تقييم الحيوانات المنوية الأسماك باستخدام برامج وأجهزة التبريد
Summary
ويصف هذا البروتوكول إجراء تقييم الحيوانات المنوية الأسماك باستخدام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب وأجهزة التبريد. ويعطي البرنامج السريع، دقيقة، والتحليل الكمي لجودة الحيوانات المنوية الأسماك استناداً إلى حركية المني، التي يمكن أن تكون أداة مفيدة في تربية الأحياء المائية في تحسين نجاح الاستنساخ.
Abstract
لتقييم نوعية مشيج، هناك تقنيات مبتكرة وسريعة، والكمية التي يمكن أن توفر بيانات مفيدة لتربية الأحياء المائية. ووضعت النظم المحوسبة لتحليل الحيوانات المنوية لقياس العديد من المعلمات وواحد لقياس الأكثر شيوعاً هو عدد الحيوانات المنوية الحركة.
في البداية، صمم هذا تكنولوجيا الحاسوب لأنواع الثدييات، على الرغم من أنه يمكن استخدامها أيضا لتحليل الحيوانات المنوية الأسماك. الأسماك لها السمات المحددة التي يمكن أن تؤثر على الحيوانات المنوية التقييم مثل فترة زمنية قصيرة حركية بعد التنشيط، وفي بعض الحالات، التكيف مع انخفاض درجات الحرارة. وبالتالي، من الضروري تعديل مكونات البرامج والأجهزة لجعل تحليل حركية أكثر كفاءة لتحليل الحيوانات المنوية الأسماك. للثدييات من الحيوانات المنوية، يتم استخدام لوحة التدفئة للحفاظ على درجات الحرارة المثلى للمني. ومع ذلك، لبعض أنواع الأسماك، أنها مفيدة لاستخدام درجة حرارة أقل لإطالة فترة حركية، نظراً للحيوانات المنوية تبقى نشطة لأقل من 2 دقيقة. ولذلك، أجهزة التبريد ضرورية للثلاجة العينات في درجة حرارة ثابتة على مر الزمن التحليل، بما في ذلك في المجهر الضوئي. ويصف هذا البروتوكول تحليل عدد الأسماك الحيوانات المنوية الحركة باستخدام البرمجيات لتحليل الحيوانات المنوية وتبريد جديدة من الأجهزة تحسين النتائج.
Introduction
فعالية الاستنساخ يعتمد على نوعية كل الأمشاج (البيض والحيوانات المنوية)1،2. وهذا هو العامل الرئيسي الذي يسهم في نجاح الإخصاب، مما يتيح وضع ذرية صالحة3،4. تقييم جودة مشيج مريحة هو أفضل أداة لتحديد إمكانات الخصوبة من عينة.
خلط الحيوانات المنوية من الذكور متعددة ممارسة شائعة في إنتاج العديد من الأنواع التجارية المائية4. بيد أن تنوع الحيوانات المنوية بين الذكور يمكن أن يؤدي إلى المنافسة الحيوانات المنوية ونتيجة لذلك، ليس جميع الذكور على قدم المساواة تساهم الجينات5. وبهذا المعني، التقييم الصحيح لميزات السائل المنوي/المني الفردية، مثل حركية، أمر أساسي للحصول على معلومات تمييزية فيما يتعلق بخصوبة الذكور الفردية المحتملة. الملاحظة المباشرة لعدد الحيوانات المنوية الحركة يمكن أن تنتج بيانات غير دقيقة وغير موضوعية كما أنه يتطلب الوقت والخبرة، مما يؤدي إلى عدم الاتساق وعدم التوافق بين نتائج6،7. ومع ذلك، هناك العديد من تقنيات مبتكرة وسريعة والكمية التي يمكن أن توفر الحيوانات المنوية موثوقة نوعية تحليل2،4.
تم تطوير تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب لتقديم بيانات دقيقة عن نوعية الحيوانات المنوية8. وتشمل هذه التكنولوجيا تطوير البرمجيات المرتبطة مجهر تباين المرحلة التي تسمح تقييم لعدد الحيوانات المنوية الحركة. ومع ذلك، هو عاملاً يحد من المعلمة حركية معدل الإطار لكاميرا الفيديو. المني كل المني والمسارات تستند رئيس الموقف centroid في إطارات متتالية من تسجيلات الفيديو، الذي يرتبط بحركة flagellar أنماط3،،من910، 11. هي المعلمات الحركية الرئيسية قياس سرعة الخط المستقيم (VSL) والمنحنية الخطوط السرعة (VCL) ومسار متوسط السرعة (برنامج عمل فيينتيان). VSL هو المسافة بين نقطة البداية ونقطة النهاية التي اتخذتها المني مقسوماً على وقت. VCL هي السرعة الحقيقية على طول المسار الدقيق اتخذتها المني. هو برنامج عمل فيينتيان سرعة على طول طريق ممهدة مشتقة من المسار. تسمح هذه المعلمات معلومات حركية إضافية، بما في ذلك الخطي (لين) والاستقامة (STR) وتمايل (وب) وقياسات الضرب مثل السعة لحركة الرأس الأفقي (آلة) والتردد عبر فوز (معامل التركيز الأحيائي)4،10.
كانت في الأصل تستخدم نظام تحليل الحيوانات المنوية لأنواع الثدييات، ومن متطلبات النظام تعمل في درجة حرارة الجسم للجهة المانحة (حوالي 37 درجة مئوية). يمكن أيضا استخدام هذا البرنامج للأنواع السمكية؛ على الرغم من ذلك، من الضروري إجراء بعض التعديلات لتقليل الخطأ في نتائج تحليل الحيوانات المنوية. في بعض أنواع الأسماك، مثل السلمون وثعبان البحر8،12، يحدث الإخصاب في درجة حرارة منخفضة (حوالي 4 درجات مئوية)2،4. وبالتالي، ينبغي وضع أجهزة التبريد لتجنب ظروف العمل غير مريح. وباﻹضافة إلى ذلك، المني الأسماك اسم في السائل المنوي وتتطلب حدوث صدمة ناضح بتنشيط حركية. المتوسطة المنشط لأسماك المياه العذبة، ينبغي أن يكون osmolality ناقص التوتر، بينما ينبغي أن تكون المتوسطة مكثف للأنواع البحرية. ومع ذلك، لبعض الأنواع، كالسلمون، تركيز أيون يمكن أيضا هامة3،،من49. بعد التنشيط، تتميز بانخفاض سرعة حركية (أقل من 2 دقيقة)13،14 والسرعة العالية، ويجري حيوية لتحديد معدل الإطار الأمثل للحصول على بيانات موثوق بها15الأسماك الحيوانات المنوية.
أهداف هذه الدراسة هي لتصميم وتطبيق نظم التبريد لعينات الحيوانات المنوية من الأسماك. وبالإضافة إلى ذلك، يعرف هذا البروتوكول كيفية تحديد معدلات الإطار الأمثل لوضع بروتوكولات قياسية تبعاً للأنواع الأحيائية. استخدام هذا البروتوكول يفتح أبواباً جديدة في سياق التقييم المنوي الأسماك، استخدام ثعبان البحر الأوروبي كنموذج.
Protocol
Representative Results
Discussion
برمجيات تحليل الحيوانات المنوية المستخدمة في هذا البروتوكول قد استخدمت الباحثين في جميع أنحاء العالم لمختلف الأنواع، بما في ذلك الأسماك. ومع ذلك، قد الأسماك بعض السمات المحددة التي يمكن أن يؤثر على تقييم الحيوانات المنوية. وأظهرت المني الأسماك عالية السرعة في لحظة التنشيط التي تنخفض بسر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من رابطة التكلفة (الأغذية والزراعة تكلفة العمل FA1205: أكواجاميتي، وبرنامج الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث والابتكار تحت ماري سكلودوفسكا كوري المشروع إعجاب (GA لا 642893). ونود أن نشكر فريق علمي من برويسير، على وجه التحديد للطالب ألبرتو فندريل بيرنابيو، لمشاركته النشطة في تسجيل الفيديو من هذا المشروع.
Materials
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout – the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?. Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O’Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations’ structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
