Summary
이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.
Abstract
재생 의학 조건 전통적인 치료에 도전 하는 새로운 대안을 제공 합니다. 정도와 종에 걸쳐 tendinopathy의 사망률이 조직의 한정 된 치료 속성 결합, 세포 치료에 대 한 검색 메시지가 있고 그들의 효능을 연구 실험 모델의 개발을 추진. 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 (MSC UCM)는 매력적인 후보 때문에 풍부 하 고, 수집, 윤리적인 우려 및 기형종 형성의 위험 회피 아직 원시적인 배아 줄기 세포를 더 밀접 하 게 닮은 쉽게 보다 성인 조직 유래 MSCs 상당한 관심은 회전 타원 체 형성을 통해 MSCs의 재산을 강화 하는 전략으로 키토 산에 집중 했다. UCM-MSCs을이 종이 세부 기법 키토 산 필름 spheroids를 준비 하 고 표면 마커 식에 회전 타원 체 형성의 효과 분석. 따라서, 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델의 창조는 UCM MSC spheroids 키토 산 필름 형성의 vivo에서 이식에 대 한 설명 되어 있습니다. 아니 합병증 관찰 되었다 병 적 상태에 관하여 연구에서 스트레스 상승 효과, 또는 조직 감염. 7 일 운영된 쥐의 총 기능 점수 정상 쥐 보다 낮은 했지만 수술 후 28 일 이내 정상으로 돌아왔다. 조직 치유의 조직학 점수 7 일 평가 처리 결함에 응고 이물질 반응, 그리고 28 일에 치료 진행의 부재의 존재를 확인 했다. 이 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 각 쥐에는 내부 통제의 창조를 통해 간 개별 변형 제어, 수용 병 적 상태와 관련 된 되었고 치료 힘 줄과 치료의 차이점의 탐지를 허용.
Introduction
힘 줄 부상 종1에 걸쳐 상당한 통증과 근육 위축 증의 가장 일반적인 원인 중 하나입니다. 수의학, 경주 말에 모든 상해의 82 %musculoskeletal 시스템을 포함 하 고 그의 46%에 영향을 미칠 힘 줄과 인 대2,3말에 특별 한 관심의 힘 줄 및 인 대 부상 있습니다. 흉터 조직 형성과 치료 힘 줄의 biomechanical 속성에 영향을 미치는 flexor의 힘 줄 부상; 후 운동 사용에 반환에 대 한 경비 예 후를 설명 한다 다시 부상 발생에 2 년 이내 최대 말의 67%4신중 하 게 취급 합니다. 재생 의학 도전 전통적인 치료 조건에 새로운 대안을 제공 합니다. 자가 줄기 세포 치료 몇 가지 고무적인 결과5,6 생산 하지만 조직 컬렉션, 지연 처리/프로그래밍으로 인해 셀, 행정과의 영향와 관련 된 병 적 상태에 의해 제한 되는 줄기의 속성 (예: 연령) 환자의 건강 상태7,8세포. 이러한 제한은 상용 해서도 수용자 줄기 세포를 조사 근거를 제공 합니다. 그들은 윤리적 문제 및 기형종의 배아 줄기 세포와 관련 된 위험을 회피 하기 때문에 태아 adnexa 파생 셀 매력적인 후보자 이다. 태아 adnexa 가운데 탯 매트릭스 (UCM)와 튼의 젤리 라는 풍부 하 고 수집 하기 쉬운입니다.
셀 소스에 stemness 강화 allogenic 재생 의학을 위한 세포 은행 확립에 필수적 이다. 기능 관점에서 stemness 자체 갱신 및 다중 계보 분화9에 대 한 가능성으로 정의할 수 있습니다. Stemness의 증거 분석, 유전자 마커 Oct4, Sox2, 및 Nanog9의 식 함께 확산 및 감 별 법에 의존합니다. 한 전략 stemness 향상을 void 필러와 강화 확산 및 UCM MSCs의 차별화로 생체 재료의 사용에 의존 합니다. 이 방법은 유도 만능 세포로 성숙 세포를 재 설 정할 transcriptional 요인의 조작에 관한 우려를 제거 합니다. 생체 줄기 세포에 대 한 잠재적인 운반대로 간주, 중 키토 산 생체 적합성과 분해성10매력적 이다. 이 자연 aminopolysaccharide 카이, 두 번째 가장 풍부한 천연 다 당 류 주로 조개10의 subproduct로 얻은 알칼리 성 deacetylation에 의해 형성 된다. 우리 이전에 MSCs 및 키토 산 건설 기계 사이의 상호 작용을 조사 하 고 spheroids11,12,13,,1415, 의 형성 관찰 16. 우리는 또한 키토 산 행렬12,13,14,15,,1617, chondrogenesis의 우수성에 보고 18. 최근에, 2 개의 독립적인 연구 지방 조직에 의해 spheroids 형성을 설명 하 고 태 반 조직 유래 키토 산 영화19,20에 경작 하는 MSCs. Spheroids의이 형성 뿐만 아니라 stemness, 강화 하지만 또한 생체 내에 이식20후 줄기 세포의 보존을 향상.
정도와 병 종에 걸쳐 tendinopathy의 tendinopathies의 병 태 생리학을 연구 하 고 줄기 세포 주사 등 새로운 치료법을 테스트 실험 모델의 개발 라는 메시지가 있다. 말, 콜라 유도 염증이 생길 수도 힘 줄 수리21에서 MSCs를 사용 하 여 효능을 입증 하는 일반적인 모델입니다. 이 접근의 관련성, 주사는 급성 염증 성 변화를 일으킬, 임상 tendinopathies 만성에서 일반적으로 발생 하는 반면 팽팽하게22,23. 또한, 힘 줄 질환의 화학 유도 치료 응답을 유도 하 고 임상의 경우22,23에 장애인된 치유 과정을 복제 하지 않습니다. 표면 디지털 flexor의 힘 줄의 세그먼트의 절단 말24에 염증이 생길 수도의 외과 모델로 설명 하고있다. 더 최근에, 최소로 침략 접근 표면 디지털 flexor의 힘 줄25의 중앙 코어를 외상 성 손상 제한 하 사용 되었다. 외과 모델 자연 힘 줄 질환으로 이어질 수 있는 손상 만든25의 범위 내에서 재현성 부족 경향이 피로 메커니즘을 시뮬레이션 하지 않습니다. 모델, 병 적 상태 및 힘 줄의 말 모델와 관련 된 비용에 질병 vivo에서 새로운 치료의 평가 대 한 첫 번째 단계로 설치류 모델에 대 한 관심을 정당화 하는 추가 제한이 있습니다.
설치류의 실험 모델의 주요 장점 중 하나 비용과 간 개별 가변성을 제어 하는 기능으로 이루어져 있다. 설치류 그들의 빠른 성장 속도로 인해 다양 한 생리 적인 요인에 관하여 표준화 수 고 상대적으로 짧은 수명을, 변이의 소스를 제한 및 그러므로 차이 감지 하는 데 필요한 동물의 수를 감소. 설치류에 힘 줄 질환을 유도 하는 전략 부분 힘 줄 결함21의 외과 생성 뿐만 아니라 화학 유도에 의존 했습니다. 외과 모델 자연 tendinopathies 화학 모델 보다 더 나은 시뮬레이션 수 있습니다 하지만 더 높은 사망률 및 손상 된 힘 줄의 치명적인 오류가 발생할 수 있습니다. 그 점에서 쥐 조직 치유의 평가 촉진 함으로써 더 큰 결함의 생성을 허용 하는 그들의 크기가이 모델에 대 한 마우스 보다 더 나은 후보를 보인다. 4 주요 힘 줄 그룹에서 tendinopathies의 실험 연구에서 사용 된 Sprague-Dawley 쥐: 회전자, flexor, 아 킬 레 스, 그리고 슬 개 골 심 줄26. 이 중, 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델은이 힘 줄의 더 큰 크기와27에 액세스의 용이성 때문에 특히. 슬 개 골 힘 줄 tibial tuberosity에 quadriceps 근육을 연결합니다. 이 신 근 메커니즘 내에서 슬 개 골은 sesamoid 뼈는 허벅지 근육의 동작을 지시 하 고 슬 개 골 힘 줄의 인접 정도 구분. 슬 개 골 힘 줄의 인접 하 고 말 초 범위에서 뼈 앵커의 존재 biomechanical 테스트를 지원합니다. 일반적으로 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델 contralateral 그대로 힘 줄 컨트롤28,29봉사와 일방적인 외과 결점에 의존 합니다. 가장 일반적인 슬 개 골 힘 줄 결함 모델에서는 contralateral 슬 개 골 힘 줄은 그대로 동안 tibial tuberosity의 삽입에 슬 개 골의 원심 꼭대기에서 슬 개 골 힘 줄의 중앙 부분 (폭에서 1 m m)를 절 개 합니다. 측정 결과의 조직학, 비-파괴적인 biomechanical 테스트 또는 biomechanical 테스트 실패, 초음파 영상, ex vivo 형광 이미징, 총 관찰, 그리고 기능 테스트28,30 포함 ,31. 일방적인 모델 같은 동물 내에서 유사한 상해의 보수 관리와 제안 된 치료의 비교를 허용 하지 않습니다. 마찬가지로, 여러 치료 간의 비교는 별도 동물을 필요합니다. 양자 모델 간 개별 변이 제거 하 고 연구32에 필요한 동물의 수를 줄일 것 이다. 그러나, 양자 상해 사망률을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 양자 lameness 치료 평가 방해 수 있습니다. 몇 가지 연구 짧게 페리 요원 관리 보다는 오히려 치료의 효과 모델33,34의 병 적에 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 쥐 하지만 초점에의 사용을 보고합니다.
이 연구의 장기 목표는 UCM MSCs allogenic 이식에 운명의 stemness 그리고 vivo에서 생존을 개량 하는 전략을 개발 하는 것입니다. 이 목표를 달성 하기 위해 우리 최근 키토 산 영화와 인큐베이션 hypoxic 환경35아래에 spheroids의 형성에 의해 UCM MSCs의 향상 된 stemness을 보고 있다. 이러한 생체 외에서 속성은 관련 된 슬 개 골 힘 줄 결함 조건된 UCM으로 치료의 향상 된 biomechanical 속성-MSCs. 이러한 결과에 기반, 쥐 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 후보 테스트에 적합 한 것 힘 줄 부상36에 대 한 치료입니다. 연구의 목적은 여기 격리 및 특성화 UCM MSCs의 줄기 세포, 창조 및 양측 슬 개 골 힘 줄 결함, 그리고 수술 후의 치료에 대 한 생물 학적 전달 시스템의 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 보고 복구 및 조직 결함 내 치유의 평가 합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 웨스턴 대학 보건 과학에 의해 승인 되었습니다.
1. 격리와 말 탯 매트릭스에서 MSCs의 확장
- 태 반 (임신) 성인 마 레에서 foaling 관찰 후을 aseptically 탯 태에서 분리 합니다. 탯에에서 계속 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 1% 페니실린-스 (P/S)와 4 ° C에서 전송 하는 동안 처리까지.
- 실내 온도 PBS 1%로 두 번 탯 워시 50ml 튜브에 P/S. 150 m m와 1 %P / S 50 mL 튜브 2 또는 세 번까지 혈액의 대부분은 밖으로 씻어 서 실내 온도 PBS에 세척에 2 인치 길이의 조각으로 탯 섹션.
- 잘라 배를 경도 탯. 2 동맥, 정 맥, 그리고 집게와가 위를 사용 하 여 코드에서 allantoic 줄기를 포함 하 여, 혈관을 제거. 메스로 근 근 의해 150 mm 접시에 젤리 같은 매트릭스 주변 혈관은 탯 매트릭스 (왓슨의 젤리)를 수집 하 고 정밀한 조각으로 젤리를 말하다.
- PBS에서 0.1% (w/v) 콜라 유형 IA 솔루션의 15 mL 50 mL 튜브에 2-3 탯 조각 (약 12-15 g)에서 장소와 튼 젤리 해산 때까지 3-4 h 동안 부드러운 흔들어 37 ° C에서 품 어.
- 15 분 동안 300 x g에서 소화 조직 원심 하 고 상쾌한 발음. 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 소화 조직 resuspend P/S, pipetting으로 혼합, 5 분 동안 150 x g에서 원심 및 상쾌한 (세척)을 발음. 세척 두 번 더 반복 합니다.
- Resuspend 셀 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 세차 P/S, pipetting으로 혼합, 100 µ m 셀 스 트레이너, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기와에 의해 변형 및 상쾌한 발음.
- 낮은 포도 당 Dulbecco의 혼합 하 여 배양 (CM) 준비 소 태아 혈 청 (FBS)와 1 %P 수정이 글의 중간 (LG-DMEM) / 미 여과 의해 매체를 소독.
- 37 ° C에 미리 데워 CM의 10 mL에 긴장된 셀 resuspend, pipetting으로 혼합, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 전송 및 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어 변경 c M 매 3 일 마다 문화 문화 passaged 것 이다 때 70-80%의 합류를 도달할 때까지.
- 문화 통로를 플라스 크에서 CM을 발음 하 고 두 번, 실내 온도 PBS의 5 mL로 세척 하 고 0.25 %trypsin / ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 5 분 동안 37 ° C에서의 3 mL와 분리.
- 트립 신/EDTA 37.0 ° C에 미리 데워 CM의 6 mL로 중화 하 고, pipetting으로 혼합 하 고 15 mL 튜브, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 한 상쾌한 발음. Resuspend CM의 1 mL에 분리 된 셀, pipetting으로. Trypan 블루과 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 5, 000 셀/cm2, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 다시 시드해야 하 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어
2. 키토 산 영화에 교양 UCM MSCs와 Spheroids의 준비
- 1% (w/v) 키토 산 용액 100 mL를 준비 하려면 99 ml의 증류수 (dH2O), 키토 산의 1 g을 추가 하 고는 자력으로 잘 혼합 합니다.
- 빙 초 산의 670 µ L을 추가 하 고 혼합 키토 산 녹이 고 점성 된다 때까지 계속. 이 일반적으로 3-4 시간 걸립니다.
- 12 음 조직 배양 플레이트의 각 음에 키토 산 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 접시 키토 산 솔루션을 균등 하 게 배포 하 고 모든 바닥 표면에 소용돌이.
- 층 류 24 h에 대 한 하룻밤 커버 없이 캐비닛에서 키토 산 코팅 솔루션 접시 건조. 건조 되 면, 박막 형성 하 격판덮개를 준수 합니다.
- 각 우물에 0.5 N 수산화 나트륨 (NaOH) 용액 1 mL를 추가 하 여 키토 산 영화를 중화 하 고 실 온에서 2 h에 품 어. 각 우물에서 NaOH를 발음 하 고 각각을 씻어 세 번 dH2O의 1 mL와 함께 잘. 각 세척 한 번 70% 에탄올 (EtOH)의 1 mL와 함께 잘.
- 키토 산 영화를 소독, 층 류 캐비닛에 70 %EtOH 각 잘하고 품 어의 1 mL을 하룻밤 추가 합니다. 다음 날에 각 우물에서 나머지 EtOH를 발음. 각 세척 살 균 PBS의 1 mL 세 번 잘. 키토 산 필름 층 류 커버 없이 하룻밤 캐비닛 아래 자외선으로 소독.
- UCM MSCs의 양식 spheroids, 씨앗 확장 5000 셀/cm2, 각 잘으로 셀 passaged 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어
참고: 셀 수 있는 알을 품을 산소 또는 normoxia, 탐정의 관심에 따라.
3. 표면 마커 Cytometry 통해 분석의 표현
-
단일 세포 현 탁 액의 준비
- 표준 플레이트
- 각 우물에서 매체를 제거 하 고 실내 온도 PBS로 두번 세척.
- 실 온에서 5-10 분에 대 한 12-잘 접시의 각 음에 셀 분리 시 약의 500 µ L로 세포를 분리 합니다.
- 부 화, 후 각 우물에 버퍼 (PBS 0.5 %BSA 포함) 얼룩의 1 ml을 추가 하 고 셀을 분리를 pipetting으로 혼합.
- 세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 합니다.
- 키토 산 판
- 모든 spheroids는 피 펫을 사용 하 여 1000 µ L 팁 발음 매체에 의해 수집 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 수집 된 매체를 전송. 매체를 수집, 후 1 mL PBS의 추가 의해 잘 세척 하 고 동일한 15 mL 원뿔 튜브에 씻어 PBS를 전송 합니다.
- 5 분 동안 150 x g에서 spheroids 원심 고 상쾌한을 제거 합니다.
- 셀 분리 시 약 (예, accutase)의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 5-10 분 동안 품 어. Pipetting을 사용 하 여 1 mL 팁 spheroids 해리는 더 이상 표시 될 때까지 혼합.
- 단일 셀 펜션과 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 얼룩 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
- 표준 플레이트
-
셀을 세척
- 상쾌한 원뿔 튜브에서 제거 하 고 다시 감기 버퍼 얼룩의 3 mL에 셀을 일시 중단. 이 단계에서 실험을 통해 아이스 셀을 계속.
- 5 분 (세척)에 대 한 300 x g에서 원심.
- 두 번 씻는 다.
-
세포를 얼룩이 지기
- 5 분 x 300g에 centrifuge 고 상쾌한을 제거 합니다.
- Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 다시 일시 중단 1 x 106 셀 50 µ L 차단 (PBS 포함 10% 말 혈 청)를 버퍼링 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어.
- 얼음에 1 시간에 대 한 빛에서 보호 품 어 다음 10 µ L fluorescein isothiocyanate (FITC) 활용 된 항 체 (CD44, CD90, CD105, CD34, 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 II, 또는 각 항 체 isotype 제어) 및 버퍼, 얼룩의 40 µ L를 추가 합니다.
- 감기 버퍼 얼룩의 3 개 mL를 추가 하 고 혼합, 5 분, 300 x g에서 원심 상쾌한 (세척)을 발음.
- 두 번 세척을 반복 합니다.
- 다시 버퍼를 얼룩이 지기의 0.5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단
- 7-AAD (생존 염료)의 5 µ L을 추가 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어
- 교류 cytometer에 의해 스테인드 세포 샘플을 분석 합니다. 그들의 작은 SSC와 FSC, 파편을 제외 하 고 7-AAD의 낮은 통풍 관으로 가능한 셀을 식별 합니다. 플롯 FL1 및 FL2에는 y와 x-축, 각각. Isotype 제어를 사용 하 여 대각선 위에 게이트를 만들. 지역에 있는 긍정적으로 얼룩진된 세포의 백분율을 측정 합니다. 적어도 20000 이벤트/샘플 (보충 그림 1)을 계산 합니다.
- 실행 가능한 셀 및 자동-형광, 게이팅 하 여 항 체로 얼룩진 셀의 비율 측정 하 고 세포 isotype 제어와 스테인드의 백분율을 뺍니다.
4. 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 쥐에서
- Sprague Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)을 선택 합니다. 이 모델에 사용 하는 쥐의 비교적 큰 크기 note
- Anesthetize 고 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 쥐 핀치 발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 인공 눈 윤활제를 적용 합니다.
- 선제 무 통으로 Meloxicam (1 mg/kg)의 근육 주사를 관리 합니다.
- 따뜻한 물으로 채워지고 피부 부상을 방지 하면서 체온과 위치를 유지 하기 위해 천으로 덮여 두 0.5 L 물 병 사이 쥐를 놓습니다. 테이블에 각 말단을 테이프. 저체온증의 위험을 줄이기 위해 버블 랩 (그림 1)와 함께 시체를 커버.
- 마 취 5 %sevoflurane 원뿔, 물 난방 패드에 지 recumbency에 동물을 통해 1 L 100% 산소 혼합물에의 지속적인 흐름을 유지 합니다.
- 피부 외상을 방지 하려면 수술 사이트를 클립 하지 않습니다. 대신, 두 stifles 이상 머리 제거 크림을 적용 합니다. 혀 억압 물을 사용 하 여 크림 및 머리 제거.
- 수술 부위의 액체 digluconate 스크럽, 스크럽 하 고 3 번 70% 에탄올으로 씻어.
- 피부는 억압의 craniomedial 측면에 인접 하 원심 방향에서 살 균 #15 메스 블레이드와 incise. 약 1 cm 수준, 슬 개 골의 근 위 절 개를 시작 하 고 약 5 mm tibial 결 절에 원심 확장.
- #15 메스 블레이드와 기본 피하 조직을 확보 하 여 슬 개 골 힘 줄 노출에 피부를 반영 합니다.
-
#15 메스 블레이드를 사용 하 여 소비 세 각 슬 개 골 힘 줄 (1 m m)의 중앙 세 번째 슬 개 골의 원심 부분에서 tibial tuberosity에.
- 각 사지 (그림 2)에서 결함의 크기를 표준화 하는 템플릿으로 힘 줄에 대해 0.99 m m 직경 Kirschner 와이어를 맞춥니다.
- 힘 줄 (그림 3)의 중앙 부분을 #15 메스 블레이드와 Kirschner 와이어의 각 측에 2 전체 두께 절 개를 확인 합니다. 정밀한 아이리스가 위 (그림 4)와 함께 중앙 섹션 proximally 고 distally resect.
- 억압의 근 막을 닫기 전에 5.5에 설명 된 대로 적절 한 치료 그룹에 대 한 응고 (혼합된 셀 펜션과 ACP)를 삽입 합니다. 십자 패턴으로 근 막과 피부 패턴 5-0 polyglactin 910 봉합 (그림 5)를 사용 하 여 피부를 닫습니다.
- Contralateral 억압에서 절차를 반복 합니다.
참고: 하나의 결함 치료 (줄기 세포 chitosan에 조건 또는 표준 접시에 배양) 무작위로 할당 됩니다. Contralateral 결함은 내부 통제 역할을 빈 남아 있습니다. - 수술 후 관리 enrofloxacin의 4 정제 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) meloxicam의 태블릿 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) 7 일 동안. 이 복용량 실험 동물 수 의사에 의해 권장 되었고 IACUC 프로토콜에 승인.
5. 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 MSCs의 배달
- 핀치-발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 슬 개 골 힘 줄 결함 생성에 사용 되지 않는 건강 한 쥐 anesthetize
- 수집 5 mL 혈액 심장 펑크에 의해 마 취 Sprague-Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)에서 5 mL 주사기에 산 시트르산 포도 당 (5:1 v/v)의 1 mL를 포함 하는 20 G 바늘.
- Pentobarbital (100 mg/kg), 같은 마 취에서의 intracardial 주입 하 여 심장 펑크와 혈액 수집 후 쥐를 안락사.
- 실 온에서 15 분 동안 350 x g에서 샘플 원심 상쾌한 전송 및 사용까지 aliquots (120 µ L 각)-20 ° C에서 저장.
- 생체 내에 이식 직전 위의 약 수를 녹여 섞어 0.5 x 10와 20 µ L 트립 신/EDTA를 사용 하 여 표준 격판덮개에서 분리 (1.9 또는 3.1.2.1)에서6 MSCs 또는 (PBS/매체)와 홍 조에 의해 키토 산 판에서 수집.
- 해 동된 플라즈마는 플라즈마를 활성화 하 고 혈전의 형성을 유발 하 96 잘 접시의 우물에서의 나머지 100 µ L를 6 µ L 10% 칼슘 염화 물 (CaCl2)의 추가 (바른된 플라즈마 활성화: ACP).
- 세포 현 탁 액 (20 µ L) 혼합 및 ACP (100 µ L) 형태로 응고 (그림 6). 장소는 억압의 근 막 닫기 전에 만든 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 응고 (단계 4.10.3 참조).
6. 기능적 결과
- 통증, 쥐 얼굴을 찡 그리기 규모 (RGS)37,38 에 기반 하 고 이식 사이트 위에 붓기의 표시를 위해 하루에 두 번 쥐를 모니터링 합니다.
참고: 채 점 시스템 (0-6) 보 행 기능 지원 앞 발 타임된 뒷 다리 서 포함 하 여 3 활동에 따라 (0-3)를 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 그리고 남의 뒷 다리 서 (0-2), 그리고 17 cm 플라스틱 케이지 벽 (0-1) (등반 능력을 초과 표 1)입니다. - 아침에 각 시간 점의 평균 점수를 계산 하기 위해 저녁에 2 개의 뒷 다리 서 활동에 대 한 쥐를 평가.
- 성공적으로 도달 상단 두 뒷 다리 사지와 17 cm 플라스틱 케이지 벽을 등반 하는 기능에 대 한 쥐를 평가 합니다.
7. 총 모양 및 슬 개 골 힘 줄의 Histopathology
- 7 일 (염증 평가)에 쥐를 안락사 또는 (평가 조직 치유)을 28 일 pentobarbital 8 %sevoflurane 2 L 100% 산소 마스크를 통해 전달 마 취 (100 mg/kg)의 intracardial 주입 하 여 치료를 게시.
- 안락사 후 슬 개 골-힘 줄-경골 tuberosity 단위 메스와가 위를 걷. 부드러운 조직 및 슬 개 골 힘 줄 제외한 억압, 주위 인 대를 제거 합니다.
- 총 모양 및 힘 줄 (그림 7)의 농축에 대 한 각 견본을 검사 합니다.
- 힘 줄의 인접 하 고 측면 측면에 5.0 Polydioxanone의 외과 의사 매듭을 배치 하 여 표본 동양. 각 표본 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 용액에 고정 하 고 각 힘 줄의 중간 부분에서 가로 섹션 (5 µ m).
- 되며 고 오신, Masson의 Trichrome 표준 프로토콜에 따라 얼룩을 사용 하 여 섹션을 얼룩.
- 염증 등 병 적인 변화 뿐 아니라 결함, 내 혈의 존재를 감지 하는 섹션을 검사 합니다.
- 콜라겐 학년, 신생, 및 연골 형성 (표 2)39의 정도에 따라 이전 게시 된 채 점 시스템을 사용 하 여 섹션의 조직학 점수를 평가 합니다.
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Representative Results
현재 연구에서 결과 ± SD (표준 편차)를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 셀 6 mares의 탯에서 고립 되었다 및 표준 또는 키토 산 컨디셔닝에서 각 세포 표면 마커를 표현 하는 격리 된 셀 라인의 비율 비교 했다 프리드먼 테스트와 함께 비패라메트릭 분산 분석으로 반복 측정 한다입니다. 힘 줄 결함 모델 생성 8 쥐 7 일 수술 후 평가 위해 사용 되었다 및 12 쥐 28 일 평가 위해 사용 되었다. 기능 결과의 결과 ± SEM (뜻의 표준 오류)을 의미 하는 대로 표시 됩니다 하 고 t-검정을 사용 하 여 비교. UCM은 셀룰러 소스 그것의 풍부, 수집, 및 다른 태아 adnexa 소스40기준으로 우수한 확산의 용이성으로 인해로 선정 됐다. UCM 표준 접시에 배양에서 분리 된 세포 확장에 걸쳐 구와 같은 모양을 유지. 셀 키토 산 판 (그림 8)에 경작 하는 때 spheroids를 형성 했다.
표준 조건 하에서 경작 하는 세포의 대부분 표현 CD44 (98.6 ± 1.62%), CD90 (88.7 ± 3.04%), 그리고 CD105 (77.9 ± 6.84%), 표현 CD34의 동안 (0.07 ± 0.17%)와 MHC II (1.33 ± 1.12%)은 매우 낮은. 바른된 문화, CD44 식 수준 아래 (97.0 ± 2.12%)와 CD34 (1.13 ± 1.58%) 식 수준의 CD90 동안 표준 문화에서 차이가 없 (33.3 ± 37.1%)와 CD105 (54.0 ± 19.0%) 감소와 MHC II (2.84 ± 0.98%) 증가35.
절연 및 UCM MSCs에서 생체 외에서의 특성을 다음 조건된 셀의 생물 학적 행동 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델에 표준 조건 하에서 경작 하는 세포의 비교 되었다. 치료 되지 않는 결함 각 쥐에 내부 통제로 봉사 했다. 붓기는 수술 후 모든 쥐에 최소한의 고 48 시간 이내에 해결. RGS에 따르면 쥐의 통증이 나 조 난 신호를 표시 하는 같은 궤도 강화, 코/뺨 병합, 또는 귀/수염 변경. 모든 쥐에 사용 3-4 알 약의 정상적인 범위 또는 사료 연구를 통해 매일 15-20 그램. 총 기능 점수 지원 포함 하 고 남의 뒷 다리 뿐만 아니라 점수를 등반으로 서 정상적인 쥐 7 일 운영된 쥐에 비해 높았다 (n = 8, p < 0.0001, 표 3). 그러나, 총 기능 점수 수술 후 28 일 이내 정상에 반환 (n = 12, p = 0.78). 따라서, 쥐 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 간 개별 변화를 제한 하 고 중요 한 병 적 상태 (비디오 1-5)을 유발 하지 않고 동물의 필요한 수를 감소에 대 한 효과적인 것으로 표시 되었습니다.
28 일 수집 된 힘 줄의 약 37% 현저 하 게 두꺼워 (그림 7) 등장. 이 두껍게 빈 및 처리 결함 사이 동등 하 게 배포 했다. 총 조직학 점수 치료 결함에 시간 증가 (n = 20, p 0.0034 =). 연골 형성, 7, 28 일 사이 증가 이루어져 있었다 때 치유 점수의 각 구성 요소는 평가 하지 독립적으로 시간 변경 하는 유일한 매개 변수 (n = 20, p < 0.0001). 신생 시간과 함께 증가 하는 경향이 (p = 0.3), 콜라겐 형성을 다 하지 않았다 (p = 0.69). 조직학 검사, 염증 치료의 존재에 수술 후 7 일에 시험 하는 힘 줄의 조직 단면도의 모든 관찰 되었다. 혈 종 모든 취급된 결함에 존재 했다입니다. 조직학 신생 점수 1, 0에서 배열 했다 (표 2, 그림 9) 적당 한 되 고 모 세관 침투, 콜라겐 등급 점수 (표 2, 그림 10) 동안 3 전체, 2에서 배열 했다 제안 제안 광범위 한 중간 콜라겐 형성입니다. 연골 형성 점수 (표 2, 그림 11) 연골 형성의 25% ~ 50% 힘 줄 섹션 영역의 중간에 전혀 연골 형성을 제안 하는 2 0에서 배열 했다. 모든 조직학 수치는 힘 줄의 중간 부분의 가로 섹션의 중간 양상으로 위쪽과 앞쪽 측면으로 왼쪽으로 향하게.
그림 1: 쥐와 무 균 수술에 대 한 준비의 위치. 각 쥐 0.5 L 물병 두 따뜻한 물으로 채워지고 피부 부상을 방지 하면서 체온과 위치를 유지 하기 위해 천으로 덮여 사이 배치 했다. 테이블에 각 쥐의 사지 녹화 했다 고 본문은 버블 랩으로 덮여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 슬 개 골 힘 줄 (맞춤)의 외과 모델. 0.99 m m 직경 Kirschner 와이어는 각 사지에서 결함의 크기를 표준화 하는 템플릿으로 힘 줄에 대 한 정렬 됩니다.
그림 3: 슬 개 골 힘 줄의 (절 개) 수술 모델. 2 전체 두께 절 개 힘 줄의 중앙 부분을 Kirschner 와이어의 양쪽에 만들어집니다.
그림 4: 슬 개 골 힘 줄의 (절제술) 수술 모델. 중앙 섹션 proximally 고 distally, Kirschner 와이어의 크기를 일치 하는 결함을 만드는 절제입니다. 절제 지역 점선 상자 안에 표시 됩니다.
그림 5: 운영된 stifles의 수술 모습. 근은 십자 패턴으로 닫히고 피부 피부 패턴으로 폐쇄 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: UCM MSCs의 배달에 대 한 활성화 조절된 플라즈마의 준비. 줄기 세포 조절된 플라즈마 활성화 이전에 중단 되었다. 그 결과 응고 슬 개 골 힘 줄 결함에 삽입 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 총 정상 (C, D)의 모양 및 (A, B) 두꺼워 힘 줄. (A, C) 후부 보기; (B, D) 측면 보기; 블록 화살표는 경골을 식별 하 고 얇은 화살표 힘 줄을 식별 합니다.
그림 8: 조직 문화에 배양 세포의 형태학 접시 19% 미만 산소 수준 (표준 그룹: A) 키토 산 영화 미만 5%와 산소 수준 (조건된 그룹: B). 스핀 들 표준 그룹 (A)에 형성 했다 세포 분리 및 형성 조건된 그룹 (B)에 spheroids. 눈금 막대 400 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 대표 현미경 신생 등급에 대 한 사용 빛. 치유의 7 일, 다음 치료와 힘 줄 조절된 세포 (C, F) 또는 표준 세포 (B, E) 각각 0.5와 0의 등급을 받은 반면 0 (A, D)의 급료를 받았다. 28 일, 치료 힘 줄 (G, J)와 그 조절 세포 (난,L) 또는 (H,K) 표준 셀 각각 1.0과 0.5의 점수를 받은 반면 0 등급을 받았다. 화살표는 혈관 힘 줄 샘플에 존재를 식별합니다. 100 배 확대 혈관을 가리키는 화살표가 400 배 확대에 혈관을 가리키는 같은 화살표에 해당 합니다. (M, N)에 티슈를 정상 힘 줄 Masson의 trichrome 얼룩 (A, B, C, G, H, I, M); 되며 고 오신 얼룩 (D, E, F, J, K, L, N); 눈금 막대 = 100 µ m (A N). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: 대표 콜라겐 등급에 사용 하는 현미경 빛. 치유의 7 일, 다음 치료와 힘 줄 (B, C, E, F) 치료와 함께 그 3.0의 등급을 받은 반면 2.5 (A, D)의 급료를 받았다. 28 일, 치료 힘 줄 (G, J) 반면 그 조건 (I, L) 세포 또는 1.0 및 3.0의 표준 셀 (H, K) 받은 점수 각각 3.0 등급을 받았다. 힘 줄 섬유의 해체는 400 X 인세트 (H, K)에서 감상할 수 있습니다. 정상 힘 줄 조직 (M, N) Masson의 trichrome 얼룩 (A, B, C, G, H, I, M); 되며 고 오신 얼룩 (D, E, F, J, K, L, N); 눈금 막대 = 100 µ m (A N). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11: 대표 현미경 연골 등급에 대 한 사용 빛. 치유의 7 일, 다음 치료 (A, D), 그와 함께 힘 줄 조절 세포 (C, F) 또는 표준 세포 (B, E), 모든 0의 등급을 받았다. 반면 그 조건 (I, L) 세포 또는 0과 2.0의 표준 셀 (H, K) 받은 점수 각각 28 일, 치료 힘 줄 (G, J) 1.0, 등급을 받았다. 화살표는 chondrocytes 힘 줄 샘플에에 향하고 있습니다. 100 배 확대에 chondrocytes을 가리키는 화살표가 가리키는 400 배 확대에 chondrocytes 같은 화살표에 해당 합니다. 정상 힘 줄 조직 (M, N) Masson의 trichrome 얼룩 (A, B, C, G, H, I, M); 되며 고 오신 얼룩 (D, E, F, J, K, L, N); 눈금 막대 = 100 µ m (A N). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: 쥐에 외래 함수 계산. 남의 뒷 다리 서 타임 (1-5 s: 점수 1) post-operatively 4 h를 관찰 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 2: 쥐에 있는 보 행 기능 평가. 도움의 앞 발과 뒷 다리 서 시간 (0-5 s: 점수 0) 4 h operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 3: 쥐에 외래 함수 계산. 남의 뒷 다리 서 타임 (1-5 s: 1 점수), 지원의 앞 발과 뒷 다리 서 타임 (5-10 s: 1 점수) 14 일 operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 4: 쥐에 있는 보 행 기능 평가. 지원의 앞 발과 뒷 다리 서 타임 (10-15 s: 2 점수), 17 cm 플라스틱 케이지 벽 등반 능력 없이 (아무 등반: 점수 0) 27 일 operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 5: 쥐에 있는 보 행 기능 평가. 도움의 앞 발과 뒷 다리 서 타임 (5-10 s: 1 점수), 17 cm 플라스틱 케이지 벽을 등반 하는 기능 (예: 1 점수) 14 일 operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
| 기능 테스트 | 0 | 1 | 2 | 3 | 점수 |
| 뒷 다리 서 보조 | 0-5 s | > 5-10 s | > 10-15 s | > 15 s | |
| 남의 뒷 다리 스탠드 | 0-1 s | > 1-5 s | > 5 s | ||
| 상승 능력 | 아니요 | 예 | |||
| 총 |
표 1: 쥐에 있는 보 행 기능을 평가 하는 시스템 점수. 채 점 시스템 (0-6) 외래 함수 초과 뒷 다리 서 앞 발 지원 등 3 활동에 따라 (0-3)를 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 그리고 남의 뒷 다리 서 (0-2), 그리고 17 cm 플라스틱 케이지 벽 (0-1) 등반 능력을 초과 합니다.
| 콜라겐 학년 | |||||
| 0 | 일반 콜라겐 tangentially 지향 | ||||
| 1 | 콜라겐 섬유 조직을 파괴 하는 25% 보다 적은 가벼운 변화 | ||||
| 2 | 25%와 50% 사이 콜라겐 섬유와 온건한 변화 무질서 | ||||
| 3 | 콜라겐 조직을 파괴 하는 50% 이상 표시 변경 | ||||
| 신생의 정도 | |||||
| 0 | 보통 침투 arterioles와 조직의 | ||||
| 1 | 모세 혈관의 존재 | ||||
| 2 | 아니 맥 관 구조 침투 | ||||
| 연골 형성 | |||||
| 0 | 전혀 연골 형성 | ||||
| 1 | 절연된 유리 모양의 연골 혹 | ||||
| 2 | 보통 연골 형성 25% ~ 50%의 | ||||
| 3 | 광범위 한 연골 형성, 관련된 분야의 50% 이상 | ||||
표 2: 등급을 득점 하는 조직학. 섹션의 조직학 점수 콜라겐 학년, 신생, 및 연골 형성 (로젠바움 외. 에서 적응의 정도에 따라 등급이 매겨 했다 39)
| 그룹 | ± Sem의 의미 |
| 일반 (n = 3) | 6.00 ± 0.48 |
| 수술 후 7 일 (n = 8) | 2.25 ± 0.30 |
| 수술 후 28 일 (n = 12) | 5.83 ± 0.24 |
표 3: 정상 쥐와 치료 쥐의 기능 점수. 정상적인 쥐와 치료 쥐 7과 28 일의 기능 점수 postoperatively 등급 했다. n = 쥐의 수.
보충 그림 1: 게이팅 전략 및 표면 마커 식의 예: 파편은 작은 FSC 그리고 SSC (A)에 따라 제외 했다. 라이브 셀 7-AAD FL3에 의해 감지 된 부정적인 얼룩이 지기에 따라 선정 됐다 (B). Isotype 일치 제어 (C)는 부정적인 컨트롤로 CD44 FITC 긍정적인 세포 (D)의 게이트를 만드는 데 사용 된.
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Discussion
우리 결국 말에 자연 tendinopathies의 관리에서 후보 접근을 테스트 하는 것 때문에 말 셀이이 프로젝트에 대 한 선정 됐다. 실제로, 말에 힘 줄 부상 있습니다 말 표면 디지털 flexor 및 인간41킬 사이 생물 학적 유사성 때문에 자연 모델 남자에서 tendinopathy의 매력. 세포 표면 마커 CD44, CD90, CD105, CD34와 MHC II immunophenotyping 세포 치료42에 대 한 국제 학회에서 권장 하는 기준에 따라 셀의 선택 했다. 최근 연구에서 eqUCM-MSCs CD44에 대 한 긍정적이 고 부정적인 CD34와 MHC II, 문화 조건에 있었다. 표준 조건 하에서 경작 하는 세포 또한 CD90, CD105, 그로 인하여 표면 마커 표현의 측면에서 MSCs에 대 한 기준을 충족에 대 한 긍정적인 했다. 또한,이 연구 eqUCM-MSCs 키토 산 영화, 인간의 MSCs19,20이전 보고서 확인에 교양 때 spheroids의 형성에 첫 번째 보고서입니다. 3D 세포 배양 기술 있다 생리 적 틈새를 닮은 환경을 만드는 것을 목표로 하는 수십 년 동안 광범위 하 게 탐험 되었습니다. 실제로,이 학문은 보여주었다 Oct4, Sox2및 Nanog, 및 향상 된 차별화의 향상 된 stemness 유전자 식 수준 잠재적인, 어떤 다른 보고서19,20와 일치 하는. 다른 향상 된 immunomodulatory 속성43 및 유리 모양의 연골 재생44 MSCs spheroids를 사용 하 여 보고. 기법으로 다양 한 3D 문화 스피너 플라스 크, 회전 셀 bioreactors, 비 부착 판, 천연 및 합성 행렬, 키토 산 영화 여러 가지 이유로 매력적 보인다. 이 방법은 고가의 장비를 필요로 하지 않습니다 하 고는 비용에 비해 비 부착 판 합성 매트릭스, 키토 산 이기 때문에 해산물 업계의 부산물. 키토 산 영화에 세포를 배양 하는 것은 기술적으로 쉽다입니다. 결합, 이러한 장점을 대규모45에 임상 응용 프로그램을 허용할 것입니다.
양측 슬 개 골 힘 줄 모델 제안 여기 병 적 측면에서 허용 나타납니다. 아니 합병증 연구의 최근 연구에서 관찰 되었다. 우리는 결함 감지 biomechanical 및 조직학 변화 허용 하도록 충분히 큰에 의해 유도 된 스트레스 효과의 위험에 특히 염려 했다. 이러한 우려는 크기와 힘 줄의 전 임상 부상 모델에 대 한 성숙에 관련 된 연구에 따라이 연구에 대 한 쥐에 쥐의 선택 메시지가 나타납니다. '창 결함' 또는 중앙 3 슬 개 골 힘 줄 결함 힘 줄 치유와 확대를 공부 토끼46 와 쥐30,31 에서 설명 하고있다. 슬 개 골 힘 줄 '창 결함' 모델 조직학31,39, biomechanical30,31, ex vivo 형광 테스트와 쥐에 있는 힘 줄 수리 공부에 대 한 재현 발견 되었습니다. 31을이미지입니다. 이 연구에서 결함의 크기, 슬 개 골 힘 줄의 중앙 세 번째에 해당 되었고 템플릿으로 0.99 m m 직경 Kirschner 철사로 표준화 되었다. 이러한 차원 힘 줄 수술 파열을 유발 하지 않고 치유 공부에 적절 한 했다. 크기 때문에 그들의 더 큰 해부학 마우스 대, 쥐 큰 결함, 상해, 치료 납품, 및 측정 결과의 재현성 향상을 수용할 수 있습니다.
이 연구에서는 쥐에 게 투여 하는 진통 프로토콜 RGS37,38와 평가, 수술 후 통증 조절에 효과적 이었습니다. 그것은 이전 유효성 검사를 반영 하는 쥐37,38에 통증 수술 행동 변화를 감지 하기 때문에이 점수 시스템 여기 선정 되었다. RGS 궤도 강화, 코/뺨 병합, 귀/수염 변경 등 식별 하기 위해 비교적 간단한 표시를 기반으로 합니다. 쥐도 더 지원이 진통의 효능이이 연구를 통해 정상적인 음식 섭취 량을 유지. 실제로, 이전 보고서 쥐 meloxicam47같은 비 스테로이드 소염제로 치료에 수술 후 통증과 몸 무게 변화 사이의 상관 관계를 발견 했다. 이 에이전트는이 연구에서 선정 되었다과 선제 관리 쥐37,48 와 개49, 수술 직전 항 염증 성 에이전트의 관리를 발견 되었습니다 연구에서 파생 된 약하게 수술 통증 유발. 함수는 두 골반 사지의 사용을 평가 하도록 설계 채 점 시스템을 사용 하 여 수술 후 통증의 추가 지표로 서 평가 했다. 여기에서 선택 하는 세 가지 활동의 움직임과 골반 팔 다리에 체중을의 지의 범위는 일반적인 평가 제공 합니다. 이 채 점 시스템 쥐50,51 에서 모두 정적 및 동적 기능 복구 연구에서 파생 되었다 하 고 관찰 하는 기능 결과의 시간 과정을 비교 하도록 설계 되었습니다. 점수 표시 양자 힘 줄 결함 7 일, 28 일 이내 정상으로 복귀와 함께 함수에 임시 감소 유도. 기능 점수 통증 보다는 RGS 정형 조건에 보조 탐지에 더 민감한 나타납니다. 비슷한 기능 테스트 평가 하 아 킬 레 스 기능 인덱스28같은 힘 줄 치유, 발 고 보 폭 측정51또는 다른 거시적인 득점 시스템52사용 되었습니다.
이 모델은 연구 결과 치료 힘 줄과 두 줄기 세포 기반 치료 사이 분화 하는 동안에 동물의 수를 줄이기 위해 설계 되었습니다. 이 연구에서 테스트 하는 치료의 효과 다른 게시36에 설명 되어 있습니다. 여기에 사용 되는 모델 biomechanical 비파괴 힘 줄의 28 일 (하지 여기에 제시 된 데이터)와 함께 각 쥐에는 내부 컨트롤의 사용을 통해 치료 차이의 탐지를 허용.
활성화 된 조절된 플라즈마 줄기 세포, 생체 적합성, 접근성, 그리고 tendinopathies,5354의 관리에 현재 임상 응용 프로그램에 대 한 캐리어로 일반적인 사용 때문에 선정 되었다. 그것은 치료 힘 줄의 치유에 기여 하지만, 줄기 세포의 지역 보존을 허용 수 있습니다 그리고 그것은 방해 하지 않는 치료 그룹의 비교 때문에 둘 다 활성화 조건된 플라즈마의 동일한 금액을 포함. 치료 힘 줄의 조직학 특징 어디 괴 사 성 조직 및 방해 콜라겐 번들 제거 됩니다 먹어서 용균성 효소에 의해 세포에 의해 염증 단계, 힘 줄 치유의 이전 묘사와 일치 하는 최대 지속 10 일 부상54,,5556게시물. 증식 단계 세포 확산 및 복구 사이트의 vascularity 가장입니다 28 일 후에 힘 복구57,58에서. 우리는 힘 줄, 횡단면 지역 및 표본의 낮은 탄성 계수의 명백한 두껍게 사이의 상관 관계를 발견. 이러한 결과 바탕으로, 조직학 점수 바람직하지 않을 수 있습니다 biomechanical 강도, 콜라겐 섬유, 신생, 및 chondrogenesis의 해체 등으로 이어질 하지 않습니다 조직 변경 반영 하는 것으로 보인다. 조직학 특징에 따라 치료 차별이 모델 수 tenocytes, 세포 외 매트릭스 조직, proteoglycan 내용의 존재 같은 추가 기준을 통합 하 여 개선 하는 수 있습니다 미래에, 그리고 엘라 스 틴 섬유52,59의 분포.
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Disclosures
저자는 공개 충돌의 관심 있다.
Acknowledgments
저자는 데이터의 그녀의 통계 분석에 대 한 수, 박사, 인정 하 고 싶습니다. 저자는 또한에 대 한 그녀의 조언을 마 취 박사 McClure, DVM, 박사 DACLAM, 감사 하 고 통증 관리 프로토콜 연구에 사용. 이 프로젝트는 연구 (12678v)와 USDA 섹션 1433 자금 (2090) 부사장의 웨스턴 대학 보건 과학 사무실에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 10x | Hyclone | SH30258.01 | Consumable |
| Collagenase type IA | Worthington | LS004197 | Consumable |
| DMEM low glucose | Hyclone | SH30021.FS | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | Consumable |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Hyclone | SV30010 | Consumable |
| Trypsin 0.25% | Hyclone | SH30042.01 | Consumable |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | Consumable |
| Trypan blue | Hyclone | SV30084.01 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | Consumable |
| Chitosan | Sigma | C3646 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | Consumable |
| Bovine Serum Albumin | Hyclone | SH30574.01 | Consumable |
| Round bottom polystyrene tube | Corning | 149591A | Consumable |
| Mouse anti-horse CD44 (FITC) | AbD serotec | MCA1082F | Consumable |
| Mouse anti-rat CD90 (FITC) | AbD serotec | MCA47FT | Consumable |
| Mouse anti-horse MHC-II (FITC) | AbD serotec | MCA1085F | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | AbD serotec | MCA928F | Consumable |
| Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | abcam | ab11415 | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | abcam | ab91356 | Consumable |
| Mouse anti-human CD34 (FITC) | BD | BDB560942 | Consumable |
| Mouse IdG1 kappa (FITC) | BD | BDB555748 | Consumable |
| 7-AAD | BD | BDB559925 | Consumable |
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD | Equipment | |
| Vacutainer 5 mL | Med Vet International | RED5.0 | Consumable |
| Acid-citrate-dextrose | Sigma | C3821 | Consumable |
| Calcium Chloride | Sigma | C5670 | Consumable |
| Sevoflurane | JD Medical | 60307-320-25 | Consumable |
| Rats | Charles River | Strain code: 400 | Experimental animal |
| Rat surgical kit | Harvard apparatus | 728942 | Equipment |
| Surgical Blade #15 | MEDLINE | MDS15115 | Consumable |
| Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet) |
Bio Serv | F06801 | Consumable |
| Polyglactin 910, 5-0 | Ethicon | J436G | Consumable |
| Eosin alchol shandon | Thermo scientific | 6766007 | Consumable |
| Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 143907 | Consumable |
References
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