Summary
Este manuscrito descreve um método de induzir o estado de mal epiléptico por injeção de pilocarpina sistêmica e de monitorização espontâneas convulsões recorrentes em animais vivos, usando um sistema de eletroencefalograma e vídeo sem fio telemetria. Este protocolo pode ser utilizado para estudar os mecanismos fisiopatológicas da epilepsia crônica, epileptogenesis e convulsões agudas.
Abstract
Epilepsia do lobo temporal (TLE) é uma desordem neurológica comum na idade adulta. Para estudos translacionais de epilepsia crônica, induzidas pela pilocarpina estado epiléptico (SE) frequentemente é selecionado para recapitular espontâneas convulsões recorrentes (SRS). Aqui nós apresentamos um protocolo de indução SE por injeção intraperitoneal (i.p.) de pilocarpina e monitoramento de convulsões recorrentes crônicas em animais vivos, usando um sistema de eletroencefalograma (EEG) e vídeo sem fio telemetria. Demonstrámos notáveis mudanças comportamentais que necessitam de atenção após a injeção de pilocarpina e sua correlação com a perda neuronal hippocampal em 7 dias e pós-pilocarpina 6 semanas. Também descrevemos os procedimentos experimentais de implantação de eletrodo para vídeo e gravação de EEG e análise da frequência e duração das convulsões recorrentes crônicas. Finalmente, podemos discutir as possíveis razões por que os resultados esperados não são alcançados em cada caso. Isto fornece uma visão geral básica de epilepsia crônica em ratos e diretrizes para solução de problemas de modelagem. Acreditamos que este protocolo pode servir como uma base para modelos apropriados de epilepsia crônica e epileptogenesis.
Introduction
TLE é um do mais comum adquirida Epilepsias1. Pessoas com epilepsia sofrer ataques recorrentes, como resultado de actividades neuronais anormais no cérebro2,3. Dado que o TLE é muitas vezes intratável, é crucial entender os mecanismos básicos subjacentes ao desenvolvimento de epilepsia.
Modelos animais que podem recapitular as principais características da TLE humana podem oferecer melhor apreciação da fisiopatologia do TLE, permitindo-nos facilmente monitorar e manipular fatores críticos no epileptogenesis. Entre eles, SE induzida por chemoconvulsants tem sido amplamente utilizado4,5. Ao contrário de outros modelos de epilepsia, tais como a estimulação elétrica que mostra sem esclerose hippocampal e robusto SRS6,7,8, a injeção sistêmica de chemoconvulsants pode imitar a patogenia clínica de TLE humana, ou seja, lesão cerebral inicial, um período de latência e um epiléptico crônico estágio manifestando SRS5,9,10. Portanto, esta técnica pode ser utilizada em vários estudos, explicando os mecanismos de uma lesão cerebral aguda, epileptogenesis ou supressão de apreensão. Além disso, alterações histopatológicas induzidas por chemoconvulsants são semelhantes aos observados em humano TLE, fornecendo uma justificativa adicional para uso de TLE modelos roedores10,11,12. Notavelmente, danos estruturais, envolvendo o hipocampo foram reproduzidos consistentemente em ambos os modelos de ácido - e induzidas pela pilocarpina SE kainic. No entanto, em comparação com injeção de ácido kainic, o modelo da Pilocarpina pode produzir mais robusto SRS em ratos, que podem oferecer vantagens consideráveis para estudar epilepsia crônica quando considerando a ampla disponibilidade de rato transgénico linhas5, 13 , 14 , 15. Além disso, progressão de convulsão após injeção de pilocarpina é geralmente mais rápida que o modelo de ácido kainic, fornecendo evidências adicionais para o uso eficaz de um modelo de pilocarpina de epilepsia.
Aqui, vamos demonstrar um método de SE induzir pela injeção i.p. de pilocarpina e através da realização de vídeo e monitoramento de EEG em epilepsia crônica.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Católica da Coreia e foram realizados em conformidade com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (NIH publicações n º 80-23).
1. SE indução
- Compra de camundongos C57BL/6NHsd sexo masculino de 8 semanas de idade e pesar cada rato. Em seguida, use uma caneta para marcar as caudas de todos os mouses para facilitar a sua identificação durante a indução SE.
- Calcular a quantidade de brometo de metilo de escopolamina (escopolamina; 2 mg/kg), Terbutalina hemisulfate (terbutaline; 2 mg/kg) e cloridrato de pilocarpina (Pilocarpina; 280 mg/kg) com base no peso do rato e adicione a solução salina (0,9% NaCl, 10 mL/kg) tornar-se soluções.
Nota: Por exemplo, se o peso do rato é 25g, os seguintes montantes são aplicados: escopolamina e Terbutalina: 2 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 0,05 mg, solução salina: 10ml/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL, pilocarpina: 280 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 7 mg , Solução salina: 10ml/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL. - Carrega a escopolamina e terbutaline mistura em uma seringa de 1 mL com agulha 30 G. Injetar a solução intraperitonealmente em cada rato e em seguida, retornar os ratos de suas gaiolas. A 30 min após a administração de escopolamina e Terbutalina, injecte a solução de pilocarpina em cada rato (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 30G). Imediatamente após a injeção de pilocarpina, coloque os ratos em uma incubadora (28-30° C), para observação.
- Monitore atentamente o comportamento dos ratos até SE é induzida. Se forem detectadas sistema límbicas motor convulsões que correspondem à fase 3 ou superior de acordo com a escala de Racine, registrar o tempo e monitorar os ratos para determinar se as convulsões ocorrem com maior frequência. Depois de contínuos ataques motor duram mais de 2 min, coloque o mouse em uma gaiola nova à temperatura ambiente e manter monitoramento para 3h determinar se suas crises convulsivas continuam e SE é induzida. Eutanásia nos ratos que não conseguiram entrar SE a cerca de 2 h após a injeção de pilocarpina.
Nota: Escala do Racine; fase 1, boca e movimento facial; fase 2, cabeça balançando; fase 3, clonus do membro anterior; fase 4, criação com clonus do membro anterior; estágio 5, criação e caindo com membro anterior clonus16. Se o mouse não é transferido para a gaiola na temperatura de quarto imediatamente após a indução da SE, o mouse pode morrer devido à hipertermia. - Rescindir comportamentais agudas convulsões a 3 h após início SE injetando solução diazepam (i.p.; 10 mg/kg; seringa de 1 mL e agulha 30G). Fazer a solução de diazepam diluindo-se 5 mg/mL de diazepam em polioxilo 10% óleo de rícino hidrogenado 35 por adição de soro fisiológico (i.p.; 10 mL/kg; seringa de 1 mL e agulha 30G).
Nota: solução de óleo de rícino polioxilo 10% 35 hidrogenado: 1 mL de solução de óleo de rícino hidrogenado 35 polioxilo + soro fisiológico 9 mL. Armazene a solução à temperatura ambiente. Por exemplo, se o peso do corpo do mouse é 25g, injetar 250 µ l de solução de diazepam: 50 diazepam de 5mg/mL µ l + rícino hidrogenado de 200 µ l 10% polioxilo 35 óleo solução = diazepam de 1 mg/mL 250 µ l. - Para os ratos de Souza, realizar uma injeção i.p. de mistura de hemisulfate de brometo de metilo e terbutaline a escopolamina (i.p.; ambos os 2 mg/kg, 10 mL/kg; seringa de 1 mL e agulha 30G). 30 min depois, injectar o soro intraperitonealmente (i.p.; 10 mL/kg; seringa de 1 mL e agulha 30G).
Nota: Se o peso do corpo do mouse é 25g, injete 250 µ l de soro, em vez de pilocarpina. - Após a injeção de diazepam (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 30G), administre 1 mL de dextrose 5% por cada rato (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 26G).
Nota: 1 mL de injeção de dextrose 5% fornece a fonte de energia e hidratação, o que pode aumentar a taxa de sobrevivência. - Durante a pós-cuidados na incubadora (28-30 ° C), limpe o excessivas secreções como saliva, lágrimas e fezes.
- No 1º dia após a indução da SE, pesar os ratos e mantê-los na incubadora (28-30 ° C) por um dia extra. No dia 2, após a indução da SE, pesar os ratos e devolvê-los para sua gaiola em casa. Fornece comida úmida para facilitar sua recuperação.
Nota: Neste experimento, a taxa de mortalidade para C57BL/6NHsd após a rescisão SE foi de 8,57% em média (3 fora de 35 ratos testados). - Medir o peso corporal dos animais diariamente até pós-pilocarpina 7 dias e injetar os ratos com 5% de dextrose (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 26G) quando o peso do corpo não aumentou. Pare de monitoramento de peso do corpo quando os ratos começam a recuperar o peso corporal e consumir comida úmida sem dificuldade em 2 dias após a injeção de pilocarpina.
Nota: Se até 7 dias post SE não aumentar o peso do corpo de um rato, excluir o mouse do experimento e eutanásia pelo dióxido de carbono. Dependendo do plano de fundo do mouse, a morte pode ocorrer ocasionalmente; no entanto, no caso de C57BL/6NHsd, menos de 1% dos ratos morreu nesses experimentos. Com a sobrevivência de mais de 7 dias após a indução da SE, os ratos raramente morrem durante o período de latência.
2. a implantação cirurgia para monitoramento de vídeo-EEG
- Prepare-se para executar a implantação de telemetria para monitorização de EEG ratos de 12 semanas (4 semanas após a indução SE).
Nota: Tempo de implantação pode ser modificado dependendo os fins experimentais e as estirpes de rato. - Antes da cirurgia, anestesia o mouse com uma mistura (4:0.5) de cetamina (50mg/mL) e xilazina (23,3 mg/mL) solução dissolvida em soro fisiológico na dose de 2,5 µ l/g de massa corporal (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 26G). Monitorar a frequência respiratória e esforço respiratório do mouse em intervalos regulares (15 min de intervalo máximo) e avaliar a profundidade da anestesia através do reflexo de retirada de pedal.
- Coloque o mouse em uma armação estereotáxica com barras de orelha e uma placa de mordida e aplique pomada de veterinário em ambos os olhos para evitar cegueira.
- Para manter condições estéreis durante a cirurgia, barbear cirúrgicas sites usando uma lâmina de barbear. Tenha cuidado para evitar a contaminação da pele do campo cirúrgico. Após a depilação, desinfete a pele com solução de 70% de etanol e iodo.
Nota: Cirurgia deve ser realizada de forma asséptica, usando luvas estéreis e máscaras, usando equipamento esterilizado e técnicas assépticas. - Depois de confirmar a profundidade da anestesia, fazer uma incisão da pele para expor a caveira. Faça dois buracos no crânio com uma broca anexada ao aparelho estereotáxica em coordenadas do Bregma no eixo ântero-posterior (AP): +0,1 mm, eixo mediolateral (ML): +0,1 mm (referência) e AP: −0.2 mm, ML: +0,22 mm (córtex parietal esquerdo)13.
- Limpe a pele com swaps de algodão embebido de PBS, seguido por solução de 70% de etanol e iodo. Faça uma incisão longitudinal no meio da cabeça com uma tesoura para expor o Lambda (o ponto onde se encontram o sagital e a sutura do lambdoid), o Bregma (o ponto de interseção da sutura coronal pela sutura sagital) e o local de destino.
- Identifica pontos anatômicos como Lambda e Bregma. Posicionar a broca no Bregma e anotar o X, Y coordenadas para este ponto.
- Usar um cérebro atlas livros ou publicado referências para determinar as coordenadas adequadas das regiões cerebrais para gravação de EEG. Em seguida, calcular as coordenadas para os parafusos (referência e gravação) usar as coordenadas de Bregma medido na etapa 2.5.2.
- Abaixe lentamente o bocado de broca para fazer um orifício de trépano, tendo o cuidado de evitar inserir o bocado de broca longe demais no ponto onde o crânio se torna mais fino.
- Inserir o corpo do único canal sem fio transmissor de EEG por trás da nuca do pescoço por via subcutânea e coloque flexível leva perto do crânio.
- Coloque um parafuso de aço inoxidável (2 mm de comprimento) em cada orifício de trépano com uma pinça e aperta-lo usando uma chave de fenda, rotação no sentido horário. Certifique-se que o parafuso é inserido não muito longe de fundo ajustando o grau de rotação do parafuso para evitar danos a dura-máter ou os tecidos do cérebro.
- Tira o casaco de isolamento 2 mm da ponta dos fios e esticar o fio suficiente para arredondar o eixo do parafuso para uma boa conexão entre o fio e o parafuso. Ligue a ponta de referência para o parafuso frontal e a liderança de gravação para o parafuso no córtex parietal. Em seguida, aplique o cimento dental para fixar todo o conjunto no lugar sem expor as partes metálicas.
- Depois de verificar que o cimento dental secou completamente por inspeção visual, suturar a pele e aplicar a pomada de mupirocina tópica. Coloque o mouse em uma incubadora de 30 ° C sozinho até que se recupere da cirurgia (cerca de 30 min). Em seguida, retorne o rato da gaiola em casa até o monitoramento de vídeo-EEG contínuo começa.
Nota: Após a cirurgia, cada rato é injetado (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 30G) com 5 mg/kg de gentamicina (antibiótico) e 5 mg/kg de cetoprofeno (analgésicos). Os animais devem ser monitorizados até que eles se tornam totalmente ambulantes. Transmissor-implantado os ratos têm um período de recuperação de cerca de 1 semana.
3. vídeo e EEG monitoramento e análise
- Coloque um rato em uma gaiola individual e a gaiola em cima das placas sem fio receptor onde a gaiola de Faraday é instalada para evitar a interrupção de sinais elétricos de quaisquer fontes, incluindo um computador, linhas de AC e receptores adjacentes.
Nota: Consulte o manual fornecido pelo fabricante. Deve ter cuidado para evitar pontos cegos. - Registro da atividade elétrica usando o sistema sem fio de vídeo-EEG de telemetria.
- Abra o software para gravação de vídeo-EEG. Clique em "Hardware" e selecione "Editar configuração". Coincidir com o receptor e o transmissor implantado em cada rato. Clique em "Configuração de canal" e confirmar que todos os canais estão ativos. Clique em "Configuração de vídeo" para sincronizar o vídeo com os dados do EEG (resolução de 480 x 40 e taxa de quadros de 30,00).
Nota: Instale uma câmera IP com alta sensibilidade se é fundamental para recolher as qualidades da boa imagem que podem identificar mudanças comportamentais sutis dos ratos à noite. - Clique em "Setup" e "Configuração P3" para entrada informações de animais individuais, câmera correspondente e configuração do gráfico.
- Clique em "Aquisição" e "A/D taxa de amostragem" para taxas de amostragem de instalação. Clique em "nome do conjunto de dados" para designar cada experimento.
Nota: Taxa de amostragem para EEG deve ser maior do que 500 Hz. devido o vídeo grande e o tamanho de dados de EEG, é recomendável que apenas 24h de dados são manipulados por sessão em vez de usar uma 2-semana-gravação contínua como um arquivo. Dados podem ser salvos separadamente em intervalos de 8 h ou 12 h em caso de falta de memória RAM. - Ativar o transmissor com uma barra magnética e clique em "Iniciar aquisição" para coletar a gravação de vídeo-EEG. Monitore continuamente o rato pelo sistema de vídeo-EEG durante pelo menos 2 semanas.
Nota: Para camundongos C57BL/6, SRS tende a ocorrer em clusters que última cerca de 5,2 dias e a duração do período livre de apreensão é cerca de 6,7 dias17.
- Abra o software para gravação de vídeo-EEG. Clique em "Hardware" e selecione "Editar configuração". Coincidir com o receptor e o transmissor implantado em cada rato. Clique em "Configuração de canal" e confirmar que todos os canais estão ativos. Clique em "Configuração de vídeo" para sincronizar o vídeo com os dados do EEG (resolução de 480 x 40 e taxa de quadros de 30,00).
- Determine a frequência de apreensão e duração por inspeção manual, usando o software de análise.
- Marque a área mostrando SRS e exportar os dados para a análise estatística. Seja cauteloso para excluir artefatos de EEG que podem ser gerados por coçar a cabeça ou mascar; Estes podem ser removidos, verificando os dados de vídeo.
Nota: SRS é definida como um início súbito de repetitiva epileptiforme picos de atividade (≥ 3 Hz) que persiste por mais de 10 s. convulsivos comportamentos podem ser frequentemente acompanhados com uma explosão de atividade de cravação. Convulsões não-convulsiva também podem demonstrar electrographic atividades cravação sem comportamentos convulsivos. Rescisão de apreensão é definido como ocorrendo quando os picos de fuzilamento voltar à atividade de linha de base. - Para a análise da frequência de apreensão, divida o número total de casos SRS detectado durante as 2 semanas pelo número total de dias de gravação para cada animal.
- Para análise de duração de apreensão, medir o tempo desde o início até o fim do epileptiforme cravação atividades.
- Marque a área mostrando SRS e exportar os dados para a análise estatística. Seja cauteloso para excluir artefatos de EEG que podem ser gerados por coçar a cabeça ou mascar; Estes podem ser removidos, verificando os dados de vídeo.
- Após a gravação de vídeo-EEG, consertar o cérebro com paraformaldeído 4% por perfusão transcardial. Para anestesiar o mouse, injetar uma solução (4:0.5) da cetamina (50mg/mL) e xilazina (23,3 mg/mL) dissolvido em solução salina na dose de 10 µ l/g de massa corporal (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 26G). Uma vez que o mouse é confirmado para ser profundamente anestesiada, execute a perfusão transcardial.
- Antes de isolar o cérebro de rato, recupere o transmissor do mouse para reutilização após a limpeza.
- Remova o cimento dental ao redor os contatos usando fórceps.
- Mergulhe a ponta dos fios com cimento dental em 100% de acetona até o cimento dental é dissolvido.
- Remova contaminantes de tecido ao redor do transmissor, enxaguá-lo com água destilada.
- Enxágue o transmissor com etanol a 70% por 3 h e ar secá-la para o armazenamento. Imediatamente antes da próxima utilização, lave o parafuso e o transmissor com etanol a 70%, seguido por água destilada e colocá-los em solução salina.
Nota: Deve ter cuidado para evitar cortar os fios flexíveis quando decapitar o mouse uma vez que, se os condutores flexíveis são muito curtos, o ruído na próxima implantação e gravação de vídeo-EEG pode aumentar.
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Representative Results
SE bem sucedido pode induzir a morte celular hippocampal e SRS (Figura 1 e Figura 2). Nós denunciado comportamentais convulsões agudas por injeção de diazepam a 3 h após início SE e sacrificou os ratos 7 dias ou seis semanas mais tarde.
Para o monitoramento de vídeo-EEG, os ratos que receberam a cirurgia de implante em 4 semanas após SE, e casos SRS foram avaliados por 2 semanas de 5-7 semanas após o início SE.
A Figura 1 mostra mortes de células no hipocampo avaliado pela coloração de cresilo violeta. 7 dias após SE, picnóticos células foram detectadas nas regiões hilares (Figura 1Ad) de giro do pectínea e a camada de célula piramidal do subcampo CA3 do hipocampo (Figura 1Af), Considerando que o hipocampo intacto foi observado nos animais Souza injetados com o soro, em vez de pilocarpina (Figura 1Aa-c). Curiosamente, os animais que se submeteram a múltiplas convulsões, mas não conseguiu entrar SE, não mostrou nenhuma morte celular em região hilar ou camada de célula piramidal (Figura 1Ag-i). Com 6 semanas após SE, observou-se uma redução acentuada no número de células hilares (Figura 1Bm). Além disso, observou-se perda neuronal no CA1 (Figura 1Bn) e CA3 (Figura 1Bo) regiões.
A Figura 2 mostra os vestígios de EEG representativos na farsa e SE grupos(Figura 2). Em comparação com o grupo farsa mostrando atividade elétrica fisiológica, o grupo SE mostrou ocasionalmente epileptiforme descargas acompanhadas com comportamentos convulsivos. As localizações dos eléctrodos peridural são ilustradas na Figura 2C. Figura 2 B demonstra um exemplo dos ruídos elétricos de um monitor adjacente e o fracasso da coleção de sinal. Também demonstrámos vestígios de EEG de Souza-manipulado animais que mostrou convulsões espontâneas durante as duas semanas de gravação de vídeo-EEG(Figura 2)e encontraram lesões corticais em perfusão, possivelmente derivada do posicionamento excessivamente profundo dos parafusos (Figura 2D) peridural.
Figura 1 : Morte neuronal no hipocampo após SE induzidas pela pilocarpina. Imagens representativas dos grupos de (A) 7 dias e (B), 6 semanas após a injeção de pilocarpina ou soro fisiológico. Ampliada de imagens mostra o Hilo (um, j), CA1 subcampo (b, k) e subcampo CA3 (c, l) do grupo farsa tratados com solução salina, o Hilo (d, m), subcampo CA1 (e, n) e o subcampo CA3 (f, o) do grupo SE e o Hilo (g), CA1 subcampo (h) e subcampo CA3 (eu) dos ratos que não desenvolvem as setas SE. Black em um ge j indicam algumas das células hilares representativas, e pontas de seta em d e m indicam picnóticos células. Barra de escala na parte inferior do lado esquerdo = 200 µm, válido para todo o deixou mais coluna, barra de escala em a e c = 20 µm, válido para a coluna inteira do meio e coluna da direita. Abreviaturas nesta figura: CA1, CA3: Cornu Ammonis hippocampal subcampos; DG: Giro Dentate. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Gravação de vídeo e EEG mostra espontâneas convulsões recorrentes no mouse epiléptico. (A) representante EEG traços de Souza-(topo) e SE manipulado animais (parte inferior). Note que os animais sujeitos a SE mostram epileptiforme picos de atividade (≥ 3 Hz), não expostas por animais de Souza. (B) uma imagem representativa de ruídos elétricos e o fracasso da coleção de sinal. Observe os picos de alta amplitude unipolar e descontinuação de sinais elétricos. (C) desenho esquemático do cérebro do rato com a localização dos eletrodos. (D) duas imagens mostrando o cérebro intacto e ferido no córtex, possivelmente devido a inserção excessivamente profundo dos parafusos peridural. A seta preta na imagem à direita indica o local do dano cortical. Barra de escala = 250 µm. (E) representante EEG vestígios de animais Souza-manipulado com ou sem lesão cerebral. Note-se que animais Souza-manipulado com lesão cortical geraram atividade cravação e SRS convulsivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho descreve os procedimentos experimentais para a indução SE e a avaliação das convulsões crônicas.
Vários fatores podem afetar a indução SE bem sucedida. Acurada monitoramento comportamental, de acordo com a escala de Racine é fundamental para o desenvolvimento dos SRS. Cabeça balançando, clonus do membro anterior, criação e queda são as características comportamentais de convulsões agudas, desenvolvendo-se em fase SE4,16. Uma vez que a primeira apreensão de motor é detectada, o comprimento do intervalo entre os ataques convulsivos mais tarde diminui antes de entrar SE. Além disso, SE deve ser mantido pelo menos 6 h a menos que convulsões comportamentais são terminadas por diazepam5. É interessante notar que os pesquisadores devem estar cientes da possibilidade que sustentavam a apreensão de atividades podem ser detectadas através de electrocorticograms, apesar de convulsões comportamentais parecem desaparecer com injeção de diazepam. Aumentando a temperatura ambiente após a injeção de pilocarpina até SE indução pode melhorar consideravelmente o número de animais com o SE. Também é importante fornecer cuidados intensivos após um ataque, incluindo peso monitoramento para maiores taxas de sobrevivência de cerca de 70-80%, em média,5,18, suporte nutricional e hidratação suficiente. Dependendo da base genética do animal, susceptibilidade a Pilocarpina pode ser diferente. Se animais exibir convulsões agudas graves com alta mortalidade, a redução da dosagem de pilocarpina, SE duração, ou aumento de escopolamina e Terbutalina pode ser útil. Enquanto SE severa é conhecido por ser relacionados a maior incidência de SRS, com maior mortalidade, é fundamental considerar esses fatores. Hipocampo neuronais mortes são consistentemente observados após SE. Em 6 h post-SE, extensa perda de interneurônios hilares tem sido relatado19. 7 dias após SE, neurônios piramidais no subcampo CA3 normalmente morrem e são observados continuamente com 6 semanas após a indução da SE, embora a extensão do dano neuronal na camada de célula piramidal é variável em camundongos. Perda neuronal no subcampo CA1 do hipocampo também pode ser observada com frequência. Curiosamente, os animais com convulsões múltiplas que não entram SE mostrou hipocampo quase intacto semelhante ao grupo sham, indicando morte histológica da célula pode ser um bom marcador de suficientemente graves crises agudas.
Em aproximadamente 4 semanas após SE, todos os tratados com pilocarpina C57BL/6NHsd ratos tornou-se epiléptica e mostrou SRS, demonstrando um dos principais méritos usando este modelo. Desde convulsões crônicas são agrupadas, o vídeo-EEG deve ser registado continuamente pelo menos 2 semanas, ao invés de forma intermitente, mesmo que o período de gravação pode ser modificado dependendo do cepas de rato ou fins experimentais17. Além disso, convulsões espontâneas em TLE têm variações diurnas, demonstrando a alta frequência SRS ao final da tarde20. Praticamente, para gravação de vídeo-EEG precisa, quaisquer fontes incluindo linhas AC, computadores, câmeras ou transmissores implantados no mouse no receptor adjacente precisam ser bloqueados. A instalação da gaiola de Faraday e câmeras com alta sensibilidade durante o dia e a noite pode diminuir o ruído elétrico e ajudar a identificar generalizada crônicas convulsões, respectivamente. Finalmente, é extremamente importante evitar danos cerebrais quando os parafusos são colocados na superfície da dura-máter como pode gerar dados enganosos do EEG. Embora a frequência SRS não era alta, qualquer mecânicos lesões corticais pela inserção do parafuso forçada poderiam gerar crises convulsivas em apenas uma semana.
Em conclusão, apesar do tempo de implante de restrições para a modelagem e a exigência de formação aprofundada para realizar cirurgias e análise de EEG, a SE induzidas pela pilocarpina é um dos melhores modelos para estudar epilepsia crônica entre animal atualmente disponível modelos de TLE. Aqui, descrevemos um método de indução SE após injeção de pilocarpina e avaliar convulsões crônicas, usando um sistema de vídeo-EEG de telemetria sem fio. Acreditamos que este protocolo pode fornecer informações detalhadas para modelos animais apropriados para epilepsia crônica e epileptogenesis.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão nacional pesquisa Fundação da Coreia (NRF) financiado pelo governo coreano (NRF-2014R1A1A3049456) e uma subvenção da Coreia saúde tecnologia R & D projeto através da Coreia saúde indústria desenvolvimento Institute (KHIDI), financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
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