Summary
この議定書は、精子のコンピューター支援型分析を使用して、デバイスを冷却魚精子評価の手順を説明します。ソフトウェアは、迅速、正確なと養殖業の再生の成功を改善するために便利なツールをすることができます、精子運動に基づく魚の精子の質の定量分析を与えます。
Abstract
配偶子品質評価のため養殖のための有用なデータを提供できる革新的な迅速かつ定量的な手法があります。精子分析のためのコンピューター化されたシステムは、いくつかのパラメーターを測定するため開発された測定する最も一般的の 1 つ、精子の運動です。
当初は、魚の精子分析のため使用することもできますが、このコンピューター技術は哺乳類種のため設計されました。魚は、精子評価など短い運動時間活性化した後と、場合によっては、温度を下げるための適応に影響を与えることができる特定の機能を持っています。したがって、運動解析を魚の精子分析のためより効率的にソフトウェアとハードウェアのコンポーネントを変更する必要は。哺乳動物の精子、精子の最適温度を維持するために加熱プレートを使用します。しかし、いくつかの魚種のため、以来、精子は 2 分以内にアクティブなまま、運動の持続時間を延ばすために低温を使用する便利です。したがって、冷却装置が分析、光学顕微鏡などの時間の経過とともに一定の温度でサンプルを冷蔵する必要です。このプロトコルでは、魚の精子の運動性の精子分析のためのソフトウェアを使用して、新しい結果を最適化するデバイスを冷却の分析について説明します。
Introduction
再現性は、両方の配偶子 (卵と精子)1,2の品質に依存します。これは、正常な受精の可能な子孫3,4の開発が可能に貢献する主要な要因です。配偶子の便利な評価は、標本の不妊の可能性を定義するための最良のツールです。
多くの水生商業種4の生産に一般的な方法は、複数の男性から精子を混合します。ただし、男性の精子変動が精子競争につながることができますそして、したがって、すべての男性は、同じように遺伝子プール5に貢献しています。この意味で、運動などの個々 の射精/精子機能の適切な評価は潜在的な個々 の男性不妊に関する差別的な情報を取得に不可欠です。それは時間と一貫性の欠如、結果6、7の非互換性につながる経験を必要と、精子の運動の直接観察は不正確で、主観的なデータを生成できます。ただし、信頼性の高い精子の品質分析2,4を提供することができます多くの革新的な迅速かつ定量的手法があります。
精子のコンピューター支援型分析は、精子品質8に関する正確なデータを提供する開発されました。この技術には、精子の運動性の評価をできる位相差顕微鏡に関連するソフトウェアの開発が含まれています。しかし、運動パラメーターの制限要因はビデオ カメラのフレーム レートです。軌道が精子に基づいている個々 の精子頭部重心位置の連続したフレームでビデオ録画の鞭毛運動パターン3,9,10,と相関している11. 測定するメインの速度論的パラメーターは直線速度 (VSL)、曲線速度 (VCL) 平均パス速度 (VAP)。VSL は、開始と精子を時間で割った値で撮影したエンドポイントとの間の距離です。VCL は、精子で撮影した正確な軌道に沿って実際の速度です。VAP は、軌道の派生平滑化されたパスに沿って速度です。これらのパラメーターは、直線性 (LIN)、真直度 (STR)、揺れ (一) 横方向のヘッドの動き (ALH) とビート クロス周波数 (BCF)4,10の振幅のような暴行測定など追加の運動情報を許可します。
哺乳類の精子分析システムがもともと、ドナー (約 37 ° C) の体温で動作するシステムの要件の 1 つです。このソフトウェアは魚種にも使えるとはいえ、精子分析結果の誤差を減らすためにいくつかの適応を作るべきです。サケやウナギの8,12など、いくつかの魚種で受精は低温 (およそ 4 ° C)2,4で発生します。したがって、不快な労働条件を避けるためには、冷却装置を開発する必要があります。また、魚類精子のいない精液の運動性、運動を有効に浸透衝撃を必要です。海洋生物の培地は、高張べき間淡水種のため活性化中低張性浸透圧が必要です。しかし、いくつかの種は、サケ科魚類、としてイオン濃度もかもしれない重要な3,4,9。活性化後の魚の精子は運動 (2 分以内)13,14高速で信頼性の高いデータ15を取得する最適なフレーム レートを決定することが重要されているの急速な減少によって特徴付けられます。
本研究の目的は、デザインし、魚精子サンプルの冷凍システムを適用です。さらに、このプロトコルは、種に応じて標準プロトコルの確立のための最適なフレーム レートを決定する方法を定義します。このプロトコルの使用は、モデルとしてヨーロッパのウナギを用いた魚精評価のコンテキストで新しい扉を開きます。
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Protocol
含む動物対象としている手順は、農業生産や家畜、大学パラオレイ バレンシアでの一般的な方向性によって (2015/VSC/エンドウ/00064) を承認しました。
1. 捕われの身で精子を成熟したヨーロッパのウナギから収集します。
注: 使用ヨーロッパうなぎ男性海水と一定した温度 (20 ° C) での再循環システム タンクに保持されます。毎週の腹腔内注射 (ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG); 魚体重の g あたり 1.5 IU) を通してホルモンを扱います。慣らす徐々 に始まる 3 日間淡水魚に海水交換が続く (1/3 水タンク内の) 37.0 g/mL の塩分濃度に到達するまで 2 日おき。
- 良質の精子のサンプルを取得するホルモン注射後 24 h ウナギを麻酔します。
- あらかじめ、麻酔の準備: 70% エタノール 100 mL にベンゾカインの 300 mg を追加。よく混合し、4 ° C で保存
- 60 mg/L の最終的な集中を取得し、正しくミックス システム水の 5 L の柔軟なバケツにベンゾカインを希釈します。
- ベンゾカイン システム水とバケツに魚を転送します。魚が落ち着くまで、数分を待ってください。
- 水で陰部をクリアし、糞便、尿や海水によって精子サンプルの汚染を避けるために吸水紙を乾燥します。
- 腹部に穏やかな圧力を適用し、真空ポンプを使った 15 mL プラスチック チューブに精子を採取します。精子の量まで 6-7 mL、男性によって。
- 運動解析を実施するまで少なくとも 1 時間のための 4 ° C で精子サンプルを保ちます。
2. 冷蔵庫で冷やし、精子サンプルを希釈
- 原因の解決策を事前に準備します。
注: それぞれの種に固有のエクステンダー ・ ソリューションで精子サンプルを希釈する必要があります。- うなぎ精子サンプル (P1 中) の非活性化メディアを準備します。重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウムと 250 mL の蒸留水に塩化カルシウム 0.037 g 0.56 g の 0.127 g の 1.828 g 0.42 g を追加します。ミックスも解散します。4 ° C でのストア
- 一定温度でサンプルを維持するために 4 ° c のクーラーのブロックを設定します。温度が安定するまで待ちます。
- それぞれの種にソリューション固有の攪拌機構を用いた精子サンプルを希釈します。
注: 希釈倍率固有種であり、プロトコルの標準化を定義する必要があります。まず、手順 3 と 4 で説明したように、ソフトウェアを使用して運動の事前の分析で得られた濃度に基づく精子濃度を予測します。この分析とは、運動の割合に基づいて最高の精子のサンプルを選択することが可能ですも。この後、研究者は正しい濃度で最高のサンプルを用いた実験のためのデータ収集を開始できます。- 1:50 の比率で P1 中うなぎ精子サンプルを希釈します。500 μ L の希釈うなぎ精子を準備するには、新鮮な精子サンプルを 50 μ l 添加し、P1 の 450 μ L を追加します。よく混ぜます。
3. 精子の運動パラメーターを評価します。
-
セットアップ ソフトウェアの運動モジュール
- 4 ° C のクーラーの段階を設定し、それが安定するまでを待ちます。
- ソフトウェアを開き、運動モジュールを選択します。必要な場合は、ユーザー名とパスワードを作成します。
- プロパティと精子分析を開始する前に必要なパラメーターを選択します。
- 種をクリックして |魚。
- それぞれの種の最高の技術的な条件によって1 秒あたりのフレームとイメージの数を選択します。1 秒あたり 120 の画像の両方のオプションを設定します。
- 否定的なコントラストを選択します。精子の軌跡16の正確な再生のために必須です。
- 対応する商工会議所のカウントとビデオカメラのスケールを選択します。実験で使用される倍率レンズのカメラを調整します。カウント部屋として SpermTrack10 と 10 倍の規模を設定します。
注: 一般的に、カウントの商工会議所で 10 μ m の深さと 10 倍の倍率のレンズが推奨条件以来、彼らはすべての精子のよりよい焦点を提供し、セルの最大数をキャプチャします。ただし、それぞれの種の運動解析のための最適な条件の以前の研究をすることをお勧めします。 - それぞれの種の粒子領域と接続を調整します。2 の2 μ m と 7 μ m で接続で最小の粒子領域を設定します。
注: 魚のため、粒子面積の範囲は 2-5 μ m と接続との間の最小値は精子の速度とフレーム レートに依存します。 - 設定を保存します。
- キャプチャを選択します。
-
ソフトウェアでのヨーロッパウナギ精子を分析します。
- 2 %bsa の蒸留水 25 mL に市販塩の 0.946 g を追加することによってソリューションの活性化 (人工海水) を準備します。
- 500 mL の活性剤溶液 (人工海水) を取り出して、クーラーのブロックにします。
注: 一般に、魚の精子をアクティブに浸透衝撃イベント、いくつかの種のイオン濃度も重要かもしれませんが。海洋生物の培地は、高張べき間淡水種のため活性化中低張性浸透圧が必要です。 - 冷却ステージの下で数える商工会議所を置き、4 ° C に温度が安定するまで待つ
- ミックス活性化と希薄化後精子精子をアクティブにし、アクティブ化後 5-10 秒間録画運動を開始します。
- カウントの商工会議所の活性化ソリューションの場所 4 μ L を取る。
- 優しく精子細胞の損傷を防ぐため、遠心の 3 回を揺することによって希釈した精子をホモジナイズしてください。
- 0.5 μ L の希釈した精子を取り出して活性剤混ぜてカウントの商工会議所ですぐにカバーをかけます。
注: この手順は、5 以上を取る必要がありますいない s 分析をできるだけ早く開始します。 - 精子細胞に焦点を当てるし、セル (補足図 1 a) 間の遮断を避けるために精子 (150 に 200 細胞) の低い数字によって定義された最高の視覚領域を見つけます。速度に従って分かれている精子のトラックを取得するビデオのキャプチャを選択します。
- キャプチャを取得、結果の変動が少なく進み以前のように最適な間隔である 7 に 3 フィールドを取得するを選択します。120 の s ライセンス認証後カウント チャンバーのカバーの結露を避けるためにまでビデオを録画できます。
- 出口の一般的なビューのすべてのフィールドを選択します。
4. 運動データを取得します。
- フィールドを選択 |部分的な |保存とファイル名を選択します。保存をクリックします。
注: スプレッドシートは、部分的なデータ、グラフおよび精子トラックの画像の平均値を提供します。 - 一般的なデータを選択 |ファイル名 |保存。
注: データは、すべてのフィールドの個々 の精子の運動の値を提供します。
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Representative Results
精子の運動の時間効果の解析
15 から静的な精子の割合増加するヨーロッパのウナギの場合 120 s (36.9% 20.9%) から s (24.4% から 40.7%)、活性化とモバイルの進歩的な精子の割合が減少しました。(図 1 aと1 b)。速度に基づいて、精子細胞は時間 (図 1と1 D) 減少の経過速度の低下を示した。急速な速度で精子の割合が減少 (49.4% 26.6%) から約 23% と音速を持つ精子の割合は約 7% を増加しました。
フレーム レートとカウントのチャンバーの効果
種は、最適な結果を得るのため、異なるフレーム レートを必要とします。ロシアのチョウザメ 150 フレーム/秒 (fps; が必要です。図 2 a)。コイが必要です 100 fps (図 2 b)。そして、グレイ、200 fps なかった最適な速度論的結果 (図 2) が得られる。これらの結果はカウントの深さに依存していなかったチャンバー テスト (図 2 a-2 C)。
精子の集団構造
精子の亜種の同定は、統計分析に基づいています。元本の確定は、まずコンポーネント (主成分分析;PCA) 運動データの完全なセットから。その後、PCA 後に得られる精子派生指標クラスタ リングの手順が実行されます。
この研究という 4 つの異なる集団を示した大西洋サケ精子を使用しました: 非線形低速 (低リン、STR および VCL)、高速非線形 (低い STR 高い VCL)、高速リニア (高林、STR と VCL) と最速リニア (最高林、STR と VCL)。野生動物からの世代に沿って変化するこれらの集団の分布は養殖もの (図 3)。
図 1: 進歩性とヨーロッパのウナギ精子の運動性に及ぼす時間後活性化。A と B) の 15 および 120 s 進歩性の割合それぞれ;・ C ・ D) 時間の経過速度に基づいて運動の割合 (15 のそして 120 s ライセンス認証後、それぞれ).累進度が 3 つのグループに分けられた: 進歩的な運動性細胞 (白;VCL 平均値 ± SD: 114.5 18.2、101.4 ± ± 34.5 μ m/秒で 15 と 120 秒、それぞれ)、ない進歩的な運動性細胞 (灰色;VCL 平均値 ± SD: 84.8 ± 17.4 μ m/s 15 s と 120 の 84.6 ± 16.5 μ m/s の s)、および静的精子 (ブラック)。精子速度の 4 つのグループに分かれていた: 急速な (VCL 平均値 ± SD: 119.3 ± 13.7 μ m/s 15 s と 120 118.9 ± 13.3 μ m/s の s; ホワイト)、媒体 (VCL 平均値 ± SD: 79.7 ± 15.5 μ m/s 15 s と 120 の 79.6 ± 15.5 μ m/s の s; ライトグレー)、低速 (VCL 平均値 ± SD: 32.9 ± 6.5 μ m/s 15 s と 120 の 32.6 ± 6.6 μ m/s の s; 濃い灰色) と静的 (ブラック)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: フレーム レートと 3 つの淡水魚の種のカウントのチャンバーの効果:(A) ロシアのチョウザメ (B) 一般的な鯉とグレイリング (C)。50、100、150 の精子分析を行った 200 fps、2 つの商業のカウントを使用して異なる深さ (10 〜 20 μ m) とチャンバーと。黒い円は、それぞれの種の最高のフレーム レートを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: アトランティック サーモンの三世代の精子集団構造: 野生の男性 (F0) と捕われの身 (F1 および F2) で生産された最初の 2 つの世代します。クラスター分析の後 4 つの集団が観察された: 非線形精子を低速 (低リン、STR と VCL; クラスター 1; ブラック)、非線形精子 (低 STR の高い VCL クラスター 2; 濃い灰色) を高速、高速線形精子 (高林、STR と VCL; 3; をクラスターグレーの中間) と線形精子最速 (最高の林、STR と VCL; クラスター 4; ライトグレー)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1。(A) と (B) 最悪細胞濃度として定義されているヨーロッパウナギ精子の運動解析からさまざまな視覚領域。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルで使われる精子分析ソフトウェア使用されています研究者によって世界的な種、魚など。しかし、魚は精子の評価に影響を与えることができるいくつかの特定の機能にあります。魚の精子はすぐに低下し、活性化した後短時間の運動につながる活性化の瞬間に高速を示した。その上、再現の温度は種に依存し、いくつかのケースでは約 4 ° C2,4,8,12かもしれない。したがって、魚の精子分析のためのコンピュータ システムの効率を改善するためにいくつかの適応にする必要です。運動パラメーターの基本原則は買収と運動精子の連続画像の解析です。ほとんどのシステムは、ハードウェアとソフトウェア17,18,19,20,21,22の制限のための標準フレーム レート (16、25、30、50、または 60 fps) を使用します。しかし、いくつかの研究を示したより高いフレーム レートが VCL、STR などのいくつかの速度パラメーターを増加する BCF15,23,24。精子の活性を評価し精子11,17,18,19,の最大速度を見つける必要があるとき、これは特に重要です。25.、解析の温度による光学顕微鏡および一定した温度でサンプルを冷蔵する新しい技術の冷却板も改善できる分析時間をかけて。現在の仕事では、2 つの魚の精子運動解析と温度感覚に関連する主な問題解決へのアプローチを提供しています。にもかかわらず、結果はいくつかの淡水種に焦点を当て、活性化中は、それぞれの種に適応する必要があります海洋種のこの方法を使用できます。
市場での製品の範囲、または同じ製品の異なるバージョンがあります。システムは、同じ原理がある、場合でも、各自ある別詳細結果26,27,28の非互換性の結果です。その上、魚の精子の質の評価まだ方法論的・技術的な制限があるが。精子の活性化技術の活性化後の解析時間は、精子品質評価29,30に影響を与える 2 つの重要な要因。ビデオ録画の精子サンプルの活性化と画像の安定化までの時間が約 5 にする必要があります (5-20 秒の時間間隔) の最初の秒から s が最も役に立つデータ2,4を提供しています。精子分析の時間は、スライド ガラスの結露問題による限られた可能性があります。ただし、魚の精子は 2 分の2未満の積極的な動きとアクティブなまま。技術的なレベルで精子の軌跡15の正確な再生を与える詳細情報を取得する「最適な」フレーム レートを知っておく必要です。フレーム レートが低い、軌道の詳細より高いフレーム レートで情報は冗長15,31になるに対し高速・非線形精子の特に失われます。フレーム レート (最大 250 fps) はいくつかの魚種のグレイリング サーモンなど、いくつかの魚種の精子の最大速度を見つけるに十分ではない可能性があります。この変化は特定種をプロトコルを標準化し、信頼性の高い結果15,23,24を取得するそれぞれの種に対して定義する必要があります。魚の大規模な鞭毛の運動を制限可能性がありますカウント溜まりの深さと精子最大速度11,32,33に到達できませんでした。その上、ソフトウェアがありますいくつかの制限本物精子の検出セル範囲の交差があるとき。
精子の質の古典的な査定は、濃度の予測と結果の変動を作り出すことができる運動の割合に基づく主観的な分析です。ただし、コンピューター化されたシステムは、運動パラメーターの迅速、正確かつ定量的な測定を提供します。この客観的な分析データの大規模な量を与えるし、結果34,35,36,37の可変性を削減します。精子運動動作の応答は解析の温度に依存し、種38,39,40の間で異なります。精子分析の最適温度は、精子速度と再生38,40の自然条件に類似の運動期間中に提供できます。したがって、冷却装置で精子分析ソフトウェアは、魚の精子の質の評価を向上させます。
精子品質分析の結果は、魚の精子特性と精子集団に基づいてすべての動物種41,42で精子評価の将来可能性があります品質に関する知識が向上します。実用的なレベルでこの手法が高品質のブリーダーは、選考、人工授精、精子競争速度と進歩性に基づく種子線量計算については精子を得るを手伝いますの指標となると不妊治療の可能性。すべての知識は、最後の数十年2,13で凍結と魚の精子貯蔵への関心を刺激する保全と養殖プログラムを含む別の分野に適用できます。毒物学的効果は、精子運動特性43,44に基づく分類学的研究の発展、環境問題だけでなく、研究のための特別な関心をまた得ています。
この作品は、魚類の精子運動解析のための自動ソフトウェアの最適化が結果を向上させる方法を示しています。プロトコルの標準化は、温度解析、種に応じて異なる可能性がありますフレーム レートを考慮に入れなければなりません。ただし、魚の精子の運動の解析、研究者が注意を払うべき 2 つの重要なステップです。精液採取は糞便、尿や水によって汚染のためサンプルを破壊することが最初の重要なステップ (海水または淡水)。その他の重要なポイントは、精子の活性化の瞬間とビデオ録画の開始に関連付けられます。この手順は、精子が活発な動きをしたら、データを収集する、できるだけ早く行う必要があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、コストの協会から資金を受けている (食品と農業コスト アクション FA1205: インプレス (ジョージア州 No 642893) プロジェクト AQUAGAMETE と欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラムの下でマリー マリアスクウォドフスカ キュリー。具体的にはこのプロジェクトの記録ビデオで彼の積極的な参加の学生アルベルト ・ ヴェンドレル ベルナベウ、PROiSER の科学的なチームに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
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