Summary
이 원고 조직의 pilocarpine 주입 상태 epilepticus를 유도 및 무선 원격 비디오 및 뇌 파 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에 자발적인 재발 성 발작을 모니터링 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 만성 간 질, epileptogenesis, 그리고 급성 발작의 pathophysiologic 메커니즘을 공부에 대 한 이용하실 수 있습니다.
Abstract
측 두 엽 간 질 (TLE) 성인에서 일반적인 신경학 적인 장애입니다. 만성 간 질의 변환 연구, pilocarpine 유도 상태 epilepticus (SE) 자발적인 재발 성 발작 (SRS) 정리를 자주 선택 됩니다. 여기 우리 pilocarpine의 복 (i.p.) 주입 및 무선 원격 비디오 및 뇌 파 (EEG) 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 만성 반복 발작의 모니터링에 의해 SE 유도의 프로토콜을 제시. 우리 pilocarpine 주입 후에 7 일 그리고 6 주 후 pilocarpine hippocampal 신경 손실 그들의 상관 관계 주의 필요로 하는 주목할 만한 행동 변화를 설명 했다. 우리는 또한 비디오 및 뇌 파 기록을 위한 전극 이식의 실험 절차 및 주파수의 분석 및 만성 재발 성 발작의 기간을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 가능한 이유 왜 예상된 결과 각 경우에 달성 하지 논의. 이 마우스 및 문제 해결에 대 한 지침에 만성 간 질 모델링의 기본적인 개요를 제공 합니다. 이 프로토콜은 만성 간 질 및 epileptogenesis의 적합 한 모델에 대 한 초기 계획으로 사용할 수 있습니다 생각 합니다.
Introduction
TLE 가장 일반적인 획득된 epilepsies1중 하나입니다. 간 질을 가진 사람들 뇌2,3에 비정상적인 신경 활동의 결과로 재발 성 발작을 경험합니다. TLE 자주 세공는, 간 질의 개발 기본 기본 메커니즘을 이해 하기 결정적 이다.
인간의 TLE의 주요 특징을 정리 할 수 있는 동물 모델의 TLE 이상, 우리가 쉽게 모니터링 하 고 epileptogenesis에 중요 한 요소를 조작 수 있도록 더 나은 감사를 제공할 수 있습니다. 그 중, chemoconvulsants 유도 SE 널리4,5되었습니다. 다른 간 질 모델을 보여주는 hippocampal sclerosis 없고 강력한 SRS6,7,의8, 전기 자극과 달리 chemoconvulsants의 조직의 주입 인간의 TLE의 임상 병을 모방 수 있습니다. 즉, 초기 뇌 손상, 잠재성 기간, 그리고 만성 간 질 무대 만들어 낸 SRS5,,910. 따라서,이 기술은 급성 뇌 손상, epileptogenesis, 또는 발작 억제의 메커니즘을 설명 하는 다양 한 연구에 활용할 수 있습니다. 또한, histopathological 변경 chemoconvulsants에 의해 유도 된 인간의 TLE, TLE 설치류 모델10,,1112의 사용에 대 한 추가 논리를 제공 본 그와 유사 하다. 특히, 해 마와 관련 된 구조적 손상 모두 kainic 산 및 pilocarpine-유도 SE 모델에 일관 되 게 재현 되어 있다. 그러나, kainic 산 주입에 비해 pilocarpine 모델 생산할 수 있는 쥐 유전자 변형 마우스 라인5, 의 넓은 가용성을 고려할 때 만성 간 질을 공부에 대 한 상당한 이점을 제공할 수 있는 보다 강력한 SRS 13 , 14 , 15. 게다가, 발작 진행 후 pilocarpine 주입은 일반적으로 보다 빠른 kainic 산 모델에서 간 질의 pilocarpine 모델의 효과적인 사용에 대 한 추가 증거를 제공 하.
여기, pilocarpine의 i.p. 주입 및 비디오 및 만성 간 질에서 뇌 파 모니터링을 수행 하 여 SE 유도 하는 방법을 설명 합니다.
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Protocol
모든 실험 절차 가톨릭 대학교의 윤리 위원회에 의해 승인 및 관리 및 실험 동물 사용 (NIH 간행물 번호 80-23)에 대 한 국가 학회 건강 가이드에 따라 실시 했다.
1. SE 유도
- 8 주 오래 된 남성 C57BL/6NHsd 마우스를 구입 하 고 각 마우스 무게. 그런 다음 마커 펜을 사용 하 여 SE 유도 하는 동안 그들의 쉬운 id에 대 한 모든 쥐의 꼬리를 표시.
- 마우스 무게에 따라 scopolamine 메 틸 브 로마 이드 (scopolamine; 2 mg/kg), terbutaline hemisulfate (terbutaline; 2 mg/kg), 및 pilocarpine 염 (pilocarpine; 280 mg/kg)의 양을 계산 하 고 식 염 수 (0.9 %NaCl, 10 mL/kg) 솔루션에 추가 합니다.
참고: 예를 들어 마우스의 무게는 25 g, 다음 금액 적용 됩니다: Scopolamine와 terbutaline: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0.05 mg, 염 분: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0.25 mL, Pilocarpine: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg 염 분: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0.25 mL. - 30g 바늘 1 mL 주사기에 scopolamine와 terbutaline 혼합물을 로드 합니다. 각 마우스에 intraperitoneally 솔루션을 주입 하 고 그들의 감 금 소에는 마우스를 반환 합니다. Scopolamine와 terbutaline 관리 후 30 분 pilocarpine 솔루션 (i.p.; 1 mL 주사기 30 G 바늘) 각 마우스에 주사. Pilocarpine 주입 후 즉시 관찰에 대 한 인큐베이터 (28-30 ° C)에 쥐를 놓습니다.
- SE 유도 될 때까지 조심 스럽게 쥐의 동작을 모니터링 합니다. 변 모터 발작 무대 라신의 규모에 따라 3 이상에 해당 하는 검색 되 면 시간을 기록 하 고 발작이 더 자주 발생 하는지를 확인 하려면 마우스를 모니터링 합니다. 지속적인 모터 발작 2 분 이상 지속, 일단 마우스 실내 온도에 새로운 장에 놓고 그들의 경련 발작 계속 SE 유발 여부를 결정 하는 3 h에 대 한 모니터링을 계속 합니다. 마우스 입력 하지 못한 안락사 pilocarpine 주입 후 약 2 시간에 SE.
참고: 라신의 규모; 1 단계, 입, 얼굴 운동; 단계 2, 머리 끄 덕; 단계 3, forelimb clonus; 단계 4, forelimb clonus;와 양육 단계 5, 양육 및 forelimb clonus16. 마우스 SE 유도 후 실 온에서 감 금 소에 전송 되지 않습니다, 마우스는 고 열으로 인해 죽을 수 있다. - 다이아 제 팜 솔루션 (i.p., 10 mg/kg, 1 mL 주사기, 바늘 30 G)를 주입 하 여 SE 발병 후 3 h 행동 급성 발작을 종료 합니다. 염 분 (i.p., 10 mL/kg, 1 mL 주사기, 바늘 30 G)를 추가 하 여 10% polyoxyl 35 수 소화한 아주까리 기름에 다이아 제 팜 5 mg/mL를 diluting 하 여 다이아 제 팜 솔루션을 확인 합니다.
참고: 10% polyoxyl 35 수 소화한 아주까리 기름 솔루션: 1 mL polyoxyl 35 수 소화한 아주까리 기름 솔루션 + 9 mL 염 분. 실 온에서 솔루션을 저장 합니다. 예를 들어 마우스 몸 무게 25 g 인 경우에, 주입의 다이아 제 팜 솔루션 250 µ L: 50 µ L 5 mg/mL 다이아 제 팜 + 200 µ L 10% polyoxyl 35 수 소화한 아주까리 기름 솔루션 = 250 µ L 1 mg/mL 다이아 제 팜. - 가짜 쥐에 대 한 수행 scopolamine 메 틸 브 로마 이드와 terbutaline hemisulfate 혼합물의 i.p. 주사 (i.p.; 두 2 mg/kg, 10 mL/kg; 1 mL 주사기 30 G 바늘). 30 분 나중에, intraperitoneally는 식 염 수를 주사 (i.p., 10 mL/kg, 1 mL 주사기, 바늘 30 G).
참고: 경우 마우스 몸 무게는 25 g, 250 µ L pilocarpine 대신 식 염 수의 주입. - 다이아 제 팜 주사 (i.p.; 1 mL 주사기 30 G 바늘), 후 개별 마우스 (i.p.; 1 mL 주사기 26 G 바늘) 당 5% 포도 당 1 mL를 관리 합니다.
참고: 5% 포도 당 주사의 1 mL 에너지 소스 및 생존 율을 증가 시킬 수 있는 수 분을 제공 합니다. - 인큐베이터 (28-30 ° C)에서 사후 관리 하는 동안 타 액, 눈물, 배설물 등 과도 한 분 비 물을 닦아.
- SE 유도 후 1 일에서 쥐 무게 하 고 여분의 하루 동안 인큐베이터 (28-30 ° C)에서 그들을 유지. 하루 2, SE 유도 후, 무게를 쥐 고 케이지 그들의 가정 그들이 돌아갑니다. 그들의 회복을 촉진 하기 위하여 습 한 차를 제공 합니다.
참고: 이 실험에서 SE 종단 후 C57BL/6NHsd에 대 한 사망 율 평균 (35 마우스 테스트의 개 3) 8.57% 이었다. - 7 일 후 pilocarpine까지 동물의 체중을 매일 측정 하 고 5% 포도 당 (i.p.; 1 mL 주사기 26 G 바늘)와 쥐를 주사 때 몸 무게 증가 하지. 몸 무게 모니터링 쥐 몸 무게를 회복 하 고 pilocarpine 주사 후 2 일에서 어려움 없이 촉촉한 차 소비를 시작할 때 중지 합니다.
참고: 마우스의 몸 무게는 7 일 게시물 SE까지 증가 하지 않았다, 실험에서 마우스를 제외 하 고 이산화탄소로 안락사. 마우스의 배경에 따라 죽음 때때로 발생할 수 있습니다; 그러나, C57BL/6NHsd의 경우 쥐의 1% 미만이 실험에서 사망 했다. SE 유도 후 7 일 이상 생존, 생쥐는 거의 잠 기간 동안 죽을.
2. 이식 수술 비디오-뇌 파 모니터링
- 뇌 파 모니터링을 위한 원격 주입을 수행 하기 위해 12 주 된 쥐 SE 유도 후 (4 주)을 준비 합니다.
참고: 이식의 타이밍은 실험적인 목적 및 마우스 긴장에 따라 수정할 수 있습니다. - 수술 전에 마 취 제 (50 mg/mL) 및 xylazine (23.3 mg/mL) 솔루션 (i.p.; 1 mL 주사기 26 G 바늘) 2.5 µ L/g 몸 무게의 복용량에 식 염 수에 용 해의 혼합물 (4:0.5)로 마우스를 anesthetize. 정기적으로 (최대 15 분 간격) 호흡 속도 마우스의 호흡 노력을 모니터링 하 고 페달 철수 반사에 의해 마 취의 깊이 평가.
- 귀 바와 물린 접시 stereotaxic 프레임에 마우스를 놓고 두 눈을 실명을 피하기 위해 수 의사 연 고를 적용 합니다.
- 수술 하는 동안 멸 균 상태를 유지, 면도날을 사용 하 여 외과 사이트를 면도. 외과 분야의 모피 오염을 방지 하기 위해 주의 해야 합니다. 면도 후, 70% 에탄올과 요오드 솔루션으로 피부 소독.
참고: 수술은 무 균 방식으로 입고 멸 균 장갑, 마스크, 소독된 장비 및 무 균 기술을 사용 하 여 수행 되어야 한다. - 마 취의 깊이 확인 한 후 두개골을 노출에 피부 절 개를 중간 확인 합니다. Anteroposterior 축 (AP)에 Bregma에서 좌표 stereotaxic 장치에 연결 된와 함께 두 개의 버 구멍 만들기: 0.1 m m, 입장 축 (ML): 0.1 m m (참조), 그리고 AP: −0.2 m m, ML: +0.22 mm (왼쪽된 정수 리 피 질)13.
- PBS-젖은 면 스왑, 70% 에탄올과 요오드 솔루션 다음으로 피부를 닦아냅니다. 람다 (은 화살 및 lambdoid 봉합이 만나는 지점), Bregma (화살 봉합 하 여 코로나 봉합의 교차 시점) 및 대상 위치를 폭로 위로 머리 중간 종 절 개를 확인 합니다.
- 람다 및 Bregma 같은 해부학 적 랜드마크를 식별 합니다. 드릴 비트 위치 Bregma와 메모는 X, Y 좌표이 포인트.
- 뇌 아틀라스도 서를 사용 하 여 또는 뇌 파 기록에 대 한 뇌 영역의 적절 한 좌표 결정에 대 한 참조를 출판. 그런 다음, 나사 (참조 및 기록)에 대 한 좌표 계산 단계 2.5.2에서 측정 Bregma 좌표를 사용 하 여.
- 천천히 낮은 두개골 얇은 되는 지점에서 너무 멀리 드릴 비트를 삽입 되지 않도록 주의 하면서 버 구멍을 드릴 비트.
- 단일 채널의 몸을 피하는 목의 목 덜 미 뒤에 뇌 파 송신기 무선 및 유연한 배치 삽입 두개골 근처 리드.
- 스테인리스 스틸 스크류 (길이 2mm) 각 버 구멍에 핀셋으로 놓고 시계 방향으로 회전 하 여 나사 드라이버를 사용 하 여 그것을 강화 합니다. 나사 경질 또는 뇌 조직에 손상을 방지 하기 위해 나사 회전의 정도 조정 하 여 멀리 너무 깊이 삽입 되지 않도록 다는 것을 확인 하십시오.
- 단 열 코트 리드의 끝에서 2mm를 벗기십시오 고 철사와 나사 사이 좋은 연결을 위한 스크류 샤프트를 철사를 충분히 스트레칭. 전면 나사와 정수 리 피 질에 나사를 녹음 리드를 참조 리드를 연결 합니다. 그런 다음, 치과 시멘트 금속 부분을 노출 하지 않고 장소에 전체 어셈블리를 보안에 적용 됩니다.
- 치과 시멘트는 완전히 육안 검사에 의해 건조를 확인 한 후 피부를 봉합 하 고 시사 mupirocin 연 고를 적용 합니다. 장소는 마우스는 30 ° C 배양 기에서 혼자 수술 (약 30 분)에서 복구 될 때까지. 그런 다음, 지속적인 비디오-뇌 파 모니터링 시작 될 때까지 마우스 홈 케이지에 반환 합니다.
참고: 수술 후, 각 마우스 gentamicin (항생제)의 5 밀리 그램/kg과 ketoprofen (진통제)의 5 mg/kg (i.p.; 1 mL 주사기 30 G 바늘) 주입 됩니다. Ambulant 완전히 될 때까지 동물을 모니터링 해야 합니다. 송신기-이식 마우스 1 주 약의 복구 기간을가지고.
3. 비디오 및 뇌 파 모니터링 및 분석
- 개별 장에 마우스를 놓고 패러데이 케이지 전기 신호는 컴퓨터, AC 라인, 및 인접 한 수신기를 포함 하 여 모든 소스에서 중단 되지 않도록 하려면 설치 되어 무선 수신기 접시 위에 케이지를 놓습니다.
참고: 제조업체에서 제공한 설명서를 참조 하십시오. 맹점을 피하기 위해 주의 해야 합니다. - 무선 비디오-뇌 파 원격 측정 시스템을 사용 하 여 전기 활동을 기록 합니다.
- 비디오-뇌 파 기록 위한 소프트웨어를 엽니다. "하드웨어"를 클릭 하 고 "구성 편집"을 선택 합니다. 수신기와 송신기 각 마우스에 이식 일치. "채널 구성" 클릭 하 고 모든 채널은 활성 확인. 클릭 "비디오 구성" 뇌 파 데이터 (30.00의 40 x 480 및 프레임 속도의 해상도)와 비디오를 동기화 할.
참고: 밤에는 쥐의 미묘한 행동 변화를 식별할 수 있는 좋은 이미지 품질을 수집 하는 것이 중요 하는 경우에 높은 감도와 IP 카메라를 설치 합니다. - "설치"를 클릭 하 여 "P3 설치" 입력된 개별 동물 정보, 일치 카메라, 그리고 그래프 설정.
- 설치 샘플링 속도를 "수집", "A/D 샘플링 속도"를 클릭 하십시오. "데이터 집합 이름"을 클릭 하 여 각 실험을 지정.
참고: 뇌 파에 대 한 샘플링 속도 높은 500 Hz. 보다 큰 비디오 및 뇌 파 데이터 크기를 해야 것이 좋습니다만 세션 당 처리 되는 데이터의 24 시간 연속 2 주 녹화를 사용 하 여 하나의 파일로 보다. RAM 메모리 부족의 경우 h 8 또는 12 h 간격 데이터를 별도로 저장할 수 있습니다. - "수집 시작"을 클릭 하 여 자석 바 송신기 비디오-뇌 파 기록 수집 하. 적어도 2 주 동안 마우스 비디오-뇌 파 시스템에 의해 지속적으로 모니터링 합니다.
참고: C57BL/6 마우스 SRS 마지막 약 5.2 일 및 발작-무료 기간의 기간 그건 약 6.7 일17클러스터에서 발생 하는 경향이 있다.
- 비디오-뇌 파 기록 위한 소프트웨어를 엽니다. "하드웨어"를 클릭 하 고 "구성 편집"을 선택 합니다. 수신기와 송신기 각 마우스에 이식 일치. "채널 구성" 클릭 하 고 모든 채널은 활성 확인. 클릭 "비디오 구성" 뇌 파 데이터 (30.00의 40 x 480 및 프레임 속도의 해상도)와 비디오를 동기화 할.
- 수동 검사 분석 소프트웨어를 사용 하 여 발작 빈도 기간을 결정 합니다.
- SRS를 보여주는 영역을 표시 하 고 통계 분석을 위해 데이터를 내보냅니다. 머리를 긁 적 또는 씹는;에 의해 생성 될 수 있는 뇌 파 유물 제외 주의 이들은 비디오 데이터를 확인 하 여 제거할 수 있습니다.
참고: SRS는 반복적인 epileptiform 급상승 하는 활동의 갑작스런 발병으로 정의 (≥ 3 Hz)는 이상 10 미 경련 동작 활동 급상승의 버스트 자주 동반 될 수에 대 한 지속. 비 경련 발작 또한 경련 동작 없이 electrographic 스파이크 활동을 설명할 수 있다. 압류 해지는 때 발사 스파이크 초기 활동에 돌려보낼 때 발생로 정의 됩니다. - 발작 빈도의 분석에 대 한 각 개별 동물에 대 한 일의 총 수로 2 주 동안 탐지 SRS 경우의 총 수를 나눕니다.
- 발작 기간의 분석을 위해 활동 급상승 하는 epileptiform의 끝에 발병에서 시간을 측정 합니다.
- SRS를 보여주는 영역을 표시 하 고 통계 분석을 위해 데이터를 내보냅니다. 머리를 긁 적 또는 씹는;에 의해 생성 될 수 있는 뇌 파 유물 제외 주의 이들은 비디오 데이터를 확인 하 여 제거할 수 있습니다.
- 비디오-뇌 파 기록의 완성 후 transcardial 관류 하 여 두뇌 4 %paraformaldehyde 해결. 마우스를 anesthetize, 솔루션 (4:0.5) 케 타 민 (50 mg/mL) 및 xylazine (23.3 mg/mL)의 주입에 10 μ/g 몸 무게 (i.p.; 1 mL 주사기 26 G 바늘)의 복용량에 식 염 수에 녹. 마우스 깊은 취를 확인 transcardial 관류를 수행 합니다.
- 쥐의 뇌를 분리 하기 전에 세 안 후 다시 마우스에서 송신기를 검색 합니다.
- 집게를 사용 하 여 리드 주위 치과 시멘트를 제거 합니다.
- 치과 시멘트 해산 될 때까지 100% 아세톤에 치과 시멘트와 리드의 끝에 담근 다.
- 증류수로 헹 궈 서 송신기 주위 조직 오염 물질을 제거 합니다.
- 린스 3 h 및 어 70% 에탄올과 송신기 스토리지에 대 한 그것을 건조. 다음 사용 직전 나사와 70% 에탄올, 증류수, 다음 송신기 린스 하 고 식 염 수에 넣어.
참고: 유연한 리드 너무 짧은 경우, 마우스를 목이, 다음 주입 고 비디오-뇌 파 기록에서 노이즈를 증가 시킬 수 있습니다 때 유연한 와이어를 절단 하지 않도록 주의 해야 합니다.
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Representative Results
성공적인 SE hippocampal 세포 죽음과 SRS (그림 1 및 그림 2)을 유도할 수 있다. 우리는 SE 발병 후 3 h에 다이아 제 팜 주사에 의해 행동 급성 발작을 종료 하 고 7 일 또는 6 주 후 쥐를 희생.
비디오-뇌 파 모니터링, 받은 쥐 SE, 후 4 주에 수술 임 플 란 트 및 SRS의 경우 SE 발병 후 5-7 주에서 2 주 동안 평가 했다.
그림 1 cresyl 보라색 얼룩에 의해 평가 하는 해 마에서 세포 죽음을 보여준다. SE 후 7 일, pyknotic 세포에서에서 발견 되었습니다.가 이랑 및 (그림 1Af), 해 마의 CA3 하위의 피라미드 세포 층 hilar 영역 (그림 1광고) 그대로 마 관찰 되었다 반면 가짜 동물 pilocarpine (그림 1Aa-c) 대신 식 염 수를 주입 합니다. 흥미롭게도, 여러 발작을 겪은 동물 하지만 입력 실패 SE, hilar 지역 또는 피라미드 셀 레이어 (그림 1Ag-i) 아무 세포 죽음을 보여주었다. SE 후 6 주, 표시 된 감소는 hilar 셀 (그림 1Bm)의 수에서 관찰 되었다. 또한, 신경 손실은 CA1에서 관찰 되었다 (그림 1억) 및 CA3 (그림 1보) 지역.
그림 2 는 가짜와 SE 그룹 (그림 2A)에서 대표적인 뇌 파 추적을 보여준다. 생리 적인 전기 활동을 보여주는 가짜 그룹에 비해, SE 그룹 때때로 epileptiform 방전 경련 동작 함께 보였다. 경 막 외 전극의 위치는 그림 2C에 설명 됩니다. 그림 2 B 는 인접 한 모니터에서 전기 소리의 예 고 신호 컬렉션의 오류를 보여 줍니다. 우리는 또한 비디오-뇌 파 기록 (그림 2E)의 2 주 동안 자발적인 발작 그리고 대뇌 피 질의 부상 관류, 아마도 지나치게 깊은 배치에서 파생에서 발견 가짜 조작 동물의 뇌 파 추적 시연 경 막 외 나사 (그림 2D)의
그림 1 : SE pilocarpine 유도 후 해 마에 있는 신경 죽음. 그룹 (A)의 7 일 및 (B) pilocarpine 또는 식 염 수 주입 후 6 주에서 대표 이미지. 확대 이미지 쇼 hilus(, j), CA1 하위 필드 (b, k), 그리고 염 분 처리 가짜 그룹의 CA3 하위 (c, l), hilus (d, m), CA1 하위 ( n,e) SE 그룹과 hilus (g)의 CA3 하위 (f, o), CA1 하위 필드 (h), 그리고 , g및 j 에 SE 블랙 화살표를 개발 하지 않는 쥐의 CA3 하위 (나) 일부 대표적인 hilar 셀 나타내고 화살촉 d 와 m 에 pyknotic 셀을 표시 합니다. 아래쪽에 눈금 막대 왼쪽 = 200 µ m, 대부분 열,에서 눈금 막대는 전체에 대 한 유효한 a 및 c = 20 µ m, 전체 중간 열과 오른쪽 열에 대 한 유효한. 이 그림에서 약어: CA1, CA3: 뿔 Ammonis hippocampal 하위; DG:가 이랑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 비디오 및 EEG 기록 간 질 마우스에 자발적인 재발 성 발작을 보여줍니다. (A) 대표적인 뇌 파 추적에서 가짜-(맨 위) 및 SE 조작 동물 (아래). SE 대상이 동물 epileptiform 급상승 활동 표시 (≥ 3 Hz), 하지 가짜 동물에 의해 전시. (B) 전기 소음 및 신호 컬렉션의 실패의 대표 이미지. 높은 진폭 단극 스파이크와 전기 신호의 중단 note. 전극의 위치와 마우스 뇌의 그림 (C) 회로도 (D) 2 이미지 손상과 다친 뇌 경 막 외 나사의 지나치게 깊은 삽입으로 인해 대뇌 피 질에서 보여주는. 오른쪽 이미지에 검은색 화살표는 외피 손상의 사이트를 나타냅니다. 눈금 막대 = 250 µ m. (E) 대표적인 뇌 파의 흔적 가짜 조작 동물 또는 뇌 손상 없이. 대뇌 피 질의 부상으로 가짜 조작 동물 급격히 활동 및 경련 SRS를 생성 하는 것을 참고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 작품에서는 SE 유도 및 만성 발작의 평가 대 한 실험 절차를 설명합니다.
여러 가지 요인 성공적인 SE 유도 영향을 수 있습니다. 라신 규모에 따라 정확한 행동 모니터링 하는 것이 SRS의 개발에 대 한 중요 합니다. 머리를 끄 덕, forelimb clonus, 양육, 그리고 떨어지는 하는 행동의 SE 단계4,16으로 급성 발작. 일단 첫 번째 모터 발작 감지 후 경련 발작 사이의 간격의 길이 들어가기 전에 감소 세. 또한, SE 행동 발작 다이아 제 팜5종료 하지 않는 한 적어도 6 h에 대 한 메시지를 지속 한다. 지적 연구원은 행동 발작 다이아 제 팜 주사로 가시고 것 비록 발작 활동 electrocorticograms를 통해 검출 될 수 있다 지속 가능성의 알고 있어야 가치가 있다. SE 유도 SE와 동물의 수를 크게 향상 시킬 수 있을 때까지 pilocarpine 주입 후 온도 증가. 그것은 또한 충분 일 분, 영양 지원, 및 무게5,18평균 약 70-80% 보다 더 높은 생존 율에 대 한 모니터링을 포함 한 집중 후 발작 치료를 제공 하는 것이 중요. 동물의 유전 배경, 따라 pilocarpine 민감성이 달라질 수 있습니다. 동물 높은 사망률과 심각한 급성 발작을 표시, pilocarpine 복용량, SE, 또는 증가 scopolamine 기간과 terbutaline의 감소 도움이 될 수 있습니다. 심한 SE는 높은 사망률과 SRS의 발생률이 높은 관련된으로 알려져 있지만 그것은 이러한 요소를 고려해 야 할 중요 한. Hippocampal 신경 죽음 SE 후 지속적으로 관찰 된다. 6 h 포스트-SE, hilar 수의 광범위 한 손실 보고19되었습니다. SE 후 7 일, 피라미드 뉴런 CA3 하위 필드에 일반적으로 죽을, 그리고 피라미드 세포 층에서 신경 손상의 정도 쥐에서 변수 SE 유도 후 6 주에 지속적으로 관찰 된다. 해 마의 CA1 하위 신경 손실 또한 관찰할 수 있습니다 자주. 흥미롭게도, 동물 입력 하지 않으면 여러 발작으로 SE 보여 거의 그대로 마 비슷한 가짜 그룹 나타내는 더 세포 죽음 충분히 심각한 급성 발작의 좋은 표시 될 수 있습니다.
세 후 약 4 주에서 모든 pilocarpine 취급 C57BL/6NHsd 쥐 간 질 고 보였다 SRS를 보여주는 주요 장점이 모델을 사용 하 여. 때문에 만성 발작 클러스터는 비디오-뇌 파 기록 되어야 합니다 지속적으로 보다 일시적으로, 적어도 2 주 동안 비록 녹음 기간 마우스 긴장 또는 실험적인 목적17에 따라 수정할 수 있습니다. 또한, TLE 자발적인 발작 일주 유사 늦은 오후20에 높은 SRS 주파수를 보여주는 있다. 실질적으로, 정확한 비디오-뇌 파 기록에 대 한 AC 라인, 컴퓨터, 카메라, 또는 인접 수신기에 마우스에 이식 하는 전송기를 포함 하 여 모든 소스를 차단 될 필요가 있다. 낮과 밤 동안 패러데이 케이지 및 높은 감도와 카메라의 설치 전기 소음을 점감 할 수 있다 하 고 식별 하는 데 도움이 일반적인 만성 발작, 각각. 마지막으로 때 그것은 잘못 된 뇌 파 데이터를 생성할 수 있습니다 나사 dura mater의 표면에 배치 되어 뇌 손상을 피하기 위해 매우 중요 하다. SRS 주파수 높은 했지만, 강제 나사 삽입 하 여 어떤 기계적 외피 부상 1 주일만에 경련 발작을 생성할 수 있습니다.
결론적으로, 모델링 및 수행을 깊이 있는 교육의 요구 사항에 대 한 제약 조건을 이식 수술과 뇌 파 분석 시간에도 불구 하 고 pilocarpine 유도 SE는 현재 사용할 수 있는 동물 중 만성 간 질 공부에 대 한 최고의 모델 중 하나 TLE의 모델입니다. 여기, 우리 pilocarpine 주입 및 만성 발작 무선 원격 비디오-뇌 파 시스템을 사용 하 여 평가 후 SE 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 만성 간 질 및 epileptogenesis 적절 한 동물 모델에 대 한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다 믿습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 한국 정부 (NRF-2014R1A1A3049456)에 의해 투자 하는 한국 국립 연구 재단 (NRF) 그랜트와 한국 건강 기술 R & D 프로젝트 통해는 한국 보건 산업 개발 연구소 (진흥원), 부여에 의해 지원 되었다 보건 복지, 한국 공화국 (HI15C2854)에 의해 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
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