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चूहों में Radiotelemetry प्रणाली का उपयोग करते हुए लौकिक पालि मिर्गी और ईईजी निगरानी के Pilocarpine मॉडल

Published: February 27, 2018 doi: 10.3791/56831
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology, Catholic Neuroscience Institute, College of Medicine, The Catholic University of Korea

Summary

इस पांडुलिपि प्रणालीगत pilocarpine इंजेक्शन और एक वायरलेस टेलीमेट्री वीडियो और इलॅक्ट्रोसेफेलॉग्राम प्रणाली का उपयोग कर जीवित पशुओं में सहज आवर्तक बरामदगी की निगरानी के द्वारा स्थिति एपिलेप्टिकस उत्प्रेरण की एक विधि का वर्णन करता है । इस प्रोटोकॉल पुरानी मिर्गी, epileptogenesis, और तीव्र बरामदगी के pathophysiologic तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

Abstract

लौकिक पालि मिर्गी (TLE) वयस्कता में एक आम स्नायविक विकार है । क्रोनिक मिर्गी के शोधों के अध्ययन के लिए, pilocarpine-प्रेरित स्थिति एपिलेप्टिकस (एसई) अक्सर दोहराऊंगा सहज आवर्तक बरामदगी (एसआरएस) के लिए चुना जाता है । यहाँ हम एक वायरलेस टेलीमेट्री वीडियो और इलॅक्ट्रोसेफेलॉग्राम (ईईजी) प्रणाली का उपयोग कर रहते जानवरों में पुरानी आवर्ती बरामदगी की pilocarpine और निगरानी के intraperitoneal (आईएफसआई) इंजेक्शन द्वारा एसई प्रेरण के एक प्रोटोकॉल मौजूद. हम उल्लेखनीय व्यवहार परिवर्तन है कि pilocarpine इंजेक्शन और 7 दिन और 6 सप्ताह के बाद pilocarpine हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन हानि के साथ उनके संबंध के बाद ध्यान देने की जरूरत का प्रदर्शन किया । हम भी वीडियो और ईईजी रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड आरोपण के प्रायोगिक प्रक्रियाओं का वर्णन है, और आवृत्ति और पुरानी आवर्तक बरामदगी की अवधि का विश्लेषण. अंत में, हम संभावित कारणों की चर्चा क्यों प्रत्येक मामले में अपेक्षित परिणाम प्राप्त नहीं कर रहे हैं । यह चूहों और समस्या निवारण के लिए दिशानिर्देश में पुरानी मिर्गी मॉडलिंग का एक बुनियादी सिंहावलोकन प्रदान करता है । हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल क्रोनिक मिर्गी और epileptogenesis के उपयुक्त मॉडलों के लिए एक आधार रेखा के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

Introduction

TLE एक सबसे आम का अधिग्रहण किया है epilepsies1। मिर्गी के साथ लोगों को मस्तिष्क में असामान्य ंयूरॉन गतिविधियों का एक परिणाम के रूप में आवर्तक बरामदगी का अनुभव2,3. यह देखते हुए कि TLE अक्सर असभ्य है, यह मिर्गी के विकास के अंतर्निहित बुनियादी तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है ।

पशु मॉडल है कि मानव TLE की प्रमुख विशेषताओं दोहराऊंगा कर सकते है TLE pathophysiology की बेहतर सराहना की पेशकश कर सकते हैं, हमें आसानी से निगरानी और epileptogenesis में महत्वपूर्ण कारकों में हेरफेर करने की अनुमति । उनमें से, chemoconvulsants प्रेरित एसई व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है4,5। ऐसे विद्युत उत्तेजना जो कोई हिप्पोकैम्पस स्केलेरोसिस और मजबूत एसआरएस6,7,8, chemoconvulsants के प्रणालीगत इंजेक्शन से पता चलता है के रूप में अंय मिर्गी मॉडल, विपरीत मानव TLE के नैदानिक रोगजनन नकल कर सकते हैं, यानी, प्रारंभिक मस्तिष्क की चोट, एक अव्यक्त अवधि, और एक पुरानी मिरगी चरण एसआरएस5,9,10प्रकट । इसलिए, इस तकनीक को विभिंन अध्ययनों में उपयोग किया जा सकता है तीव्र मस्तिष्क क्षति, epileptogenesis, या जब्ती दमन के तंत्र समझा । इसके अलावा, histopathological परिवर्तन chemoconvulsants द्वारा प्रेरित मानव TLE में देखा उन लोगों के लिए समान हैं, TLE कुतर मॉडल के उपयोग के लिए एक अतिरिक्त तर्क प्रदान10,11,12। विशेष रूप से, संरचनात्मक हिप्पोकैम्पस शामिल नुकसान लगातार दोनों kainic एसिड में reproduced किया गया है-और pilocarpine-प्रेरित एसई मॉडल । हालांकि, kainic एसिड इंजेक्शन की तुलना में, pilocarpine मॉडल चूहों में अधिक मजबूत एसआरएस का उत्पादन कर सकते हैं, जो ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की व्यापक उपलब्धता पर विचार करते समय पुरानी मिर्गी का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर लाभ की पेशकश कर सकते हैं, 13 , 14 , 15. इसके अलावा, जब्ती प्रगति pilocarpine इंजेक्शन के बाद आम तौर पर kainic एसिड मॉडल की तुलना में तेजी से है, मिर्गी के एक pilocarpine मॉडल के प्रभावी उपयोग के लिए अतिरिक्त सबूत प्रदान.

यहां, हम pilocarpine के आईएफसआई इंजेक्शन से और क्रोनिक मिर्गी में वीडियो और ईईजी निगरानी प्रदर्शन से एसई उत्प्रेरण की एक विधि का प्रदर्शन ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को कोरिया के कैथोलिक विश्वविद्यालय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ अनुसार किया गया (NIH प्रकाशन No. 80-23) ।

1. एसई प्रेरण

  1. खरीद 8 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6NHsd चूहों और प्रत्येक माउस वजन । फिर, एसई प्रेरण के दौरान उनकी आसान पहचान के लिए सभी चूहों की पूंछ को चिह्नित करने के लिए एक मार्कर पेन का उपयोग करें ।
  2. scopolamine मिथाइल ब्रोमाइड की मात्रा की गणना (scopolamine; 2 मिलीग्राम/किग्रा), terbutaline hemisulfate (terbutaline; 2 mg/किग्रा), और pilocarpine हाइडरोक्लॉराइड (pilocarpine; २८० मिलीग्राम/माउस के वजन पर आधारित और खारा जोड़ें (०.९% NaCl, 10 मिलीलीटर/
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि माउस का भार 25 ग्राम है, तो निंन राशियां लागू की जाती हैं: Scopolamine और terbutaline: 2 mg/किलो * (25 ग्राम/1000 ग्राम) = ०.०५ मिलीग्राम, खारा: 10 मिलीलीटर/* (25 ग्राम/1000 ग्राम) = ०.२५ मिलीलीटर, Pilocarpine: २८० mg/* (25 ग्राम/1000 ग्राम) = 7 मिलीग्राम , खारा: 10 मिलीलीटर/* (25 ग्राम/1000 ग्राम) = ०.२५ मिलीलीटर ।
  3. एक 30 ग्राम सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में scopolamine और terbutaline मिश्रण लोड । प्रत्येक माउस में समाधान intraperitoneally सुई, और फिर उनके पिंजरों को चूहों वापस । scopolamine और terbutaline प्रशासन के बाद 30 मिनट में, प्रत्येक माउस (आईएफसआई; 1 एमएल सिरिंज; 30 ग्राम सुई) में pilocarpine समाधान इंजेक्षन । pilocarpine इंजेक्शन के तुरंत बाद, एक मशीन में चूहों (28-30 डिग्री सेल्सियस) अवलोकन के लिए जगह है ।
  4. ध्यान से चूहों के व्यवहार की निगरानी जब तक एसई प्रेरित है । यदि पैरों की मोटर बरामदगी कि चरण 3 या उच्चतर के अनुसार है रेसिन पैमाने का पता चला रहे हैं, रिकॉर्ड समय और चूहों की निगरानी निर्धारित करने के लिए कि बरामदगी अधिक बार होते हैं । एक बार लगातार मोटर बरामदगी से अधिक पिछले 2 मिनट, कमरे के तापमान पर एक नए पिंजरे में माउस जगह और 3 के लिए निगरानी रखने के लिए निर्धारित है कि उनके ऐंठन बरामदगी जारी है और एसई प्रेरित है । Euthanize चूहों कि pilocarpine इंजेक्शन के बाद लगभग 2 एच में एसई दर्ज करने में विफल रहा है ।
    नोट: रेसिन का पैमाना; चरण 1, मुंह और चेहरे आंदोलन; स्टेज 2, सिर हिला; स्टेज ३, forelimb clonus; स्टेज ४, forelimb clonus साथ पाहिजे; चरण 5, पालन और forelimb clonus के साथ गिरने16। यदि माउस तुरंत एसई प्रेरण के बाद कमरे के तापमान पर पिंजरे में स्थानांतरित नहीं है, माउस अतिताप के कारण मर सकता है ।
  5. डायजेपाम समाधान इंजेक्शन द्वारा एसई शुरुआत के बाद 3 ज पर व्यवहार तीव्र बरामदगी समाप्त (आईएफसआई; 10 मिलीग्राम/1 मिलीलीटर सिरिंज; 30 ग्राम सुई) । कमजोर द्वारा डायजेपाम समाधान बनाओ 5 मिलीग्राम/एमएल डायजेपाम के 10% polyoxyl ३५ हाइड्रोजनीकृत अरंडी के तेल में खारा जोड़कर (आईएफसआई; 10 मिलीलीटर/; 1 मिलीलीटर सिरिंज; 30 ग्राम सुई) ।
    नोट: 10% polyoxyl ३५ हाइड्रोजनीकृत अरंडी के तेल समाधान: 1 मिलीलीटर polyoxyl ३५ हाइड्रोजनीकृत केस्टर तेल समाधान + 9 मिलीलीटर खारा । कमरे के तापमान पर समाधान की दुकान । उदाहरण के लिए, यदि माउस शरीर के वजन 25 ग्राम है, सुई २५० µ l के डायजेपाम समाधान: ५० µ l 5 mg/मब डायजेपाम + २०० µ l 10% polyoxyl ३५ हाइड्रोजनीकृत अरंडी तेल समाधान = २५० µ l 1 mg/एमएल डायजेपाम.
  6. अन्तर्वासना चूहों के लिए, scopolamine मिथाइल ब्रोमाइड का एक आईएफसआई इंजेक्शन निष्पादित करें और terbutaline hemisulfate मिश्रण (आईएफसआई; दोनों 2 मिलीग्राम/किलो, 10 मिलीलीटर/; 1 एमएल सिरिंज; 30 ग्राम सुई) । 30 मिनट बाद, खारा intraperitoneally इंजेक्षन (आईएफसआई; 10 मिलीलीटर/; 1 एमएल सिरिंज; 30 ग्राम सुई) ।
    नोट: यदि माउस शरीर का वजन 25 ग्राम है, तो pilocarpine के बजाय खारा के २५० µ l इंजेक्षन करें ।
  7. डायजेपाम इंजेक्शन के बाद (आईएफसआई; 1 एमएल सिरिंज; 30 ग्राम सुई), प्रति व्यक्ति माउस 5% डेक्सट्रोज की 1 मिलीलीटर (आईएफसआई; 1 एमएल सिरिंज; 26 ग्राम सुई) ।
    नोट: 5% डेक्सट्रोज इंजेक्शन की 1 मिलीलीटर ऊर्जा स्रोत और जलयोजन कि जीवित रहने की दर में वृद्धि कर सकते है प्रदान करता है ।
  8. मशीन (28-30 डिग्री सेल्सियस) में पोस्ट-देखभाल के दौरान, लार, आँसू, और मल जैसे अत्यधिक स्राव मिटा ।
  9. 1 दिन के बाद एसई प्रेरण, चूहों वजन और उंहें मशीन में रखने के लिए (28-30 ° c) एक अतिरिक्त दिन के लिए । 2 दिन में, एसई प्रेरण के बाद, चूहों वजन और उनके घर पिंजरे में वापस । नम चाउ प्रदान करने के लिए उनकी वसूली की सुविधा ।
    नोट: इस प्रयोग में, C57BL/6NHsd के लिए मृत्यु दर एसई समाप्ति के बाद औसत पर ८.५७% (३५ चूहों का परीक्षण किया गया से बाहर 3) था ।
  10. 7 दिनों के बाद pilocarpine और 5% डेक्सट्रोज (आईएफसआई; 1 मिलीलीटर सिरिंज; 26 ग्राम सुई) के साथ चूहों सुई जब तक जानवरों के दैनिक शरीर के वजन को मापने जब शरीर का वजन नहीं बढ़ा है । बंद करो शरीर के वजन की निगरानी जब चूहों शरीर के वजन हासिल करने के लिए शुरू और pilocarpine इंजेक्शन के बाद 2 दिनों में कठिनाई के बिना नम चाउ भस्म ।
    नोट: अगर एक माउस के शरीर के वजन में वृद्धि नहीं हुई 7 दिनों तक पोस्ट एसई, प्रयोग और कार्बन डाइऑक्साइड द्वारा euthanize से माउस को छोड़ दें । माउस की पृष्ठभूमि पर निर्भर करता है, मौत कभी भी हो सकती है; हालांकि, C57BL/6NHsd के मामले में, इन प्रयोगों में चूहों की 1% से कम मृत्यु हुई । एसई प्रेरण के बाद 7 से अधिक दिनों के अस्तित्व के साथ, चूहों शायद ही कभी अव्यक्त अवधि के दौरान मर जाते हैं ।

2. वीडियो-ईईजी मॉनिटरिंग के लिए प्रत्यारोपण सर्जरी

  1. तैयार 12 सप्ताह पुराने चूहों (एसई प्रेरण के बाद 4 सप्ताह) ईईजी निगरानी के लिए टेलीमेट्री आरोपण प्रदर्शन करने के लिए ।
    नोट: आरोपण के समय प्रयोगात्मक प्रयोजनों और माउस उपभेदों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है ।
  2. सर्जरी से पहले, एक मिश्रण के साथ माउस anesthetize (4:0.5) ketamine के (५० मिलीग्राम/एमएल) और xylazine (२३.३ मिलीग्राम/एमएल) के घोल में खारा में भंग की एक खुराक पर २.५ µ l/जी शरीर के वजन (आईएफसआई; 1 एमएल सिरिंज; 26 ग्राम सुई) । नियमित अंतराल (15 मिनट अधिकतम अंतराल) पर श्वसन दर और माउस के श्वसन प्रयास की निगरानी और पेडल वापसी पलटा द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन.
  3. कान सलाखों और एक काटने की थाली के साथ एक stereotaxic फ्रेम में माउस प्लेस और अंधापन से बचने के लिए दोनों आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू होते हैं ।
  4. शल्य चिकित्सा के दौरान बाँझ शर्तों को बनाए रखने के लिए, सर्जिकल एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर साइटों दाढ़ी । शल्य क्षेत्र के फर संदूषण को रोकने के लिए सावधान रहें । हजामत बनाने के बाद, ७०% इथेनॉल और आयोडीन समाधान के साथ त्वचा को संक्रमित ।
    नोट: शल्य चिकित्सा एक अपूतित बाँझ दस्ताने और मास्क पहने हुए तरीके से किया जाना चाहिए, निष्फल उपकरण और अपूतित तकनीकों का उपयोग कर ।
  5. संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करने के बाद, खोपड़ी बेनकाब करने के लिए त्वचा का एक midline चीरा बनाते हैं । anteroposterior अक्ष (एपी) में Bregma से निर्देशांक पर stereotaxic तंत्र से जुड़ी एक ड्रिल के साथ दो गड़गड़ाहट छेद बनाओ: + ०.१ मिमी, mediolateral अक्ष (एमएल): + ०.१ मिमी (संदर्भ), और एपी: − ०.२ मिमी, एमएल: + ०.२२ मिमी (बाएँ पार्श्विका प्रांतस्था)13.
    1. पंजाब से भीगे सूती स्वैप के साथ त्वचा को पोंछ, ७०% इथेनॉल और आयोडीन समाधान के बाद । कैंची के साथ सिर के बीच में एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाने के लिए लैंब्डा (बिंदु जहां sagittal और lambdoid टांका मिलने), Bregma टांका द्वारा sagittal (कोरोनरी टांका के प्रतिच्छेदन के बिंदु), और लक्ष्य स्थान का पर्दाफाश करने के लिए ।
    2. लैंब्डा और Bregma जैसे संरचनात्मक स्थलों की पहचान करें । Bregma पर ड्रिल बिट की स्थिति और ध्यान दें X, Y इस बिंदु के लिए निर्देशांक ।
    3. ईईजी रिकॉर्डिंग के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों के उपयुक्त निर्देशांक निर्धारित करने के लिए एक ब्रेन एटलस पुस्तकों या प्रकाशित संदर्भ का उपयोग करें. फिर, (संदर्भ और रिकॉर्डिंग) शिकंजा के लिए निर्देशांक की गणना Bregma का उपयोग कर 2.5.2 कदम पर मापा निर्देशांक.
    4. धीरे से ड्रिल बिट कम करने के लिए एक गड़गड़ाहट छेद करने के लिए बहुत दूर बिंदु पर जहां खोपड़ी पतली हो जाती है पर डालने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है ।
  6. गर्दन चमड़े के नीचे और जगह लचीले खोपड़ी के पास के डब के पीछे एक चैनल वायरलेस ईईजी ट्रांसमीटर के शरीर डालें ।
  7. चिमटी के साथ प्रत्येक गड़गड़ाहट छेद में एक स्टेनलेस स्टील स्क्रू (2 मिमी लंबाई) प्लेस और यह दक्षिणावर्त रोटेशन से एक पेंच चालक का उपयोग कर कस । सुनिश्चित करें कि पेंच बहुत दूर पेंच रोटेशन की डिग्री का समायोजन करने के क्रम में बाडी या मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान को रोकने के द्वारा डाला नहीं है ।
  8. की ओर जाता है और तार और पेंच के बीच एक अच्छा कनेक्शन के लिए पेंच शाफ्ट गोल करने के लिए काफी लंबे समय तक वायर खिंचाव की नोक से इंसुलेशन कोट 2 मिमी पट्टी । सामने पेंच करने के लिए संदर्भ का नेतृत्व कनेक्ट और पार्श्विका प्रांतस्था में पेंच करने के लिए रिकॉर्डिंग का नेतृत्व । फिर, दंत सीमेंट लागू करने के लिए जगह में धातु भागों को उजागर किए बिना पूरे विधानसभा सुरक्षित ।
  9. सत्यापित करने के बाद कि दंत सीमेंट पूरी तरह से दृश्य निरीक्षण द्वारा सूख गया है, त्वचा टांका और सामयिक mupirocin मरहम लागू होते हैं । एक 30 डिग्री सेल्सियस अकेले में माउस प्लेस जब तक यह सर्जरी से ठीक हो जाती है (के बारे में 30 मिनट) । फिर, जब तक लगातार वीडियो-ईईजी निगरानी शुरू होता है घर पिंजरे में माउस वापस ।
    नोट: सर्जरी के बाद, प्रत्येक माउस इंजेक्शन है (आईएफसआई; 1 मिलीलीटर सिरिंज; 30 ग्राम सुई) के साथ 5 मिलीग्राम/gentamicin (एंटीबायोटिक्स) और 5 मिलीग्राम/ketoprofen के किलो (एनाल्जेसिक) । जब तक वे पूरी तरह से ambulant बन जानवरों की निगरानी की जानी चाहिए । ट्रांसमीटर-प्रत्यारोपित चूहों लगभग 1 सप्ताह की एक वसूली की अवधि है ।

3. वीडियो और ईईजी निगरानी और विश्लेषण

  1. एक व्यक्ति पिंजरे में एक माउस प्लेस और वायरलेस रिसीवर प्लेटों के शीर्ष पर पिंजरे जहां फैराडे पिंजरे एक कंप्यूटर, एसी लाइनों, और आसंन रिसीवर सहित किसी भी स्रोतों से विद्युत संकेतों के व्यवधान से बचने के लिए स्थापित किया गया है जगह है ।
    नोट: निर्माता द्वारा उपलब्ध कराई गई पुस्तिका देखें । ब्लाइंड स्पॉट से बचने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए ।
  2. वायरलेस वीडियो-ईईजी टेलीमेट्री सिस्टम का उपयोग कर विद्युत गतिविधि रिकॉर्ड ।
    1. वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग के लिए सॉफ़्टवेयर खोलें । "हार्डवेयर" पर क्लिक करें और "संपादन विन्यास" चुनें. रिसीवर और प्रत्येक माउस में प्रत्यारोपित ट्रांसमीटर मैच । "चैनल विन्यास" पर क्लिक करें और सभी चैनलों को सक्रिय कर रहे हैं की पुष्टि. ईईजी डेटा (४० x ४८० का रिज़ॉल्यूशन और ३०.०० का फ़्रेम दर) के साथ वीडियो को सिंक्रनाइज़ करने के लिए "वीडियो कॉन्फ़िगरेशन" पर क्लिक करें.
      नोट: अगर यह अच्छी छवि गुण है कि रात में चूहों के सूक्ष्म व्यवहार परिवर्तन की पहचान कर सकते है इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है उच्च संवेदनशीलता के साथ एक आईपी कैमरा स्थापित करें ।
    2. व्यक्तिगत पशु जानकारी, मिलान कैमरा, और ग्राफ सेटिंग इनपुट करने के लिए "सेटअप" और "पी सी सेटअप" पर क्लिक करें.
    3. "अधिग्रहण" और "A/D नमूना दर" सेटअप नमूना दरों के लिए क्लिक करें । प्रत्येक प्रयोग को निर्दिष्ट करने के लिए "डेटा सेट नाम" क्लिक करें ।
      नोट: ईईजी के लिए नमूना दर ५०० हर्ट्ज से अधिक होने की जरूरत है. बड़े वीडियो और ईईजी डेटा आकार के कारण, यह अनुशंसित है कि डेटा के केवल 24 h को एक फ़ाइल के रूप में निरंतर 2-सप्ताह-रिकॉर्डिंग का उपयोग करने के बजाय प्रति सत्र प्रबंधित किया जाता है । डेटा को RAM स्मृति की कमी के मामले में 8 h या 12 h अंतराल पर अलग से सहेजा जा सकता है ।
    4. एक चुंबकीय बार के साथ ट्रांसमीटर को सक्रिय करें और वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग एकत्र करने के लिए "आरंभ अधिग्रहण" पर क्लिक करे । लगातार 2 सप्ताह के लिए वीडियो-ईईजी प्रणाली द्वारा माउस की निगरानी ।
      नोट: C57BL/6 चूहों के लिए, एसआरएस के लिए क्लस्टर में हो जाता है कि पिछले लगभग ५.२ दिनों और जब्ती की अवधि के मुक्त अवधि के बारे में ६.७ दिन17है ।
  3. मैनुअल निरीक्षण द्वारा जब्ती आवृत्ति और अवधि का निर्धारण विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग ।
    1. मार्क एसआरएस दिखा क्षेत्र और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात । ईईजी कलाकृतियों कि सिर scratching या चबाने से उत्पंन किया जा सकता है बाहर करने के लिए सतर्क रहें; ये वीडियो डेटा को चेक करके निकाला जा सकता है ।
      नोट: एसआरएस की एक अचानक शुरुआत के रूप में परिभाषित किया गया है दोहराए epileptiform spiking गतिविधि (≥ 3 हर्ट्ज) है कि 10 से अधिक एस ऐंठन व्यवहार के लिए बनी रहती है अक्सर spiking गतिविधि के एक फट के साथ हो सकता है । गैर ऐंठन बरामदगी भी ऐंठन व्यवहार के बिना electrographic spiking गतिविधियों को प्रदर्शित कर सकते हैं । जब्ती समाप्ति जब फायरिंग spikes आधार रेखा गतिविधि के लिए वापस आने वाली के रूप में परिभाषित किया गया है ।
    2. जब्ती आवृत्ति के विश्लेषण के लिए, प्रत्येक व्यक्ति जानवर के लिए रिकॉर्डिंग दिनों की कुल संख्या से 2 सप्ताह के दौरान पाया एसआरएस मामलों की कुल संख्या विभाजित ।
    3. जब्ती की अवधि के विश्लेषण के लिए, epileptiform spiking गतिविधियों के अंत करने के लिए शुरुआत से समय को मापने ।
  4. वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग के पूरा होने के बाद, transcardial छिड़काव द्वारा 4% paraformaldehyde के साथ मस्तिष्क को ठीक करें । anesthetize करने के लिए, एक समाधान सुई (4:0.5) ketamine का (५० मिलीग्राम/एमएल) और xylazine (२३.३ मिलीग्राम/एमएल) खारा में 10 μL/जी शरीर के वजन (आईएफसआई; 1 एमएल सिरिंज; 26 ग्राम सुई) की एक खुराक पर भंग । एक बार माउस को गहरा anesthetized होने की पुष्टि की है, transcardial छिड़काव प्रदर्शन करते हैं ।
  5. माउस मस्तिष्क को अलग करने से पहले, सफाई के बाद पुनः प्रयोग के लिए माउस से ट्रांसमीटर पुनः प्राप्त ।
    1. संदंश का उपयोग कर सुराग के आसपास दंत सीमेंट निकालें ।
    2. डेंटल सीमेंट को १००% एसीटोन में दन्त सीमेंट के साथ ले जाता है जब तक दंत चिकित्सा के लिए भंग कर दिया है ।
    3. यह आसुत जल के साथ कुल्ला द्वारा ट्रांसमीटर के आसपास ऊतक दूषित पदार्थों को निकालें ।
    4. 3 एच और हवा के लिए ७०% इथेनॉल के साथ ट्रांसमीटर कुल्ला यह भंडारण के लिए सूखी । तुरंत अगले प्रयोग करने से पहले, पेंच और ७०% इथेनॉल के साथ ट्रांसमीटर कुल्ला, आसुत जल के बाद, और उंहें खारा में जगह है ।
      नोट: जब से माउस decapitating लचीला तारों काटने से बचने के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए, अगर लचीला सुराग भी कम कर रहे हैं, अगले आरोपण में शोर और वीडियो ईईजी रिकॉर्डिंग में वृद्धि हो सकती है.

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Representative Results

सफल एसई हिप्पोकैम्पस सेल मौत और एसआरएस (चित्रा 1 और चित्रा 2) प्रेरित कर सकते हैं । हम एसई शुरुआत के बाद 3 एच में डायजेपाम इंजेक्शन द्वारा व्यवहार तीव्र बरामदगी समाप्त और चूहों 7 दिन या 6 सप्ताह बाद बलि ।

वीडियो-ईईजी निगरानी के लिए, चूहों 4 सप्ताह के बाद एसई में प्रत्यारोपण सर्जरी प्राप्त की, और एसआरएस मामलों से 2 सप्ताह के लिए मूल्यांकन किया गया 5-7 से एसई शुरुआत के बाद सप्ताह ।

चित्रा 1 cresyl वायलेट धुंधला द्वारा मूल्यांकन हिप्पोकैम्पस में सेल मौतों से पता चलता है । 7 दिनों के बाद एसई, pyknotic कोशिकाओं hilar क्षेत्रों में पाया गया (चित्रा 1विज्ञापन) के dentate गाइरस और CA3 के हिप्पोकैम्पस उपक्षेत्र के पिरामिडीय कोशिका परत (चित्रा 1वायुसेना), जबकि बरकरार हिप्पोकैम्पस मनाया गया था अन्तर्वासना के जानवरों में खारा के बजाय pilocarpine के इंजेक्शन (चित्रा १एए-सी). दिलचस्प है, जो पशु कई दौरे से गुजरा, लेकिन एसई दर्ज करने में विफल, या तो hilar क्षेत्र या पिरामिडीय सेल परत में कोई सेल मौत दिखाया (चित्रा 1एजी-मैं) । 6 सप्ताह के बाद एसई, एक चिह्नित कमी hilar कोशिकाओं की संख्या में देखा गया था (चित्रा 1बीएम) । इसके अलावा, CA1 (चित्रा 1बीएन) और CA3 (चित्रा 1बो) क्षेत्रों में ंयूरॉन नुकसान मनाया गया ।

चित्रा 2 , अन्तर्वासना और एसई समूहों में प्रतिनिधि ईईजी अंश (चित्रा 2ए) दिखाता है । शारीरिक विद्युत गतिविधि दिखा अन्तर्वासना समूह की तुलना में, एसई समूह कभी-कभार ऐंठन व्यवहार के साथ साथ epileptiform फर्ज दिखाया । एपीड्यूरल इलेक्ट्रोड के स्थान चित्रा 2सीमें सचित्र हैं. चित्र 2 B एक सन्निकट मॉनिटर और सिग्नल संग्रह की विफलता से बिजली के शोर का एक उदाहरण प्रदर्शित करता है । हम भी अन्तर्वासना के ईईजी निशान का प्रदर्शन किया-पशुओं में हेरफेर जो वीडियो के 2 सप्ताह के दौरान सहज बरामदगी दिखाया-ईईजी रिकॉर्डिंग (चित्रा 2ई) और छिड़काव पर cortical चोटों पाया, संभवतः जरूरत से ज्यादा गहरे स्थान से व्युत्पंन एपीड्यूरल शिकंजा (चित्रा 2डी) की ।

Figure 1
चित्र 1 : pilocarpine-प्रेरित एसई के बाद हिप्पोकैम्पस में ंयूरॉन मौत । के समूहों से प्रतिनिधि छवियां (एक) 7 दिन और (ख) 6 सप्ताह के बाद pilocarpine या खारा इंजेक्शन । बढ़ाया छवियां hilus (ए, जे) दिखाओ, CA1 उपक्षेत्र (b, k), और CA3 उपक्षेत्र (c, l) का खारा-इलाज शम समूह, द hilus (d, m), CA1 उपक्षेत्र (e, n) , और एसई समूह के CA3 उपक्षेत्र (एफ, ओ), और hilus (g), CA1 उपक्षेत्र (ज), और CA3 उपक्षेत्र (i) के चूहों का विकास नहीं होता है जो SE. a, g, और j में काले तीर कुछ प्रतिनिधि hilar कक्षों का संकेत देते हैं, और d और m में ऐरोहेड कक्षों का संकेत pyknotic । नीचे बाईं ओर में स्केल पट्टी = २०० µm, पूरे मध्य स्तंभ और दाएँ स्तंभ के लिए मान्य पूर्ण बाएँ अधिकांश स्तंभ, स्केल बार में एक और c = 20 µm, के लिए मान्य है । इस आंकड़े में संक्षिप्त: CA1, CA3: Cornu Ammonis हिप्पोकैम्पस उपक्षेत्र; DG: Dentate गाइरस. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : वीडियो और ईईजी रिकॉर्डिंग मिरगी माउस में सहज आवर्तक बरामदगी से पता चलता है. (एक) प्रतिनिधि ईईजी से (ऊपर) और एसई हेरफेर जानवरों (नीचे)-अन्तर्वासना से निशान । ध्यान दें कि एसई के अधीन जानवरों epileptiform spiking गतिविधि (≥ 3 हर्ट्ज) दिखा, नहीं अन्तर्वासना जानवरों द्वारा प्रदर्शित । (ख) विद्युत शोर और संकेत संग्रह की विफलता की एक प्रतिनिधि छवि । उच्च आयाम एकध्रुवीय spikes और विद्युत संकेतों के विच्छेदन ध्यान दें । (ग) इलेक्ट्रोड के स्थानों के साथ माउस मस्तिष्क की योजनाबद्ध ड्राइंग । (घ) दो छवियों प्रांतस्था में बरकरार है और घायल मस्तिष्क दिखा रहा है, संभवतः एपीड्यूरल शिकंजा की जरूरत से ज्यादा गहरी प्रविष्टि के कारण । सही छवि में काला तीर cortical क्षति की साइट को इंगित करता है । स्केल बार = २५० µm. (ई) के प्रतिनिधि ईईजी के निशान के साथ या मस्तिष्क चोट के बिना शर्म से छेड़छाड़ जानवरों । ध्यान दें कि cortical चोट के साथ शर्म से छेड़छाड़ जानवरों spiking गतिविधि और ऐंठन एसआरएस उत्पंन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह काम एसई प्रेरण और पुरानी बरामदगी के मूल्यांकन के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन ।

कई कारकों सफल एसई प्रेरण प्रभावित कर सकते हैं । रेसिन पैमाने के अनुसार सटीक व्यवहार निगरानी एसआरएस के विकास के लिए महत्वपूर्ण है । सिर हिला, forelimb clonus, पालन, और गिरने तीव्र बरामदगी के व्यवहार की पहचान एसई चरण4,16में विकसित कर रहे हैं । एक बार पहली मोटर जब्ती का पता चला है, बाद ऐंठन बरामदगी के बीच अंतराल की लंबाई एसई प्रवेश करने से पहले घट जाती है । इसके अलावा, एसई से कम 6 घंटे के लिए निरंतर किया जाना चाहिए जब तक व्यवहार बरामदगी डायजेपाम द्वारा समाप्त कर रहे है5। यह ध्यान देने योग्य बात है कि शोधकर्ताओं संभावना के बारे में पता होना चाहिए कि लगातार जब्ती गतिविधियों electrocorticograms के माध्यम से पता लगाया जा सकता है लायक है, भले ही व्यवहार बरामदगी डायजेपाम इंजेक्शन के साथ-साथ लग रहे हो । एसई प्रेरण बहुत एसई के साथ पशुओं की संख्या में सुधार कर सकते हैं जब तक pilocarpine इंजेक्शन के बाद परिवेश के तापमान में वृद्धि. यह भी गहन के बाद जब्ती देखभाल, पर्याप्त जलयोजन, पोषण का समर्थन सहित प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है, और वजन की निगरानी के बारे में 70-80% की तुलना में अधिक जीवित रहने की दर के लिए औसत5,18। जानवर की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर निर्भर करता है, pilocarpine को संवेदनशीलता अलग हो सकता है । यदि पशु उच्च मृत्यु दर के साथ गंभीर तीव्र बरामदगी प्रदर्शन, pilocarpine खुराक, एसई अवधि, या वृद्धि हुई scopolamine और terbutaline की कमी सहायक हो सकता है । जबकि गंभीर एसई एसआरएस के उच्च घटना से संबंधित होने के लिए जाना जाता है, उच्च मृत्यु दर के साथ, यह इन कारकों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन मौतों लगातार एसई के बाद मनाया जाता है । 6 एच के बाद एसई, hilar ंयूरॉंस की व्यापक नुकसान की सूचना दी गई है19। 7 दिनों के बाद एसई, CA3 उपक्षेत्र में पिरामिड न्यूरॉन्स आम तौर पर मर जाते हैं, और लगातार 6 सप्ताह में एसई प्रेरण के बाद मनाया जाता है, हालांकि पिरामिडीय कोशिका परत में ंयूरॉन क्षति की हद तक चूहों में चर रहा है । हिप्पोकैम्पस के CA1 उपक्षेत्र में ंयूरॉन हानि भी अक्सर मनाया जा सकता है । दिलचस्प है, कई दौरे जो एसई में प्रवेश नहीं कर के साथ जानवरों लगभग बरकरार हिप्पोकैम्पस अन्तर्वासना समूह के समान दिखाया गया है, histologic सेल मौत का संकेत पर्याप्त रूप से गंभीर तीव्र बरामदगी का एक अच्छा मार्कर हो सकता है ।

लगभग 4 सप्ताह के बाद एसई, सभी pilocarpine इलाज C57BL/6NHsd चूहों मिरगी बन गया और एसआरएस दिखाया, प्रमुख खूबियों में से एक का प्रदर्शन इस मॉडल का उपयोग कर । पुरानी बरामदगी के बाद से संकुल रहे हैं, वीडियो-ईईजी के बजाय आवर्तक रूप से कम 2 सप्ताह के लिए लगातार दर्ज किया जाना चाहिए, भले ही रिकॉर्डिंग अवधि माउस उपभेदों या प्रायोगिक प्रयोजनों17के आधार पर संशोधित किया जा सकता है । इसके अलावा, TLE में सहज बरामदगी प्रतिदिन देर से दोपहर में उच्च एसआरएस आवृत्ति का प्रदर्शन रूपांतरों है20। व्यावहारिक रूप से, सटीक वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग के लिए, एसी लाइनों, कंप्यूटर, कैमरा, या आसंन रिसीवर में माउस में प्रत्यारोपित ट्रांसमीटरों सहित किसी भी स्रोत को अवरुद्ध किया जाना चाहिए । फैराडे पिंजरे और दिन और रात के दौरान उच्च संवेदनशीलता के साथ कैमरों की स्थापना बिजली के शोर को कम करने और सामान्यीकृत पुरानी बरामदगी की पहचान करने में मदद कर सकते हैं, क्रमशः । अंत में, यह बेहद महत्वपूर्ण है मस्तिष्क क्षति से बचने के जब शिकंजा बाडी मेटर की सतह पर रखा जाता है के रूप में यह भ्रामक ईईजी डेटा उत्पंन कर सकते हैं । हालांकि एसआरएस आवृत्ति उच्च नहीं था, मजबूर पेंच प्रविष्टि द्वारा किसी भी यांत्रिक cortical चोटों केवल एक सप्ताह में ऐंठन बरामदगी उत्पंन कर सकता है ।

अंत में, मॉडलिंग के लिए समय की कमी और में की आवश्यकता के बावजूद गहराई से प्रशिक्षण प्रत्यारोपण सर्जरी और ईईजी विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, pilocarpine-प्रेरित एसई वर्तमान में उपलब्ध पशु के बीच पुरानी मिर्गी का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल में से एक है TLE के मॉडल । यहाँ, हम pilocarpine इंजेक्शन के बाद एसई उत्प्रेरण की एक विधि का वर्णन और एक वायरलेस टेलीमेट्री वीडियो-ईईजी प्रणाली का उपयोग कर पुरानी बरामदगी का आकलन. हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल क्रोनिक मिर्गी और epileptogenesis के लिए उपयुक्त पशु मॉडलों के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (KHIDI) के माध्यम से कोरियाई सरकार (एनआरएफ-2014R1A1A3049456) और कोरिया स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास परियोजना से अनुदान के रूप में वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) ने इस काम का समर्थन किया था, स्वास्थ्य एवं कल्याण मंत्रालय, कोरिया गणराज्य (HI15C2854) द्वारा वित्त पोषित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 Envigo C57BL/6NHsd
Scopolamine methyl nitrate Sigma S2250 Make 10X stock
Terbutaline hemisulfate salt Sigma T2528 Make 10X stock
Pilocarpine hydrochloride Sigma P6503
Ketamine hydrochloride Yuhan corporation
Xylazine hydrochloride Bayer Korea
Diazepam SAMJIN
Castor oil (Kolliphor EL) Sigma C5135 Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil
Saline Daihan pharm. Co.
5% Dextrose Daihan pharm. Co.
Iodine solution (Povidin) Firson
vet ointment (Terramycin) Pfizer
Blue Nylon AILEE NB617
Mupirocin (Bearoban) Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
Ketoprofen Samchundang Pharm. Co., Ltd 5 mg/kg
Gentamicin Huons, Ltd. 5 mg/kg
1 mL syringe Sung shim medial Co., Ltd.
26 guage needle Sung shim medial Co., Ltd. 26 G * 13 mm (1/2")
30 guage needle Sung shim medial Co., Ltd. 30 G * 13 mm (1/2")
Razor blade Dorco
Drill Saeshin precision Co., Ltd. 207A, 35K (speed)
Telemetry video/EEG system Data sciences International. Inc. Version 5.20-SP6
Implantable transmitter Data sciences International. Inc. ETA-F10
Screw Sungho Steel M1.4, 2 mm length stainless steel
Vertex dental material  Dentimex
Acetone Duksan pure chemicals Co., Ltd. CAS 67-64-1
Paraformaldehyde (PFA) millipore 1.04005.1000 4 % 
Sucrose Sigma S9378 30 % solution in 0.01 M PBS
Cresyl violet acetate Sigma C5042
Ethanol EMD Millipore Co. UN1170
xylene Duksan pure chemicals Co., Ltd. UN1307
Acetic acid glacial Junsei chemical 31010-0350
FSC33 Clear  Leica biosystems OCT compound for tissue freezing
DPX Mounting for histology Sigma 6522
Forceps Fine science tools 11002-12
Scissors Solco biomedical 02-2445
Stereotaxic frame David Kopf Instruments E51070012

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References

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तंत्रिका जीव विज्ञान अंक १३२ स्थिति एपिलेप्टिकस pilocarpine मिर्गी सहज आवर्तक बरामदगी इलॅक्ट्रोसेफेलॉग्राम हिप्पोकैम्पस लौकिक पालि मिर्गी चूहा
चूहों में Radiotelemetry प्रणाली का उपयोग करते हुए लौकिक पालि मिर्गी और ईईजी निगरानी के Pilocarpine मॉडल
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Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. J. Vis. Exp. (132), e56831, doi:10.3791/56831 (2018).

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