Protokolls beskriver förfarandet fisk spermier bedömning med hjälp av datorstödda spermier analys och kylanordningar. Programvaran ger en snabb, korrekt och kvantitativ analys av fisk spermiernas kvalitet baserat på spermier motilitet, vilket kan vara ett användbart verktyg i vattenbruk att förbättra reproduktionen framgång.
För gamet kvalitetsbedömning finns det innovativa, snabb och kvantitativa tekniker som kan ge användbara data för vattenbruk. Datoriserade system för spermier analys utvecklades för att mäta flera parametrar och en av de vanligaste uppmätta är spermierörlighet.
Inledningsvis utformades denna datorteknik för däggdjursarter, men det kan även användas för fisk spermier analys. Fisk har särdrag som kan påverka spermier bedömning såsom en kort motilitet tid efter aktivering och, i vissa fall anpassning till lägre temperaturer. Det är således nödvändigt att ändra både mjukvara och hårdvara komponenter för att effektivisera motilitet analys för fisk spermier analys. Spermiereceptorn, används värmeplattan för att upprätthålla optimala temperaturer av spermier. Dock för vissa fiskarter är det fördelaktigt att använda en lägre temperatur för att förlänga varaktigheten av motilitet, eftersom spermierna förbli aktiva i mindre än 2 min. Det är därför nödvändigt att kyla prover vid konstant temperatur över tiden av analys, inklusive på det optiska mikroskopet kylning enheter. Det här protokollet beskriver analys av fisk spermierörlighet använder programvara för spermier analys och nya kylanordningar för att optimera resultaten.
Effekten av reproduktion beror på kvaliteten på både könsceller (ägg och spermier)1,2. Detta är den viktigaste faktorn som bidrar till framgångsrik befruktning, möjliggör utveckling av livskraftiga avkommor3,4. Den praktiska utvärderingen av könsceller kvalitet är det bästa verktyget för att definiera fertilitet potentialen i ett exemplar.
Blanda sperma från flera hanar är vanligt i produktionen av många vattenlevande kommersiella arter4. Men spermier variabiliteten mellan hanar kan leda till spermier konkurrens och följaktligen inte alla män lika bidrar till genbank5. I denna mening är korrekt utvärdering av enskilda ejakulat/spermier funktioner, till exempel motilitet, grundläggande för erhålla diskriminerande information angående enskilda manlig fertilitet potentiella. Direkt observation av spermiernas rörlighet kan producera missvisande och subjektiva data eftersom det kräver tid och erfarenhet, vilket leder till bristande konsekvens och inkompatibilitet av resultat6,7. Men finns det många innovativa, snabb och kvantitativa tekniker som kan ge en tillförlitlig spermier kvalitet analys2,4.
Datorstödd spermier analys utvecklades för att erbjuda korrekta uppgifter om spermier kvalitet8. Denna teknik omfattar utveckling av programvara som är associerad med fas kontrast Mikroskop som gör bedömningen av spermiernas rörlighet. En begränsande faktor för motilitet parametern är dock bildhastigheten för videokameran. Enskilda spermier banor är baserade på spermier huvudet centroiden position i bildrutor av videoinspelningar, som är korrelerad med flagellar rörelse mönster3,9,10, 11. de kinetiska parametrar mäts är linjär hastighet (VSL), krökt velocity (VCL) och genomsnittliga sökvägen velocity (VAP). VSL är avståndet mellan start- och slutpunkten vidtagit de spermier som dividerat med tiden. VCL är den verkliga hastigheten längs den exakta bollbana vidtagit spermier. VAP är hastigheten längs en härledd jämnas bana för bana. Dessa parametrar kan ytterligare kinetiska information, inklusive linearitet (LIN), rakhet (STR), vingla (WOB) och misshandeln mätningar som amplitud av laterala huvudrörelser (ALH) och beat-cross frekvens (BCF)4,10.
Spermier analys systemet användes ursprungligen för däggdjursarter, och ett av kraven för systemet är att driva på kroppstemperaturen hos givaren (cirka 37 ° C). Denna programvara kan också användas för fiskarter; även om det är nödvändigt att göra vissa anpassningar för att minska felet av spermier analysresultat. I vissa fiskarter, såsom laxfiskar och ål8,12, sker befruktning vid låg temperatur (omkring 4 ° C)2,4. Således, kylning enheter bör utvecklas för att undvika obekväma arbetsförhållanden. Dessutom fisk spermier är orörliga i sädesvätska och kräver en osmotiska chock att aktivera motilitet. För sötvatten arter, bör aktivator mediet har hypoton osmolalitet, medan för marina arter medium bör hyperton. Men för vissa arter, kan som laxfiskar, ion koncentrationen också vara viktigt3,4,9. Efter aktivering kännetecknas fisk spermier av en snabb minskning av motilitet (mindre än 2 min)13,14 och hög hastighet, att vara avgörande för att bestämma den optimala hastigheten att erhålla tillförlitliga uppgifter15.
Syftet med denna studie är att utforma och tillämpa kylsystem för fisk spermier prover. Dessutom definierar detta protokoll hur att hitta de optimala bildrutehastigheter för etableringen av standardprotokoll beroende på Art. Användning av detta protokoll öppnar nya dörrar i samband med fisk seminal utvärdering, med den europeiska ålen som modell.
Spermier analys programvara som används i detta protokoll har använts av forskare som är i världen för olika arter, inklusive fisk. Fisk har dock vissa specifika funktioner som kan påverka bedömningen av spermier. Fisk spermier visade hög hastighet i ögonblicket av aktivering som minskar snabbt och leder till en kort tid av motilitet efter aktiveringen. Dessutom temperaturen av reproduktion artspecifikt och, i vissa fall kan vara runt 4 ° C2,4,</su…
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt har beviljats medel från föreningen kostnaden (mat och jordbruk kostnad åtgärd FA1205: AQUAGAMETE och Europeiska unionens programmet Horisont 2020 forskning och innovation under Marie Sklodowska-Curie projektet IMPRESS (GA nr 642893). Vi vill tacka den vetenskapliga teamet av PROiSER, särskilt till studenten Alberto Vendrell Bernabéu, för hans aktiva deltagande i videoinspelningen av detta projekt.
Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
Cooler block | PROiSER | Prototype | |
ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |