo di Kirschner 0.99 mm-diametro contro il tendine come modello per standardizzare le dimensioni del difetto in ogni arto (Figura 2).
- Fare 2 incisioni di pieno-spessore su ogni lato del filo di Kirschner con una lama per bisturi #15 per isolare la porzione centrale del tendine (Figura 3). Resecare la sezione centrale prossimalmente e distalmente con forbice Iris (Figura 4).
- Prima di chiudere la fascia della soffocano, inserire il coagulo (sospensione cellulare mista e ACP) per i gruppi di trattamento appropriato, come descritto in 5.5. Chiudere la fascia con un motivo crociato e la pelle con un modello intradermica 5-0 polyglactin 910 suture (Figura 5).
- Ripetere la procedura sul ginocchio controlaterale.
Nota: Un difetto viene assegnato casualmente ad un trattamento (cellule staminali condizionato il chitosano o coltivate su piastre standard). Il difetto controlaterale viene lasciato vuoto, per servire come controllo interno. - Dopo la chirurgia, amministrare 4 compresse di enrofloxacina (2 mg/compressa, per via orale, una volta al giorno) e una tavoletta di meloxicam (2 mg/compressa, per via orale, una volta al giorno) per 7 giorni. Queste dosi sono state consigliate da un veterinario di animali di laboratorio e approvate nel protocollo IACUC.
5. consegna di MSCs all'interno del difetto di tendine rotuleo
- Anestetizzare un topo sano che non viene utilizzato per la creazione di difetto del tendine rotuleo con sevoflurane 8% a 2 L/min 100% ossigeno erogato tramite maschera, fino alla scomparsa del riflesso di pizzico-punta nella camera di induzione.
- Raccogliere 5 mL di sangue da puntura cardiaca dal ratto Sprague-Dawley anestetizzato (adulti maschi, 4-5 mesi, 350 – 375 g di peso corporeo), in una siringa da 5 mL con ago 20 G contenente 1 mL di acido-citrato-destrosio (5:1 v/v).
- Eutanasia del ratto dopo puntura cardiaca e raccolta del sangue, tramite l'iniezione intracardiaca di pentobarbital (100 mg/kg), mentre sotto l'anestesia stessa.
- Centrifugare il campione a 350 x g per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante e conservare le aliquote (120 µ l) a-20 ° C fino all'utilizzo.
- Immediatamente prima in vivo dell'impianto, scongelare l'aliquota di cui sopra e mescolare 20 µ l con 0,5 x 106 MSCs (da 1,9 o 3.1.2.1) staccato da piastre standard con tripsina/EDTA o raccogliere da chitosano piastre di vampate di calore (con PBS/medio).
- Aggiungere 6 µ l di 10% cloruro di calcio (CaCl2) per il restante 100 µ l di plasma scongelato in un pozzo di piastra a 96 pozzetti per attivare il plasma e indurre la formazione di un coagulo (attivato condizionato al plasma: ACP).
- Mescolare la sospensione cellulare (20 µ l) e ACP (100 µ l) per formare un coagulo (Figura 6). Posizionare il coagulo all'interno del tendine rotuleo difetto creato prima di chiudere la fascia della soffocano (vedi passo 4.10.3).
6. functional Outcome
- Ratti di monitorare due volte al giorno per segni di dolore, basato sul ratto smorfia scala (RGS)37,38 ed il gonfiamento sopra i siti di impianto.
Nota: Un sistema di Punteggio (0-6) è stato sviluppato per valutare la funzione ambulatoria basato su 3 attività, tra cui temporizzata dell'arto in piedi con arti anteriori supportati (0-3), cronometrato in piedi senza aiuto dell'arto (0 – 2) e la capacità di scalare una gabbia plastica parete (0 – 1) (17cm Tabella 1). - Valutare ratti per le due attività in piedi dell'arto al mattino e alla sera di ogni punto del tempo per calcolare un punteggio medio.
- Valutare ratti per poter correttamente scalare una parete di plastica gabbia di 17cm con entrambi gli arti posteriori, raggiungendo la cima.
7. lordo aspetto e l'istopatologia del tendine rotuleo
- Eutanasia di ratti a 7 giorni (per valutare l'infiammazione) o 28 giorni (per valutare la guarigione dei tessuti) post-trattamento mediante iniezione intracardiaca di pentobarbital (100 mg/kg) in anestesia con sevoflurane 8% e 2 L 100% ossigeno trasportato tramite maschera.
- Vendemmia unità della tuberosità rotula-tendine-tibia di bisturi e forbici dopo l'eutanasia. Rimuovere i tessuti molli e legamenti intorno la soffocano, fatta eccezione per il tendine rotuleo.
- Esaminare ciascun campione per apparenza lorda ed ispessimento del tendine (Figura 7).
- Orientare il preparato inserendo un nodo del chirurgo di 5.0 polidioxanone sull'aspetto prossimale e laterale del tendine. Fissare ogni campione in soluzione di formalina neutra tamponata 10% e ottenere sezioni trasversali (5 µm) da metà di-parte del ogni tendine.
- Macchia le sezioni con ematossilina ed eosina e Trichrome di Masson macchiatura seguendo protocolli standard.
- Esaminare la sezione per rilevare la presenza di ematoma all'interno del difetto, come pure i cambiamenti patologici quali l'infiammazione.
- Valutare il punteggio istologico delle sezioni utilizzando il sistema di Punteggio precedentemente pubblicato, basato sul grado di collagene, grado di angiogenesi e cartilagine formazione (tabella 2)39.
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Representative Results
Nello studio corrente, i risultati sono presentati come media ± deviazione standard (deviazione standard). Le cellule sono state isolate dai cavi ombelicali di 6 mares, e percentuale di linee cellulari isolate che esprimono ogni indicatore della superficie delle cellule sotto condizionata standard o chitosano sono stati confrontati con un test di Friedman, come un'analisi della varianza non parametrica con ripetuto misure. Per la creazione di modelli di difetto del tendine, 8 ratti sono stati usati per la valutazione post-operatorio di 7 giorni e 12 ratti sono stati usati per la valutazione di 28 giorni. Risultati degli esiti funzionali sono presentati come media ± SEM (errore standard della media) e confrontati utilizzando il t-test. UCM è stata selezionata come una fonte cellulare grazie alla sua abbondanza, facilità di raccolta e proliferazione superiore rispetto altri annessi fetali fonti40. Cellule isolate da UCM coltivate su piastre standard mantenuto una forma di fibroblasto-come in tutta l'espansione. Le cellule formano sferoidi quando coltivate su chitosano piastra (Figura 8).
La maggior parte delle cellule coltivate in condizioni standard espresso CD44 (98,6 ± 1,62%), CD90 (88,7 ± 3.04%) e CD105 (77,9 ± 6,84%), mentre l'espressione di CD34 (± 0,07 0,17%) e MHC II (± 1,33 1,12%) erano molto bassi. Sotto coltura condizionato, i livelli di espressione di CD44 (97,0 ± 2,12%) e CD34 (1,13 ± 1,58%) non hanno differito da culture standard, mentre i livelli di espressione di CD90 (33,3 ± 37,1%) e CD105 (54,0 ± 19,0%) è diminuito e MHC II (2,84 ± 0,98%) ha aumentato35.
A seguito di isolamento e caratterizzazione di UCM-MSCs in vitro, il comportamento biologico delle cellule condizionate è stato confrontato a quello delle cellule coltivate in condizioni standard in un modello di difetto bilaterale del tendine patellar in ratti. Difetti non trattati in ogni ratto servita come controlli interni. Post-operatorio gonfiore era minimo in tutti i ratti e risolta entro 48h. Secondo la RGS, nessuno dei ratti visualizzati segni di dolore o angoscia come orbitale che stringe, naso/guancia appiattimento, o modifiche di orecchio/whisker. Tutti i ratti hanno consumato una gamma normale di 3 – 4 pellet o 15 – 20 grammi di mangime al giorno in tutto lo studio. Il punteggio funzionale totale, tra cui assistita e non assistita dell'arto in piedi così come arrampicata punteggi era più alto nei ratti normali rispetto a quella dei ratti azionati a 7 giorni (n = 8, p < 0,0001, tabella 3). Tuttavia, il punteggio totale funzionale hanno rinviato al normale entro 28 giorni dopo la chirurgia (n = 12, p = 0,78). Di conseguenza, modelli di difetto bilaterale del tendine patellar del ratto hanno dimostrati di essere efficace per limitare la variabilità inter-individuale e riducendo il numero di animali necessario senza causare la morbosità significativa (Video 1–5).
Circa il 37% dei tendini raccolti a 28 giorni è comparso contrassegnato ispessito (Figura 7). Questo ispessimento è stata equamente distribuito tra difetti vuoti e trattati. Punteggi totali istologici è aumentato con tempo in difetti non trattati (n = 20, p = 0,0034). Quando ogni componente della partitura guarigione è stata valutata in maniera indipendente, l'unico parametro cambiare con il tempo ha consistito di formazione della cartilagine, che è aumentato tra 7 e 28 giorni (n = 20, p < 0,0001). L'angiogenesi ha teso ad aumentare con il tempo (p = 0,3), ma non hanno differito la formazione del collagene (p = 0,69). All'esame istologico, l'infiammazione è stata osservata in tutte le sezioni di tessuto dei tendini esaminate a 7 giorni dopo l'intervento chirurgico, indipendentemente dalla presenza del trattamento. Un ematoma era presente in tutti i difetti di trattati. Gol di angiogenesi istologico (tabella 2, Figura 9) hanno variato da 0 a 1, suggerendo arteriola moderata e infiltrazione capillare, mentre il grado di collagene punteggi (tabella 2, Figura 10) hanno variato da 2 a 3 complessiva, suggerendo Formazione di collagene moderata a vasto. Gol di formazione di cartilagine (tabella 2, Figura 11) hanno variato da 0 a 2 non suggerendo nessuna formazione di cartilagine, per moderare la formazione della cartilagine del 25% al 50% dell'area della sezione del tendine. Tutti i dati istologici sono orientati con il lato sinistro come l'aspetto anteriore e la parte superiore come la funzione mediale della sezione trasversa del metà di-parte del tendine.
Figura 1: posizionamento di ratti e di preparazione per la chirurgia asettica. Ogni ratto è stato collocato tra due bottiglie di acqua 0,5 L riempita con acqua calda e coperto con un panno per mantenere la temperatura corporea e la posizione, evitando la ferita della pelle. Le estremità di ogni ratto piazzate sotto il tavolo e il suo corpo era coperto con pluriball. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: modello chirurgica del difetto di tendine rotuleo (allineamento). Un filo di Kirschner 0.99 mm di diametro è allineato contro il tendine come modello per standardizzare le dimensioni del difetto in ogni arto.
Figura 3: modello chirurgica del difetto di tendine rotuleo (incisioni). Vengono praticate due incisioni di pieno-spessore su ogni lato del filo di Kirschner per isolare una porzione centrale del tendine.
Figura 4: modello chirurgica del difetto di tendine rotuleo (resezione). La sezione centrale è resecata prossimalmente e distalmente, creando un difetto corrispondenti dimensioni del filo di Kirschner. Zona resecato viene mostrato all'interno della casella di linea tratteggiata.
Figura 5: aspetto post-operatorio di azionamento soffoca. Fascia è stata chiusa con un motivo crociato e pelle era chiuso con un reticolo intradermico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: preparazione di plasma condizionato attivato per la consegna di UCM-MSCs. Le cellule staminali sono state sospese nel plasma condizionato prima dell'attivazione. Il coagulo risultante è stato inserito nel tendine patellar difetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Lordo di aspetto normale (C, D) e ispessita (A, B) tendini. (A, C) Viste posteriore; (B, D) Viste laterali; Frecce blocchi identificano la tibia e frecce sottili identificano i tendini.
Figura 8: morfologia delle cellule coltivate su coltura tissutale piastra inferiore 19% livello di ossigeno (gruppo standard: A) e chitosano pellicola inferiore 5% livello di ossigeno (gruppo condizionato: B). isolato cellule erano fusiformi il gruppo standard (A) e formato sferoidi il gruppo condizionato (B). Barra della scala = 400 µm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: rappresentante luce micrografie utilizzati per la classificazione di angiogenesi. Dopo 7 giorni di guarigione, tendini con nessun trattamento ha ricevuto un grado di 0 (A, D), mentre quelli con condizionate (C, F) o celle celle standard (B, E) hanno ricevuto un grado di 0,5 e 0, rispettivamente. 28 giorni, tendini non trattati (G, J) ha ricevuto un grado di 0, mentre quelli con condizionato di cellule (I,L) o celle standard (H,K) ha ricevuto un punteggio di 1.0 e 0.5, rispettivamente. Le frecce per identificare i vasi sanguigni presenti nel campione del tendine. Le frecce che puntano ai vasi sanguigni in 100 X ingrandimento corrispondono alle stesse frecce che puntano ai vasi sanguigni nell'ingrandimento 400x. Tessuto normale del tendine (M, N). Colorazione tricromica di Masson (A, B, C, G, H, I, M); macchia dell'eosina e (D, E, F, J, K, L, N); Barra della scala = 100 µm (A-N). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: rappresentante luce micrografie utilizzati per la classificazione di collagene. Dopo 7 giorni di guarigione, tendini con nessun trattamento ha ricevuto un grado di 2.5 (A, D) mentre quelli con trattamento (B, C, E, F) ha ricevuto un voto di 3.0. 28 giorni, tendini non trattati (G, J) ha ricevuto il voto 3.0, mentre quelli con condizionato di cellule (I, L) o celle standard (H, K) ricevute punteggi di 1.0 e 3.0, rispettivamente. La disorganizzazione delle fibre del tendine può essere apprezzata in 400 intarsiato di X (H, K). Tessuto normale del tendine (M, N). Colorazione tricromica di Masson (A, B, C, G, H, I, M); macchia dell'eosina e (D, E, F, J, K, L, N); Barra della scala = 100 µm (A-N). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: rappresentante luce micrografie utilizzati per la classificazione della cartilagine. Dopo 7 giorni di guarigione, tendini con nessun trattamento (A, D), quelli con sia condizionata celle (C, F) o standard (B, E), tutti hanno ricevuto un grado di 0. 28 giorni, tendini non trattati (G, J) ha ricevuto il voto 1.0, mentre quelli con condizionato di cellule (I, L) o celle standard (H, K) ricevute punteggi di 0 e 2.0, rispettivamente. Le frecce puntano a condrociti presenti nel campione del tendine. Le frecce che puntano a condrociti in 100 X ingrandimento corrispondono alle stesse frecce che punta a condrociti in 400 ingrandimenti. Tessuto normale del tendine (M, N). Colorazione tricromica di Masson (A, B, C, G, H, I, M); macchia dell'eosina e (D, E, F, J, K, L, N); Barra della scala = 100 µm (A-N). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: valutazione della funzione ambulatoria in ratti. Cronometrato in piedi senza aiuto dell'arto (1 – 5 s: Punteggio 1) è stata osservata postoperatorio 4 h. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 2: valutazione della funzione ambulatoria in ratti. Cronometrato dell'arto in piedi con arti anteriori assistiti (0 – 5 s: Punteggio 0) è stato notato 4 h post operativamente. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 3: valutazione della funzione ambulatoria in ratti. Cronometrato in piedi senza aiuto dell'arto (1 – 5 s: Punteggio 1), cronometrato dell'arto in piedi con arti anteriori assistiti (5 – 10 s: Punteggio 1) è stato notato 14 giorni post operativamente. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 4: valutazione della funzione ambulatoria in ratti. Cronometrato dell'arto in piedi con arti anteriori assistiti (10 – 15 s: Punteggio 2), senza la possibilità di scalare una parete di plastica gabbia 17cm (nessuna arrampicata: Punteggio 0) è stata notata 27 giorni post operativamente. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 5: valutazione della funzione ambulatoria in ratti. Cronometrato dell'arto in piedi con arti anteriori assistiti (5 – 10 s: Punteggio 1), con la possibilità di scalare una parete di plastica gabbia 17cm (Sì: Punteggio 1) è stato notato 14 giorni post operativamente. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
| Test funzionale | 0 | 1 | 2 | 3 | Punteggio ottenuto |
| Dell'arto posteriore stand assistita | 0 – 5 s | > 5 – 10 s | > 10 – 15 s | > 15 s | |
| Stand dell'arto senza assistenza | 0 – 1 s | > 1 – 5 s | > 5 s | ||
| Capacità di arrampicata | No | Sì | |||
| Totale |
Tabella 1: Scoring system per valutare la funzione ambulatoria in ratti. Un sistema di Punteggio (0-6) è stato sviluppato per valutare la funzione ambulatoria basato su 3 attività tra cui temporizzata dell'arto in piedi con arti anteriori supportati (0 – 3), cronometrato in piedi senza aiuto dell'arto (0 – 2) e la capacità di scalare una parete di plastica gabbia 17cm (0 – 1).
| Grado di collagene | |||||
| 0 | Collagene normale orientata tangenzialmente | ||||
| 1 | Cambiamenti delicati con fibre di collagene inferiore al 25% disorganizzato | ||||
| 2 | I cambiamenti moderati con le fibre di collagene tra 25% e 50% disorganizzato | ||||
| 3 | I profondi cambiamenti con collagene più del 50% disorganizzato | ||||
| Grado di angiogenesi | |||||
| 0 | Moderata infiltrazione del tessuto con arteriole | ||||
| 1 | Presenza di capillari | ||||
| 2 | Nessuna infiltrazione del sistema vascolare | ||||
| Formazione della cartilagine | |||||
| 0 | Nessuna formazione di cartilagine | ||||
| 1 | Noduli di cartilagine ialina isolato | ||||
| 2 | Formazione della cartilagine moderata del 25% al 50% | ||||
| 3 | Formazione della cartilagine vasto, più del 50% del campo coinvolto | ||||
Tabella 2: Istologia segnando gradi. Il punteggio delle sezioni istologico sono stato classificato basato sul grado di collagene, grado di angiogenesi e la formazione della cartilagine (adattato da Rosenbaum et al. 39)
| Gruppo | Media ± SEM |
| Normale (n = 3) | 6.00 ± 0,48 |
| 7 giorni dopo la chirurgia (n = 8) | 2,25 ± 0,30 |
| 28 giorni dopo la chirurgia (n = 12) | 5.83 ± 0,24 |
Tabella 3: Punteggi funzionali di ratti normali e ratti non trattati. Punteggi funzionali di ratti normali e ratti non trattati 7 e 28 giorni postoperatorio sono stati classificati. n = numero dei ratti.
Complementare figura 1: Gating strategia ed esempio di espressione di superficie dell'indicatore: Detriti è stata esclusa in base al piccolo FSC e SSC (A). Cellule vive sono state selezionate in base alla colorazione negativa con 7-AAD rilevato da FL3 (B). Isotype abbinati di controllo (C) è stato usato come controllo negativo per creare un cancello di cellule positive CD44-FITC (D).
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Discussion
Cellule Equine sono state selezionate per questo progetto, perché alla fine abbiamo intenzione di testare candidato approcci nella gestione delle tendinopatie naturale nei cavalli. Infatti, lesioni del tendine nei cavalli sono attraenti come modelli naturali di tendinopathy nell'uomo a causa della somiglianza biologica tra il flessore digitale superficiale equino e tendine di Achille in esseri umani41. Gli indicatori di superficie delle cellule CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II sono stati selezionati per immunophenotyping delle cellule, in conformità con i criteri raccomandati dalla società internazionale per la terapia cellulare42. In un recente studio, eqUCM-MSCs erano positive per CD44 e negazione per CD34 e MHC II, indipendentemente dalle condizioni di cultura. Le cellule coltivate in condizioni standard erano inoltre positive per CD90 e CD105, quindi soddisfa i criteri per MSCs in termini di espressione di marcatori di superficie. Inoltre, questo studio è il primo rapporto sulla formazione di sferoidi quando eqUCM-MSCs sono coltivate su pellicola di chitosano, confermando precedenti relazioni umane MSCs19,20. Tecniche di coltura cellulare 3D sono state esplorate estesamente per decenni con l'obiettivo di creare un ambiente che assomiglia alla nicchia fisiologica. Infatti, questo studio ha mostrato livelli di espressione genica di staminalità migliorata di Oct4, Sox2e Nanog e una migliore differenziazione potenziale, che è coerente con altri rapporti19,20. Altri segnalato immunomodulatori migliorate proprietà43 e cartilagine ialina rigenerazione44 utilizzando MSCs sferoidi. Tra le varie tecniche di coltura 3D come boccette di spinner, bioreattori cellulari rotante, piastra antiaderente, matrici naturali e sintetiche, chitosano film sembrano attraente per diversi motivi. Questo approccio non richiede attrezzature costose ed è conveniente rispetto alle piastre non aderenti con matrici sintetiche, poiché il chitosano è un sottoprodotto dell'industria del pesce. Coltura delle cellule sulle pellicole di chitosano è tecnicamente facile. Combinati, questi vantaggi consentirebbe applicazione clinica su larga scala45.
Il modello bilaterale del tendine patellar proposto qui appare accettabile in termini di morbosità. Nessuna complicazione è stata osservata in uno studio recente di studio. Eravamo preoccupati soprattutto per il rischio di effetti stressanti indotti da difetti abbastanza grandi da permettere variazioni rilevabili biomeccanici ed istologici. Queste preoccupazioni richiesto la selezione dei ratti sopra topi per questo studio basato su precedenti studi relazionati alle dimensioni e alla maturità del tendine per modelli preclinici lesioni. Un «difetto di finestra» o terzo centrale del tendine patellar è stata descritta in conigli46 e ratti30,31 per studiare tendine che guarisce e l'incremento. Il tendine patellar modello 'finestra difetto' è stato trovato riproducibile per lo studio della riparazione del tendine in ratti con l'istologia31,39, biomeccanica test30,31ed ex vivo fluorescenza 31di imaging. In questo studio, la dimensione del difetto era equivalente al terzo centrale del tendine rotuleo ed è stata standardizzata con un filo di Kirschner 0.99 mm di diametro come un modello. Queste dimensioni erano adeguate per studiare il tendine che guarisce senza causare rottura post-operatoria. A causa della loro più grande formato anatomico contro i topi, ratti possono ospitare più grandi difetti, migliorare la riproducibilità della ferita, consegna di trattamento e misure di risultato.
Il protocollo di analgesia amministrato ai ratti in questo studio era efficace nel controllo del dolore post-operatorio, come valutato con la RGS37,38. Questo sistema di punteggio è stato selezionato qui perché in precedenza è stata convalidata come rilevare i cambiamenti del comportamento post-operatori che riflette il dolore in ratti37,38. La RGS si basa su segni relativamente semplici da identificare, come serraggio orbitale, naso/guancia appiattimento e modifiche di orecchio/whisker. Ratti mantenuti anche un'assunzione di cibo normale in tutto questo studio, che più ulteriormente sostiene l'efficacia di questo protocollo di analgesia. Infatti, i rapporti precedenti hanno trovato una correlazione tra il dolore post-operatorio e variazioni di peso corporeo nei ratti trattati con antinfiammatori non steroidei, come meloxicam47. Questo agente è stato selezionato in questo studio e amministrazione preemptive è stato derivato dagli studi in ratti37,cani e48 49, dove la somministrazione di agenti anti-infiammatori immediatamente prima dell'intervento chirurgico è stata trovata per attenuare il dolore indotto chirurgicamente. Funzione è stata valutata come indicatore supplementare di dolore post-operatorio, utilizzando un sistema di scoring disegnato per valutare l'uso di entrambi gli arti pelvici. Le tre attività selezionate qui forniscono una valutazione generale della gamma di movimento e la volontà di sopportare il peso sugli arti pelvici. Questo sistema di punteggio è stato derivato da entrambi gli studi statici e dinamici di recupero funzionale in ratti50,51 ed è stato progettato per confrontare il corso di tempo degli esiti funzionali osservati. I punteggi indicano che il difetto bilaterale del tendine ha indotto una diminuzione temporanea in funzione a 7 giorni, con un ritorno alla normalità entro 28 giorni. Il Punteggio di funzione appare più sensibile nel rilevare dolore secondario a condizioni ortopediche rispetto alla RGS. Test funzionali simili sono stati utilizzati per valutare il tendine che guarisce come l' indice funzionale Achille28, zampa e falcata misure51, o altri macroscopico sistemi segnando52.
Questo modello è stato progettato per ridurre il numero di animali iscritti allo studio, pur differenziando i risultati tra due trattamenti a base di cellule staminali e tendini non trattati. Gli effetti dei trattamenti testati in questo studio sono discussi in un'altra pubblicazione36. Il modello utilizzato qui ha permesso la rilevazione di differenze di trattamento attraverso l'utilizzo di un controllo interno in ogni ratto, combinato con prove biomeccaniche distruttive dei tendini (dati non presentati qui) dopo 28 giorni.
Attivato e condizionato al plasma è stato selezionato a causa del suo uso comune come un elemento portante per le cellule staminali, biocompatibilità, accessibilità e attuali applicazioni cliniche nella gestione delle tendinopatie53,54. Può avere contribuito alla guarigione dei tendini trattati, ma ha permesso la conservazione locale di cellule staminali, e non interferisce con il confronto dei gruppi di trattamento, poiché entrambi inclusi la stessa quantità di plasma condizionato attivato. Le caratteristiche istologiche dei tendini non trattati sono coerenti con le descrizioni precedenti del tendine che guarisce, dove tessuto necrotico e fasci di collagene interrotti vengono rimossi da enzimi litici e della fagocitosi dai macrofagi durante la fase di infiammazione, che dura fino a 10 giorni dopo la ferita54,55,56. Durante la fase proliferativa, proliferazione cellulare e la vascolarizzazione del sito della riparazione è più grande a 28 giorni dopo57,58di riparazione del tendine. Abbiamo trovato una correlazione fra l'apparente ispessimento dei tendini, sezioni trasversali e basso modulo di elasticità di esemplari. Basato su questi risultati, il punteggio istologico sembra riflettere i cambiamenti del tessuto che non possono essere desiderabile e non portano a forza biomeccanica, quali disorganizzazione delle fibre di collagene, l'angiogenesi e chondrogenesis. In futuro, la capacità di questo modello di discriminare i trattamenti basati sulle caratteristiche istologiche può essere migliorata tramite l'integrazione di ulteriori criteri quali la presenza di tenociti, organizzazione di matrice extracellulare, contenuto di proteoglicani, e distribuzione di elastina fibre52,59.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare Dr. Su, PhD, per la sua analisi statistica dei dati. Gli autori ringraziano anche Dr. McClure, DVM, PhD, DACLAM, per la sua consulenza sull'anestesia e dolore gestione protocolli utilizzati nello studio. Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni da Western University of Health Sciences ufficio del Vice Presidente per la ricerca (12678v) e USDA sezione 1433 fondi (2090).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 10x | Hyclone | SH30258.01 | Consumable |
| Collagenase type IA | Worthington | LS004197 | Consumable |
| DMEM low glucose | Hyclone | SH30021.FS | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | Consumable |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Hyclone | SV30010 | Consumable |
| Trypsin 0.25% | Hyclone | SH30042.01 | Consumable |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | Consumable |
| Trypan blue | Hyclone | SV30084.01 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | Consumable |
| Chitosan | Sigma | C3646 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | Consumable |
| Bovine Serum Albumin | Hyclone | SH30574.01 | Consumable |
| Round bottom polystyrene tube | Corning | 149591A | Consumable |
| Mouse anti-horse CD44 (FITC) | AbD serotec | MCA1082F | Consumable |
| Mouse anti-rat CD90 (FITC) | AbD serotec | MCA47FT | Consumable |
| Mouse anti-horse MHC-II (FITC) | AbD serotec | MCA1085F | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | AbD serotec | MCA928F | Consumable |
| Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | abcam | ab11415 | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | abcam | ab91356 | Consumable |
| Mouse anti-human CD34 (FITC) | BD | BDB560942 | Consumable |
| Mouse IdG1 kappa (FITC) | BD | BDB555748 | Consumable |
| 7-AAD | BD | BDB559925 | Consumable |
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD | Equipment | |
| Vacutainer 5 mL | Med Vet International | RED5.0 | Consumable |
| Acid-citrate-dextrose | Sigma | C3821 | Consumable |
| Calcium Chloride | Sigma | C5670 | Consumable |
| Sevoflurane | JD Medical | 60307-320-25 | Consumable |
| Rats | Charles River | Strain code: 400 | Experimental animal |
| Rat surgical kit | Harvard apparatus | 728942 | Equipment |
| Surgical Blade #15 | MEDLINE | MDS15115 | Consumable |
| Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet) |
Bio Serv | F06801 | Consumable |
| Polyglactin 910, 5-0 | Ethicon | J436G | Consumable |
| Eosin alchol shandon | Thermo scientific | 6766007 | Consumable |
| Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 143907 | Consumable |
References
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