Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode des Verursachens Status Epilepticus durch systemische Pilocarpin Injektion und spontane wiederkehrende Anfälle mit lebenden Tieren, die mit einem drahtlosen Telemetrie video und Elektroenzephalogramm System zu überwachen. Dieses Protokoll kann genutzt werden, für das Studium der pathophysiologische Mechanismen der chronischen Epilepsie, Epileptogenesis und akute Anfälle.
Abstract
Temporallappen-Epilepsie (TLE) ist eine häufige neurologische Erkrankung im Erwachsenenalter. Für Translationale Studien von chronischen Epilepsie wird Pilocarpin induzierten Status Epilepticus (SE) häufig ausgewählt, um spontane wiederkehrende Anfälle (SRS) zu rekapitulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll der SE Induktion durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von Pilocarpin und Überwachung der chronischen wiederkehrenden Anfällen mit lebenden Tieren, die mit einem drahtlosen Telemetrie video und Elektroenzephalogramm (EEG) System. Wir zeigten bemerkenswerte Verhaltensänderungen, die Aufmerksamkeit nach Pilocarpin Injektion und deren Korrelation mit hippocampal neuronalen Verlust bei 7 Tagen und 6 Wochen nach Pilocarpin. Wir beschreiben auch die experimentelle Verfahren der Implantation der Elektroden für Video und EEG-Aufzeichnung und Analyse der Häufigkeit und Dauer der chronisch wiederkehrende Anfälle. Abschließend besprechen wir die möglichen Gründe, warum die erwarteten Ergebnisse nicht in jedem Fall erreicht werden. Dies bietet einen grundlegenden Überblick über die Modellierung von chronischen Epilepsie bei Mäusen und Leitlinien für die Problembehandlung. Wir glauben, dass dieses Protokoll als Grundlage für geeignete Modelle der chronischen Epilepsie und Epileptogenesis dienen kann.
Introduction
TLE ist eines der häufigsten erworbenen Epilepsien1. Menschen mit Epilepsie erleben wiederkehrende Anfälle durch abnorme neuronalen Aktivitäten im Gehirn2,3. Da die TLE oft unlösbar ist, ist es wichtig zu verstehen, die grundlegenden Mechanismen, die die Entwicklung der Epilepsie.
Tiermodellen, die die wichtigsten Merkmale des menschlichen TLE rekapitulieren können bieten bessere Anerkennung von TLE Pathophysiologie, so dass wir leicht überwachen und manipulieren wichtige Faktoren bei der Epileptogenesis. Unter anderem wurde Chemoconvulsants-induzierten SE weit verbreiteten4,5. Im Gegensatz zu anderen Epilepsie-Modellen, wie z. B. elektrische Stimulation zeigt keine hippocampale Sklerose und robuste SRS6,7,8, kann die systemische Injektion von Chemoconvulsants klinische Pathogenese der menschlichen TLE nachahmen, d.h., anfängliche-Hirn-Trauma, eine Latenzzeit und einer chronischen Epilepsie inszenieren manifestierenden SRS5,9,10. Daher kann diese Technik in verschiedenen Studien erklären, die Mechanismen der akuten Schädigung des Gehirns, Epileptogenesis oder Beschlagnahme Unterdrückung genutzt werden. Darüber hinaus sind histopathologische Veränderungen induziert durch Chemoconvulsants ähnlich denen im menschlichen TLE, bietet eine zusätzliche Begründung für den Einsatz von TLE Nager-Modelle10,11,12. Insbesondere wurden strukturelle Schäden unter Einbeziehung des Hippocampus konsequent in beiden Kainic Säure - und Pilocarpin-induzierte SE Modellen reproduziert. Allerdings kann im Vergleich zu Kainic Säure Injektion, Pilocarpin Modell robuster SRS bei Mäusen, produzieren, die beträchtliche Vorteile für chronische Epilepsie zu studieren, wenn man die breite Verfügbarkeit von transgenen Maus Linien5, 13 , 14 , 15. Darüber hinaus Beschlagnahme Progression nach Pilocarpin Injektion ist in der Regel schneller als im Kainic Säure-Modell bietet ein weiteres Indiz für die effektive Nutzung von Pilocarpin Modell der Epilepsie.
Hier zeigen wir eine Methode der induzierende SE durch die i.p.-Injektion von Pilocarpin und durch Video und EEG Überwachung bei chronischer Epilepsie.
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Protocol
Alle experimentelle Verfahren wurden von der Ethikkommission der katholischen Universität Korea angenommen und wurden im Einklang mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publikationen Nr. 80-23) durchgeführt.
(1) SE Induktion
- Kaufen Sie 8 Wochen alten männlichen C57BL/6NHsd Mäusen und wiegen Sie jeder Maus. Verwenden Sie dann ein Filzstift markieren die Schwänzen von alle Mäuse für ihre einfache Identifizierung während SE Induktion.
- Berechnen Sie die Menge von Scopolamin Methylbromid (Scopolamin; 2 mg/kg), Terbutalin Hemisulfate (Terbutalin; 2 mg/kg) und Pilocarpin Hydrochlorid (Pilocarpin; 280 mg/kg), bezogen auf das Gewicht der Maus, und fügen Sie Kochsalzlösung (0,9 % NaCl, 10 mL/kg) Lösungen zu machen.
Hinweis: Zum Beispiel, wenn das Gewicht der Maus 25 g, folgende Beträge gelten: Scopolamin und Terbutalin: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0,05 mg, Kochsalzlösung: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL, Pilocarpin: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg , Saline: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL. - Laden Sie die Scopolamin und Terbutalin Mischung in eine 1 mL Spritze mit einer 30 G-Nadel. Spritzen Sie die Lösung intraperitoneal in jeder Maus, und dann wieder die Mäuse in ihren Käfigen. Injizieren Sie bei 30 min nach der Verabreichung von Scopolamin und Terbutalin Pilocarpin Lösung in jeder Maus (i.p., 1 mL Spritze, Nadel 30 G). Unmittelbar nach Pilocarpin Injektion setzen Sie die Mäuse in einem Inkubator (28-30° C) für die Beobachtung.
- Beobachten Sie sorgfältig das Verhalten der Mäuse bis SE induziert wird. Wenn limbische motorische Anfälle, die Stufe 3 oder höher nach Racine Skala entsprechen, erkannt werden, notieren Sie die Zeit und überwachen Sie die Mäuse um festzustellen, ob die Anfälle häufiger auftreten. Nach kontinuierlichen motorische Anfälle mehr als 2 min dauern, platzieren Sie den Mauszeiger in einen neuen Käfig bei Raumtemperatur und halten Sie Überwachung für 3 h um festzustellen, ob ihre krampfhafte Anfälle weiter und SE induziert wird. Die Mäuse, die nicht einschläfern SE ca. 2 h nach Pilocarpin Injektion.
Hinweis: Racine Skala; Stufe 1, Mund und Gesichtsbewegungen; Stufe 2, Kopf nicken; Stufe 3, Vorderbein Klonus; Stufe 4, Aufzucht mit Vordergliedmaße Klonus; Stufe 5, Aufzucht und mit Vordergliedmaße Klonus16fallen. Wenn die Maus nicht auf den Käfig bei Raumtemperatur sofort nach SE Induktion übertragen wird, kann die Maus durch Hyperthermie sterben. - Kündigen Sie Verhaltens akute Anfälle um 3 Uhr nach SE auftreten durch Injektion von Diazepam (i.p., 10 mg/kg; 1 mL Spritze, Nadel 30 G). Machen Sie die Diazepam-Lösung durch Verdünnung 5 mg/mL von Diazepam in 10 % Polyoxyl 35 hydriertes Rizinusöl durch Zugabe von Kochsalzlösung (i.p., 10 mL/kg; 1 mL Spritze, Nadel 30 G).
Hinweis: 10 % Polyoxyl 35 hydriertes Rizinusöl Lösung: 1 mL Polyoxyl 35 hydriertes Rizinusöl Lösung + 9 mL Kochsalzlösung. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur. Zum Beispiel, wenn die Maus Körpergewicht 25 g, injizieren 250 µL Diazepam Lösung: 50 µL 5 mg/mL Diazepam + 200 µL 10 % Polyoxyl 35 hydrierten Castor Öl-Lösung = 250 µL 1 mg/mL Diazepam. - Für Schein Mäuse, durchführen eine i.p.-Injektion der Scopolamin Methylbromid und Terbutalin Hemisulfate Mischung (i.p.; beide 2 mg/kg, 1 mL Spritze, 10 mL/kg; 30 G-Nadel). 30 min später, injizieren die Kochsalzlösung intraperitoneal (i.p., 10 mL/kg; 1 mL Spritze, Nadel 30 G).
Hinweis: Wenn die Maus Körpergewicht 25 g, injizieren Sie 250 µL Kochsalzlösung statt Pilocarpin. - Nach Diazepam verabreichen Injektion (i.p., 1 mL Spritze, Nadel 30 G), 1 mL 5 % Dextrose pro einzelnen Maus (1 mL Spritze, i.p.; 26 G-Nadel).
Hinweis: 1 mL 5 % Traubenzucker-Injektion stellt Energiequelle und Flüssigkeitszufuhr, die die Überlebensrate steigern kann. - Während der Nachbetreuung in den Inkubator (28-30 ° C) übermäßige Absonderungen wie Kot, Speichel und Tränen abwischen.
- Am 1. Tag nach SE Induktion wiegen Sie die Mäuse und für einen zusätzlichen Tag im Inkubator (28-30 ° C) aufbewahren. Am 2. Tag, nach SE Induktion wiegen Sie die Mäuse und wieder in ihre Heimat Käfig. Bieten sie feucht Chow um ihre Genesung zu erleichtern.
Hinweis: In diesem Experiment wurde die Sterblichkeitsrate für C57BL/6NHsd nach SE Kündigung 8,57 % im Durchschnitt (3, 35 Mäuse getestet). - Körpergewicht der Tiere täglich bis zu 7 Tage nach Pilocarpin zu messen und Spritzen die Mäuse mit 5 % Traubenzucker (1 mL Spritze, i.p.; 26 G-Nadel) wenn das Körpergewicht nicht gestiegen. Körper Gewicht Überwachung, wenn die Mäuse starten wieder Körpergewicht und verbrauchen feucht Chow problemlos 2 Tage nach der Injektion Pilocarpin beendet.
Hinweis: Wenn das Körpergewicht einer Maus nicht bis 7 Tage Post SE zunahm, schließen die Maus aus dem Experiment und einschläfern durch Kohlendioxid. Tod kann gelegentlich auftreten, je nach Hintergrund der Maus; bei C57BL/6NHsd starb jedoch weniger als 1 % der Mäuse in diesen Experimenten. Mit dem Überleben von mehr als 7 Tagen nach SE Induktion sterben die Mäuse selten während der Latenzzeit.
2. Implantation Chirurgie für Video-EEG Überwachung
- Bereiten Sie 12 Wochen alten Mäusen (4 Wochen nach SE Induktion), Telemetrie-Implantation für EEG Überwachung durchzuführen.
Hinweis: Zeitpunkt der Implantation kann abhängig von den experimentellen Zwecken und der Mausstämme geändert werden. - Vor der Operation zu betäuben die Maus mit einer Mischung (4:0.5) von Ketamin (50 mg/mL) und Xylazin (23,3 mg/mL) Lösung aufgelöst in Kochsalzlösung in einer Dosis von 2,5 µL/g Körpergewicht (1 mL Spritze, i.p.; 26 G-Nadel). Überwachen Sie Atemfrequenz und respiratorischen Anstrengungen der Maus in regelmäßigen Abständen (max. 15 min Intervall) und bewerten Sie die Tiefe der Narkose durch das Pedal Rückzug-Reflex.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in einem stereotaktischen Rahmen mit Ohr-Bars und ein Aufbissplatte und wenden Sie Tierarzt Salbe auf beide Augen, Blindheit zu vermeiden.
- Um sterilen Bedingungen während der Operation zu pflegen, Rasieren Sie chirurgische Websites mit einer Rasierklinge. Seien Sie vorsichtig, Fell Kontamination des Operationsfeldes zu verhindern. Nach dem Rasieren, desinfizieren Sie die Haut mit 70 % Ethanol und Jod-Lösung.
Hinweis: Operation sollte in einer aseptischen Weise tragen sterile Handschuhe und Masken, mit sterilisierten Geräten und aseptische Techniken durchgeführt werden. - Machen Sie nach der Bestätigung der Tiefe der Narkose eine Mittellinie Inzision der Haut des Schädels aussetzen. Machen Sie zwei Burr Löcher mit einem Bohrer befestigt, der stereotaktischen Apparat an den Koordinaten aus dem Bregma in der Anteroposterior Achse (AP): +0,1 mm, Mediolateral Achse (ML): +0,1 mm (Referenz) und AP: −0.2 mm, ML: +0,22 mm (linke parietalen Kortex)13.
- Reinigen Sie die Haut mit PBS-getränkten Baumwoll-Swaps, gefolgt von 70 % Ethanol und Jod-Lösung. Machen Sie einen längs-Schnitt in der Mitte des Kopfes mit einer Schere, Aussetzen des Lambda-Ausdrucks (der Punkt, wo die sagittale und die lambdoid Naht treffen), Bregma (der Punkt der Schnittpunkt der Kranznaht durch die sagittale Naht) und den Zielort.
- Anatomische Landmarken wie Lambda und Bregma zu identifizieren. Positionieren Sie den Bohrer am Bregma und beachten Sie die X, Y-Koordinaten für diesen Punkt.
- Verwenden Sie eine Gehirn-Atlas-Bücher oder veröffentlichte Verweise auf die entsprechenden Koordinaten der Hirnregionen für EEG-Aufzeichnung zu bestimmen. Dann berechnen Sie die Koordinaten für die Schrauben (Referenz und Aufnahme) unter Verwendung der Bregma Koordinaten bei Schritt 2.5.2 gemessen.
- Senken Sie langsam die Bohrkrone zu einem Bohrlochs achtgeben, einführen die Bohrkrone zu weit an der Stelle, wo der Schädel dünner wird.
- Stecken Sie der Körper des einzelnen Kanals drahtlose EEG Sender hinter dem Nacken subkutan und platzieren Sie flexible führt in der Nähe des Schädels.
- Legen Sie eine Edelstahl-Schraube (2 mm Länge) in jeder Bohrlochs mit einer Pinzette und ziehen Sie ihn mit Hilfe eines Schraubendrehers durch Drehung im Uhrzeigersinn. Stellen Sie sicher, dass die Schraube nicht zu weit tief durch den Grad der Drehung der Schraube einstellen, um Beschädigungen der Dura oder das Hirngewebe zu vermeiden.
- Streifen des Isolierung Mantels 2 mm von der Spitze der Leitungen und dehnen den Draht lange genug runden die Schneckenwelle für eine gute Verbindung zwischen dem Draht und die Schraube. Schließen Sie das Referenz an die vordere Schraube und die Aufnahme Messleitung an die Schraube in der parietalen Kortex. Wenden Sie dann dental Zement um die gesamte Baugruppe im Ort zu sichern, ohne dass die Metallteile.
- Nachdem Sie überprüft haben, dass der dental Zement durch Sichtkontrolle vollständig getrocknet ist, Naht der Haut und aktuell Mupirocin Salbe. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem 30 ° C Inkubator allein bis es erholt sich von der Operation (ca. 30 min). Dann zurückkehren Sie die Maus zu Hause Käfig, bis Video-EEG Dauerüberwachung beginnt.
Hinweis: Nach der Operation wird jede Maus (i.p., 1 mL Spritze, Nadel 30 G) mit 5 mg/kg Gentamicin (Antibiotika) und 5 mg/kg von Ketoprofen (Analgetika) injiziert. Tiere sollten überwacht werden, bis sie vollständig ambulante geworden. Sender-implantierten Mäuse haben eine Erholungszeit von ca. 1 Woche.
3. Video und EEG Monitoring und Analyse
- Eine Maus in einen einzelnen Käfig und den Käfig auf den Funk-Empfänger-Platten, die Faraday-Käfig, zur Unterbrechung der elektrischen Signale aus beliebigen Quellen installiert ist, einschließlich eines Computers, AC Linien und angrenzenden Empfänger zu vermeiden.
Hinweis: Finden Sie das Handbuch des Herstellers. Vorsicht ist geboten, um blinde Flecken zu vermeiden. - Aufzeichnung der elektrischen Aktivität mit dem Wireless-Video-EEG Telemetriesystem.
- Öffnen Sie die Software für Video-EEG-Aufzeichnung. Klicken Sie auf "Hardware" und wählen Sie "Konfiguration bearbeiten". Passen Sie den Empfänger und der Sender in jede Maus implantiert. Klicken Sie auf "Channel-Konfiguration" und bestätigen Sie, dass alle Kanäle aktiv sind. Klicken Sie auf "Video-Konfiguration", das Video mit der EEG-Daten (Auflösung von 40 x 480 und Frame-Rate von 30,00) zu synchronisieren.
Hinweis: Installieren Sie eine IP-Kamera mit hoher Empfindlichkeit, wenn es ist entscheidend für gute Bildqualitäten zu sammeln, die subtile Verhaltensänderungen der Mäuse nachts identifizieren können. - Klicken Sie auf "Setup" und "P3 Setup" zu einzelnen Tier Eingangsinformationen, abgestimmte Kamera und Grafik-Einstellung.
- Klicken Sie "Erwerb" und "A/D-Abtastrate" Setup Sampling-raten. Klicken Sie auf "Datasetname", jedes Experiment zu benennen.
Hinweis: Sampling-Rate für EEG muss höher als 500 Hz. aufgrund der großen Video und EEG-Datengröße, es wird empfohlen, dass nur 24 h Daten pro Sitzung behandelt werden anstatt mit einer 2-Woche-Daueraufzeichnung als eine Datei. Daten können separat in 8 h oder 12 h Abständen bei Mangel an RAM Arbeitsspeicher gespeichert werden. - Den Sender mit einer magnetischen Bar zu aktivieren und klicken Sie auf "Start Übernahme" die Video-EEG-Aufzeichnung zu sammeln. Kontinuierliche Überwachung der Maus durch Video-EEG-System für mindestens 2 Wochen.
Hinweis: Bei C57BL/6 Mäusen tendenziell SRS in Clustern auftreten, dass zuletzt etwa 5,2 Tage und die Dauer der anfallsfrei ca. 6,7 Tage17ist.
- Öffnen Sie die Software für Video-EEG-Aufzeichnung. Klicken Sie auf "Hardware" und wählen Sie "Konfiguration bearbeiten". Passen Sie den Empfänger und der Sender in jede Maus implantiert. Klicken Sie auf "Channel-Konfiguration" und bestätigen Sie, dass alle Kanäle aktiv sind. Klicken Sie auf "Video-Konfiguration", das Video mit der EEG-Daten (Auflösung von 40 x 480 und Frame-Rate von 30,00) zu synchronisieren.
- Bestimmen Sie die Beschlagnahme Häufigkeit und Dauer durch manuelle Inspektion mit der Analysesoftware.
- Markieren Sie den Bereich mit SRS und exportieren Sie die Daten für die statistische Analyse. Seien Sie vorsichtig, EEG Artefakte auszuschließen, die durch den Kopf kratzen oder kauen generiert werden können; Diese können entfernt werden, indem Sie überprüfen die Videodaten.
Hinweis: SRS ist definiert als ein plötzliches Auftreten von sich wiederholenden epileptiformen Aktivität Spick (≥ 3 Hz), die weiterhin für mehr als 10 S. krampfhafte Verhalten häufig mit einem Stoß von Spick Aktivität einhergehen können. Non-krampfhafte Anfälle können auch leitfähige spiking Aktivitäten ohne krampfhaft Verhaltensweisen zeigen. Beschlagnahme Kündigung ist definiert als auftritt, wenn die Zündung Spikes zu Grundlinie Aktivität zurückkehren. - Teilen Sie für die Analyse der Beschlagnahme Frequenz die Gesamtzahl der SRS-Fälle, die während der 2 Wochen durch die Gesamtzahl der Aufnahme Tage für jedes einzelne Tier erkannt.
- Messen Sie für die Analyse der Dauer der Beschlagnahme die Zeit vom Beginn bis zum Ende der epileptiformen Spick Aktivitäten.
- Markieren Sie den Bereich mit SRS und exportieren Sie die Daten für die statistische Analyse. Seien Sie vorsichtig, EEG Artefakte auszuschließen, die durch den Kopf kratzen oder kauen generiert werden können; Diese können entfernt werden, indem Sie überprüfen die Videodaten.
- Befestigen Sie nach Abschluss der Video-EEG-Aufzeichnung das Gehirn mit 4 % Paraformaldehyd durch Transcardial Perfusion. Um die Maus zu betäuben, Einspritzen einer Lösung (4:0.5) von Ketamin (50 mg/mL) und Xylazin (23,3 mg/mL) aufgelöst in Kochsalzlösung in einer Dosis von 10 μl/g Körpergewicht (1 mL Spritze, i.p.; 26 G-Nadel). Sobald die Maus bestätigt wurde, dass tief betäubt werden, führen Sie Transcardial Perfusion.
- Bevor das Gehirn der Maus zu isolieren, Abrufen des Senders von der Maus für die Wiederverwendung nach der Reinigung.
- Entfernen Sie die dental Zement um die Leitungen mit Pinzette.
- Einweichen Sie die Spitze der führt mit dental Zement in 100 % Aceton, bis die dental Zement aufgelöst ist.
- Entfernen Sie Gewebe Verunreinigungen vom Sender durch mit destilliertem Wasser spülen.
- Spülen Sie den Sender mit 70 % igem Ethanol für 3 h und Luft trocknen für die Lagerung. Unmittelbar vor dem nächsten Gebrauch spülen Sie die Schraube und die Sender mit 70 % Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser, und legen Sie sie in Kochsalzlösung.
Hinweis: Vorsicht ist geboten, um zu vermeiden, die flexible Drähte zu schneiden, wenn die Maus seit, enthaupten, wenn die flexible Leitungen zu kurz sind, der Lärm in den nächsten Implantation und Video-EEG-Aufzeichnung erhöhen kann.
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Representative Results
Erfolgreiche SE kann induzieren hippocampal Zelltod und SRS (Abbildung 1 und Abbildung 2). Wir Verhaltensstörungen akute Anfälle von Diazepam Injektion um 3 Uhr nach SE Beginn gekündigt und die Mäuse 7 Tage oder 6 Wochen später geopfert.
Für Video-EEG-monitoring, die Mäuse erhalten Implantatchirurgie 4 Wochen nach SE und SRS Fälle waren für 2 Wochen ab ca. 5-7 Wochen nach SE Beginn ausgewertet.
Abbildung 1 zeigt Zelle Todesfälle im Hippocampus von Cresyl violette Färbung bewertet. 7 Tage nach SE wurden pyknotischen Zellen in den hilar Regionen (Abbildung 1n. Chr.) von den dentate Gyrus und die pyramidale Zellschicht der CA3 Teilfeld des Hippocampus (Abbildung 1Af), erkannt, während intakte Hippocampus beobachtet wurde in der Sham-Tiere injiziert mit Kochsalzlösung statt Pilocarpin (Abbildung 1-Aa-c). Interessanterweise, Tiere, die mehrere Anfälle, unterzog sich aber nicht zu geben SE, zeigte keine Zelltod in der hilar Region oder pyramidale Zellschicht (Abbildung 1Ag-i). 6 Wochen nach SE wurde eine deutliche Reduzierung der Anzahl der hilar Zellen (Abbildung 1Bm) beobachtet. Darüber hinaus neuronaler Verlust in die CA1 beobachtet wurde (Abbildung 1Mrd.) und CA3 (Abbildung 1Bo) Regionen.
Abbildung 2 zeigt die repräsentative EEG-Spuren in den Schein und SE Gruppen (Abbildung 2A). Im Vergleich zu der Sham-Gruppe zeigt physiologischen elektrischen Aktivität, zeigte die SE Gruppe gelegentlich epileptiformen Entladungen mit krampfhafter Verhaltensweisen begleitet. Die Standorte der epiduralen Elektroden sind in Abbildung 2Cdargestellt. Abbildung 2 B zeigt ein Beispiel für die elektrische Geräusche aus einem angrenzenden Monitor und das Scheitern des Signal-Sammlung. Wir zeigten auch EEG Spuren von Sham manipuliert Tiere, die spontanen Anfälle in den 2 Wochen der Video-EEG-Aufzeichnung (Abb. 2E) zeigte und kortikale Verletzungen an Durchblutung, möglicherweise abgeleitet aus der übermäßig Tiefe Platzierung gefunden die epidurale Schrauben (Abb. 2D).
Abbildung 1 : Neuronalen Tod im Hippocampus nach Pilocarpin induzierten SE. Repräsentative Bilder aus den Gruppen (A) 7 Tage und (B) 6 Wochen nach der Injektion von Pilocarpin oder Kochsalzlösung. Vergrößerte Bilder zeigen den Hilus (a, j), CA1 Unterfeld (b, k), und CA3 Unterfeld (c, l) Kochsalzlösung behandelt Sham-Gruppe, der Hilus (d, m), CA1 Unterfeld (e, n) , und die CA3 Unterfeld (f, o) der SE Gruppe und den Hilus (g), CA1 Unterfeld (h) und CA3 Unterfeld (ich) die Mäuse, die nicht SE. Black Pfeile in einem, gund j entwickeln einige der repräsentativen hilar Zellen zeigen, und Pfeilspitzen in d und m zeigen pyknotischen Zellen. Maßstab in der unteren linken Seite = 200 µm, gültig für die gesamte verließen die meisten Spalte, Maßstabsleiste in a und C = 20 µm, gültig für den gesamten mittleren Spalte und Rechte Spalte. Abkürzungen in dieser Abbildung: CA1, CA3: Cornu Ammonis hippocampal Unterfelder; DG: Dentate Gyrus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Video und EEG-Aufzeichnung zeigt spontane wiederkehrende Anfälle in der epileptischen Maus. (A) repräsentative EEG Spuren von Schein-(oben) und SE-manipulierte Tiere (unten). Beachten Sie, dass SE ausgesetzt Tiere epileptiformen Spick Aktivität zeigen (≥ 3 Hz), nicht ausgestellten Schein Tiere. (B) ein repräsentatives Bild der elektrische Geräusche und des Versagens der Signal-Sammlung. Beachten Sie die hohe Amplitude unipolaren Spikes und Absetzen von elektrischen Signalen. (C) schematische Zeichnung des Mäusegehirns mit Standorten der Elektroden. (D) zwei Bilder zeigen das intakte und verletzte Gehirn im Kortex, möglicherweise aufgrund übermäßig tief Einfügung von epiduralen Schrauben. Der schwarze Pfeil im rechten Bild gibt die Site der kortikalen Beschädigung. Maßstabsleiste = 250 µm. (E) repräsentative EEG Spuren von Sham manipuliert Tiere mit oder ohne-Hirn-Trauma. Beachten Sie, dass Schein manipuliert Tiere mit kortikalen Verletzung spiking Aktivität und krampfhafte SRS generiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt die experimentellen Verfahren für die SE Induktion und Bewertung von chronischen Anfällen.
Mehrere Faktoren können erfolgreiche SE Induktion beeinflussen. Präzise Verhaltensstörungen Überwachung gemäß der Racine-Skala ist entscheidend für die Entwicklung der GA-OP. Kopf nicken, zeichnen Vordergliedmaße Klonus, Aufzucht, und fallen Verhaltens von akuten Anfällen zu SE Phase4,16zu entwickeln. Sobald der erste motor Anfall erkannt wird, verringert sich die Länge des Intervalls zwischen den später krampfhafte Anfälle vor dem Eintritt in SE. Darüber hinaus sollten SE mindestens 6 Stunden aufrecht erhalten werden, wenn Verhaltens Anfälle von Diazepam5gekündigt werden. Es ist erwähnenswert, dass Forscher die Möglichkeit bewusst sein sollten, die nachhaltig Beschlagnahme, die Aktivitäten über Electrocorticograms, erkannt werden können, obwohl Verhaltens Anfälle scheinen mit Diazepam Injektion nachlassen. Erhöhung der Umgebungstemperatur nach Pilocarpin Injektion bis SE Induktion die Zahl der Tiere mit SE erheblich verbessern kann. Es ist auch wichtig, intensiv nach dem Anfall, einschließlich ausreichender Flüssigkeitszufuhr, Ernährungsunterstützung und Gewicht Überwachung für höhere Überlebensraten als etwa 70-80 % im Durchschnitt5,18zu versorgen. Je nach genetischen Hintergrund des Tieres kann die Anfälligkeit für Pilocarpin abweichen. Wenn Tiere schwere akute Anfälle mit hoher Sterblichkeit anzeigen, kann die Reduzierung von Pilocarpin Dosierung, SE Dauer oder erhöhte Scopolamin und Terbutalin hilfreich sein. Während schwere SE bekannt ist, im Zusammenhang mit höheren Inzidenz der GA-OP, mit einer höheren Mortalität ist es entscheidend, diese Faktoren berücksichtigen. Hippocampal neuronalen Tod sind konsequent nach SE beobachtet. Bei 6 h Post-SE wurde umfangreichen Verlust des hilar Interneuronen gemeldeten19. 7 Tage nach SE pyramidale Neuronen im Unterfeld CA3 in der Regel sterben, und sind 6 Wochen nach SE Induktion, kontinuierlich beobachtet, obwohl das Ausmaß der neuronalen Schäden in der pyramidenförmigen Zellschicht Variable bei Mäusen ist. Neuronaler Verlust im Unterfeld CA1 des Hippocampus kann auch häufig beobachtet werden. Interessant ist, Tiere mit mehreren Anfällen, die keine eingeben SE zeigte fast intakt Hippocampus ähnlich der Sham-Gruppe anzeigt histologische Zelltod kann ein guter Marker für hinreichend schwere akute Anfälle sein.
Ca. 4 Wochen nach SE alle Pilocarpin behandelt C57BL/6NHsd Mäuse wurden epileptische und zeigte SRS, zeigt eines der größten Verdienste unter Verwendung dieses Modells. Da chronische Anfälle gruppiert sind, sollte das Video-EEG kontinuierlich für mindestens 2 Wochen, anstatt nur mit Unterbrechungen, aufgezeichnet werden, obwohl die Aufzeichnungsdauer abhängig von der Maus-Stämmen oder Versuchszwecken17geändert werden kann. Darüber hinaus haben spontane Anfälle bei TLE tagaktive Variationen zeigen hohe SRS-Frequenz in den späten Nachmittag20. Praktisch, für genaue Video-EEG-Aufzeichnung, keine Quellen, einschließlich AC Linien, Computer, Kameras oder Sender implantiert in der Maus in den angrenzenden Empfänger müssen blockiert werden. Die Installation der Faraday-Käfig und Kameras mit hoher Empfindlichkeit bei Tag und Nacht kann elektrische Störungen vermindern und Hilfe zu identifizieren generalisierte chronische Anfälle, beziehungsweise. Zu guter Letzt ist es extrem wichtig, Hirnschäden zu vermeiden, wenn die Schrauben auf der Oberfläche der Dura Mater platziert werden, da es irreführende EEG-Daten zu generieren. Obwohl die SRS-Frequenz nicht hoch war, konnte keine mechanischen kortikalen Verletzungen durch erzwungene Schraube einschieben krampfhafte Anfälle in nur einer Woche generieren.
Zusammenfassend ist trotz der Zeit, die Einschränkungen für die Modellierung und das Erfordernis der eingehende Schulung durchführen-Operationen und EEG-Analyse Implantat, die Pilocarpin-induzierte SE eines der besten Modelle zur Erforschung chronischer Epilepsie unter den derzeit verfügbaren Tier Modelle der TLE. Hier beschreiben wir eine Methode der induzierende SE nach Pilocarpin Injektion und Beurteilung chronischer Anfälle mit einem drahtlosen Telemetrie-Video-EEG-System. Wir glauben, dass dieses Protokoll geeigneten Tiermodellen für chronische Epilepsie und Epileptogenesis detailliert informieren kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss finanziert von der koreanischen Regierung (NRF-2014R1A1A3049456) und einen Zuschuss aus den Korea Health Technology R & D Project durch Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, gefördert durch das Ministerium für Gesundheit & Wohlbefinden, Republik Korea (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
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