Summary
Detta manuskript beskriver en metod att inducera status epilepticus av systemisk pilokarpin injektion och av övervakningen spontana återkommande anfall med levande djur med hjälp av en trådlös telemetri video och elektroencefalogram system. Detta protokoll kan utnyttjas för att studera de patofysiologiska mekanismerna av kronisk epilepsi, epileptogenes och akut anfall.
Abstract
Tinningloben epilepsi (TLE) är en vanlig neurologisk sjukdom i vuxen ålder. Translationella studier av kronisk epilepsi väljs pilokarpin-inducerad status epilepticus (SE) ofta att recapitulate spontana återkommande anfall (SRS). Här presenterar vi ett protokoll SE induktion av intraperitoneal (IP) injektion av pilokarpin och övervakning av kronisk återkommande anfall med levande djur med hjälp av en trådlös telemetri video och elektroencefalogram (EEG) system. Vi visat betydande beteendeförändringar som behöver uppmärksamhet efter pilokarpin injektion och deras korrelation med Hippocampus neuronala förlust på 7 dagar och 6 veckor efter pilokarpin. Vi beskriver också de experimentella procedurerna av elektroden implantation för video och EEG inspelning och analys av frekvensen och varaktigheten av kronisk återkommande anfall. Slutligen diskuterar vi möjliga orsaker varför de förväntade resultaten inte uppnås i varje fall. Detta ger en grundläggande översikt över modellering kronisk epilepsi hos möss och riktlinjer för felsökning. Vi anser att detta protokoll kan fungera som en baslinje för lämpliga modeller av kronisk epilepsi och epileptogenes.
Introduction
TLE är en av de vanligaste förvärvade epilepsier1. Personer med epilepsi drabbas av återkommande anfall till följd av onormala neuronala aktiviteter i hjärnan2,3. TLE är ofta svårbehandlade, är det viktigt att förstå de grundläggande mekanismerna bakom utvecklingen av epilepsi.
Djurmodeller som kan sammanfatta de viktigaste egenskaperna hos mänskliga TLE kan erbjuda bättre uppskattning av TLE patofysiologi, tillåter oss att lätt övervaka och manipulera kritiska faktorer i epileptogenes. Bland dem varit chemoconvulsants-inducerad SE utbredda4,5. Till skillnad från andra epilepsi modeller, såsom elektrisk stimulering som visar ingen Hippocampus skleros och robust SRS6,7,8, kan systemisk injektion av chemoconvulsants härma kliniska patogenesen av mänskliga TLE, dvs, inledande hjärnskada, en latent period och en kronisk epilepsi scenen manifesterar SRS5,9,10. Denna teknik kan därför utnyttjas i olika studier förklarar mekanismerna bakom akuta hjärnskador, epileptogenes eller beslag dämpning. Dessutom är histopatologiska förändringar orsakade av chemoconvulsants liknande de som setts i mänskliga TLE, ger en ytterligare grund för användning av TLE gnagare modeller10,11,12. Särskilt, har strukturella skador som omfattar hippocampus återgivits konsekvent i båda kainic syra - och pilokarpin-inducerad SE modellerna. Men kan jämfört med kainic för injektion, pilokarpin modellen producera mer robust SRS i möss, som kan ge betydande fördelar för att studera kronisk epilepsi när man överväger den stora tillgången på transgena möss linjerna5, 13 , 14 , 15. övrigt beslag progression efter pilokarpin injektion är i allmänhet snabbare än i kainic acid modellen, som ger ytterligare bevis för en effektiv användning av pilokarpin modell av epilepsi.
Här visar vi en metod för att förmå SE genom i.p. injektion av pilokarpin och genom att utföra video och EEG övervakning i kronisk epilepsi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner godkändes av den etiska kommittén Koreas katolska universitet och genomfördes i enlighet med den nationella institut för hälsa Guide för skötsel och användning av försöksdjur (NIH publikationer nr 80-23).
1. SE induktion
- Köp 8 veckor gamla manliga C57BL/6NHsd möss och väga varje mus. Använd sedan en tuschpenna för att markera alla möss för att lätt identifiera under SE induktion stjärtar.
- Beräkna mängden Skopolamin metylbromid (Skopolamin, 2 mg/kg), terbutalin hemisulfate (terbutalin, 2 mg/kg) och pilokarpin hydroklorid (pilokarpin, 280 mg/kg) baserat på musen vikt och lägga koksaltlösning (0,9% NaCl, 10 mL/kg) att göra lösningar.
Obs: Till exempel om musen väger 25 g, följande belopp tillämpas: Skopolamin och terbutalin: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0.05 mg, saltlösning: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL, pilokarpin: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg , Saltlösning: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL. - Ladda Skopolamin och terbutalin blandningen i en 1 mL spruta med 30 G nål. Lösningen injiceras intraperitonealt i varje mus, och sedan återvända möss till sina burar. På 30 min efter Skopolamin och terbutalin administration, injicera pilokarpin lösning i varje mus (i.p., 1 mL spruta, 30 G nål). Omedelbart efter pilokarpin injektion, placera mössen i en inkubator (28-30° C) för observation.
- Noggrant övervaka beteendet hos möss tills SE induceras. Om limbiska motoriska anfall som motsvarar steg 3 eller högre enligt Racines skala upptäcks, registrera tid och övervaka möss för att avgöra huruvida anfall inträffar oftare. När kontinuerlig motoriska anfall varar mer än 2 min, Placera musen i en ny bur vid rumstemperatur och hålla övervakning för 3 h att avgöra om deras krampanfall fortsätta och SE induceras. Avliva de möss som inte gick in SE på ca 2 h efter pilokarpin injektion.
Obs: Racines skala. etapp 1, munnen och ansiktet rörelse; etapp 2, huvud nickar; etapp 3, forelimb Klonus; etapp 4, uppfödning med forelimb Klonus; etapp 5, uppfödning och faller med forelimb Klonus16. Om musen inte överförs till buren i rumstemperatur omedelbart efter SE induktion, kan musen dö på grund av hypertermi. - Avsluta beteendemässiga akut anfall på 3 h efter SE debut genom att injicera diazepam lösning (i.p. 10 mg/kg 1 mL spruta; 30 G nål). Gör diazepam lösningen genom att späda ut 5 mg/mL av diazepam i 10% polyoxol 35 hydrerad ricinolja genom att lägga till saltlösning (i.p. 10 mL/kg 1 mL spruta; 30 G nål).
Obs: 10% polyoxol 35 hydrerad ricinolja lösning: 1 mL polyoxol 35 hydrerad ricinolja lösning + 9 mL koksaltlösning. Förvara lösningen i rumstemperatur. Till exempel om musen kroppsvikt 25 g, injicera 250 µL diazepam lösning: 50 µL 5 mg/mL diazepam + 200 µL 10% polyoxol 35 hydrerad ricinolja olja lösning = 250 µL 1 mg/mL diazepam. - För sham möss, utföra en i.p.-injektion av Skopolamin metylbromid och terbutalin hemisulfate blandningen (i.p.; båda 2 mg/kg, 1 mL spruta, 10 mL/kg; 30 G nål). 30 min senare, injicera saltlösning intraperitonealt (i.p. 10 mL/kg 1 mL spruta; 30 G nål).
Obs: Om musen kroppsvikt 25 g, injicera 250 µL saltlösning istället för pilokarpin. - Efter diazepam administrera injektionen (i.p.; 1 mL spruta 30 G nål), 1 mL 5% glukoslösning per enskilda mus (i.p., 1 mL spruta, 26 G nål).
Obs: 1 mL 5% glukos injektionsvätska ger energikälla och återfuktning som kan öka överlevnaden. - Under efter vård i inkubatorn (28-30 ° C), torka av överdriven sekret som saliv, tårar och avföring.
- Dag 1 efter SE induktion, väga möss och hålla dem i inkubatorn (28-30 ° C) för en extra dag. På dag 2, efter SE induktion, väga möss och återföra dem till deras hem bur. Ge fuktig chow för att underlätta deras återhämtning.
Obs: I detta experiment var dödligheten för C57BL/6NHsd efter SE uppsägning 8,57% i genomsnitt (3 ut i 35 möss testade). - Mäta dagligen kroppsvikt av djuren fram till 7 dagar efter pilokarpin och injicera möss med 5% glukoslösning (i.p., 1 mL spruta, 26 G nål) när kroppsvikten inte har ökat. Stoppa kroppen vikt övervakning när mössen börjar återfå kroppsvikt och konsumera fuktig chow utan svårighet 2 dagar efter pilokarpin injektionen.
Obs: Om en mus kroppsvikt inte ökade fram till 7 dagar post SE, utesluta musen från experimentet och eutanasi av koldioxid. Beroende på bakgrund av musen, kan döden ibland inträffa; dock när det gäller C57BL/6NHsd, mindre än 1% av mössen dog i dessa experiment. Med överlevnad på mer än 7 dagar efter SE induktion dör mössen sällan under perioden latent.
2. implantation kirurgi för Video-EEG övervakning
- Förbereda 12 veckor gamla möss (4 veckor efter SE induktion) att utföra telemetri implantation för övervakning av EEG.
Obs: Tidpunkten för implantation kan ändras beroende på de experimentella syften och mus-stammar. - Före operation, söva musen med en blandning (4:0.5) av ketamin (50 mg/mL) och xylazin (23,3 mg/mL) lösning upplöst i saltlösning i en dos på 2,5 µL/g kroppsvikt (i.p., 1 mL spruta, 26 G nål). Övervaka andningsfrekvens och andningsansträngning musen med jämna mellanrum (15 min intervall högsta) och bedöma djupet av anestesi av pedal tillbakadragande reflexen.
- Placera musen i en stereotaxic ram med örat barer och en bita platta och applicera vet salva på båda ögonen att undvika blindhet.
- För att upprätthålla sterila förhållanden under operationen, raka kirurgiska webbplatser med ett rakblad. Var noga med att förhindra päls kontaminering av operationsområdet. Efter rakning, desinficera huden med 70% etanol och jod lösning.
Obs: Kirurgi bör utföras på en aseptisk sätt bära sterila handskar och masker, med hjälp av steriliserad utrustning och aseptisk teknik. - Efter att ha bekräftat djupet av anestesi, göra en mittlinjen snitt i huden för att exponera skallen. Borra två burr hål med en borr som bifogas stereotaxic apparaten vid koordinaterna från Bregma i anteroposterior axel (AP): + 0,1 mm, mediolateral axel (ML): + 0,1 mm (referens) och AP: −0, 2 mm, ML: +0.22 mm (vänster parietala cortex)13.
- Torka av huden med PBS-indränkt bomull swappar, följt av 70% etanol och jod lösning. Gör ett längsgående snitt mitt i huvudet med sax för att exponera Lambda (den punkt där den sagittala och lambdoid suturen möts), Bregma (skärningspunkten av koronala suturen av sagittal suturen) och målplatsen.
- Identifiera anatomiska landmärken som Lambda och Bregma. Placera borren på Bregma och observera X, Y-koordinater för denna punkt.
- Använd en brain atlas böcker eller publicerade referenser för att avgöra lämpliga koordinaterna för regionerna i hjärnan för EEG inspelning. Sedan beräkna koordinaterna för skruvarna (referens och inspelning) med hjälp av Bregma koordinater mäts vid steg 2.5.2.
- Långsamt sänka borrkronan att göra ett burr hål är noga med att undvika att infoga borrkronan för långt vid den punkt där skallen blir tunnare.
- Infoga kroppen av den enda kanalen trådlös EEG sändare bakom nacken av hångla subkutant och placera flexibel leder nära skallen.
- Placera en rostfria skruv (längd 2 mm) i varje burr hål med pincett och dra åt den med en skruvmejsel genom medsols rotation. Kontrollera att skruven inte sitter för långt djupt genom att justera graden av skruv rotation för att förhindra skador på dura eller hjärnans vävnader.
- Remsa isolering pälsen 2 mm från spetsen av leder och sträcka tråden tillräckligt länge för att runda skruven axeln för en bra anslutning mellan tråd och skruven. Anslut referens till den främsta skruven och inspelning bly på skruven i parietala cortex. Applicera sedan, dentala cement för att säkra hela montaget på plats utan att utsätta metalldelarna.
- Efter att ha kontrollerat att dentala cement har torkat helt genom okulärbesiktning, suturera huden och tillämpa aktuell mupirocin-salva. Placera musen i en 30 ° C inkubator ensam tills det återhämtar sig från operationen (ca 30 min). Sedan återgå musen till buren tills kontinuerlig video-EEG övervakning börjar.
Obs: Efter operation injiceras varje mus (i.p., 1 mL spruta, 30 G nål) med 5 mg/kg av gentamicin (antibiotika) och 5 mg/kg av ketoprofen (analgetika). Djur bör övervakas tills de blir helt rörlig. Sändare-implanteras möss har en återhämtningsperiod på cirka 1 vecka.
3. video och EEG övervakning och analys
- Placera en mus i en enskild bur och placera buren ovanpå trådlös mottagare plattorna där Faraday bur är installerat för att undvika avbrott av elektriska signaler från alla källor, inklusive en dator, AC-linjer och intilliggande mottagare.
Obs: Se den bruksanvisning som tillhandahålls av tillverkaren. Var noga med att undvika blinda fläckar. - Registrera den elektriska aktiviteten med hjälp av trådlös video-EEG telemetri-systemet.
- Öppna programvaran för video-EEG inspelning. Klicka på ”maskinvara” och välj ”Redigera konfiguration”. Matcha mottagaren och sändaren implanteras i varje mus. Klicka på ”kanal konfiguration” och bekräfta alla kanaler är aktiva. Klicka på ”Video konfigurering” synkronisera video med EEG data (resolution av 40 x 480 och frame rate på 30.00).
Obs: Installera en IP-kamera med hög känslighet om är det viktigt att samla bra bildkvalitet som kan identifiera subtila beteendemässiga förändringar av mössen på natten. - Klicka på ”Setup” och ”P3 setup” till enskilda djur ingångsinformation, matchade kamera och Graf inställning.
- Klicka på ”förvärv” och ”A/D samplingsfrekvens” till setup samplingsfrekvenser. Klicka på ”Data set namn” att utse varje experiment.
Obs: Samplingsfrekvensen för EEG måste vara högre än 500 Hz. tack vare stor video och EEG datastorlek, det rekommenderas att endast 24 h data hanteras per session snarare än med en kontinuerlig 2-vecka-inspelning som en fil. Data kan sparas separat på 8 h eller 12 h intervall vid RAM minne. - Aktivera sändaren med magnetiska bar och klicka ”starta förvärv” att samla in video-EEG inspelningen. Kontinuerligt övervaka musen genom video-EEG systemet i minst 2 veckor.
Obs: För C57BL/6 möss tenderar SRS att inträffa i kluster som senast ca 5,2 dagar och varaktigheten av perioden som anfallsfria är ca 6,7 dagar17.
- Öppna programvaran för video-EEG inspelning. Klicka på ”maskinvara” och välj ”Redigera konfiguration”. Matcha mottagaren och sändaren implanteras i varje mus. Klicka på ”kanal konfiguration” och bekräfta alla kanaler är aktiva. Klicka på ”Video konfigurering” synkronisera video med EEG data (resolution av 40 x 480 och frame rate på 30.00).
- Fastställa beslag frekvens och varaktighet av manuell avsyning med hjälp av analys-programvara.
- Markera området visar SRS och exportera data för statistisk analys. Vara försiktig att utesluta EEG artefakter som kan genereras av skrapa huvudet eller tugga; dessa kan tas bort genom att kontrollera videodata.
Obs: SRS definieras som en plötslig repetitiva epileptiform tillsatta aktivitet (≥ 3 Hz) som kvarstår för mer än 10 s. krampaktig beteenden kan ofta kompletteras med en explosion av tillsatta aktivitet. Icke-krampanfall kan också Visa electrographic tillsatta aktiviteter utan krampaktig beteenden. Beslag uppsägning definieras som inträffar när bränning spikar tillbaka till baslinjen aktivitet. - För analys av anfallsfrekvens, dividera det totala antalet SRS-fall som påvisats under de 2 veckorna av det totala antalet inspelning dagar för varje enskilt djur.
- För analys av beslag varaktighet, mäta tiden från början till slutet av den epileptiform tillsatta aktiviteter.
- Markera området visar SRS och exportera data för statistisk analys. Vara försiktig att utesluta EEG artefakter som kan genereras av skrapa huvudet eller tugga; dessa kan tas bort genom att kontrollera videodata.
- Efter slutförandet av video-EEG inspelningen, fixa hjärnan med 4% PARAFORMALDEHYD av transcardial perfusion. Att söva musen, injicera en lösning (4:0.5) av ketamin (50 mg/mL) och xylazin (23,3 mg/mL) upplöst i saltlösning i en dos på 10 μL/g kroppsvikt (i.p., 1 mL spruta, 26 G nål). När musen är bekräftat att vara djupt sövd, utföra transcardial perfusion.
- Innan isolera mus hjärnan, Hämta sändaren från musen återanvändas efter rengöring.
- Ta bort den dentala cementen runt leads med hjälp av tången.
- Blötlägg spetsen leder med dentala cement i 100% aceton tills dentala cement är upplöst.
- Avlägsna vävnad föroreningar runt sändaren genom att skölja det med destillerat vatten.
- Skölj sändaren med 70% etanol för 3 h och luft torka för lagring. Omedelbart före nästa användning, skölj skruv och sändare med 70% etanol, följt av destillerat vatten och placera dem i saltlösning.
Obs: Var noga med att undvika skära flexibla kablar när man halshugger musen sen, om de flexibla ledarna är för kort, buller i nästa implantation och video-EEG inspelning kan öka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrika SE kan inducera Hippocampus celldöd och SRS (figur 1 och figur 2). Vi avslutade beteendemässiga akut anfall av diazepam injektion på 3 h efter SE uppkomsten och offrade mössen 7 dagar eller 6 veckor senare.
De möss som fick implantat kirurgi på 4 veckor efter SE för video-EEG övervakning, och SRS fall utvärderades i 2 veckor från 5-7 veckor efter SE uppkomsten.
Figur 1 visar cellen dödsfall i hippocampus bedömt tolyloxi violett missfärgning. 7 dagar efter SE upptäcktes pyknotiska celler i hilar regioner (figur 1Ad) dentate gyrus och den pyramidala celllagrar av CA3 delfältet av hippocampus (figur 1Af), medan intakt hippocampus observerades i sham djuren injiceras med saltlösning istället för pilokarpin (figur 1Aa-c). Intressant, djur som genomgick flera anfall, men misslyckades med att ange SE, visade ingen celldöd i regionen hilar eller det pyramidala celllagrar (figur 1Ag-i). 6 veckor efter SE observerades en markant minskning i antalet hilar celler (figur 1Bm). Dessutom neuronala förlust observerades i CA1 (figur 1Bn) och CA3 (figur 1Bo) regioner.
Figur 2 visar representativa EEG spår i sham och SE grupper (figur 2A). Jämfört med sham gruppen visar fysiologiska elektrisk aktivitet, SE gruppen ibland visade epileptiform utsläpp tillsammans med krampaktig beteenden. Platserna för epidural elektroderna illustreras i figur 2C. Figur 2 B visar ett exempel på de elektriska ljud från en intilliggande monitor och misslyckandet av signal collection. Vi visade även EEG spår av sham-manipulerade djur som visade spontana kramper under de 2 veckorna av video-EEG inspelning (figur 2E) och kortikala skador på perfusion, möjligen härstammar från överdrivet djup placering för epidural skruvarna (figur 2D).
Figur 1 : Neuronala dödsfall i hippocampus efter pilokarpin-inducerad SE. Representativa bilder från grupper av (A) 7 dagar och (B), 6 veckor efter pilokarpin eller saltlösning injektion. Förstorade bilder Visa hilus (a, j), CA1 delfältet (b, k) och CA3 delfältet (c, l) saltlösning-behandlade sham gruppen, hilus (d, m), CA1 delfältet (e, n) , och CA3 delfältet (f, o) av gruppen SE och hilus (g), CA1 delfältet (h) och CA3 delfältet (jag) av de möss som inte utvecklar sig. Black pilar i en, goch j anger några av de representativa hilar cellerna och pilspetsar i d och m anger pyknotiska celler. Skalstapeln i botten vänster sida = 200 µm, giltig för hela den lämnade de flesta kolumn, skalstapeln i a och c = 20 µm, gäller för hela mellersta kolumnen och högra kolumnen. Förkortningar i denna figur: CA1, CA3: Cornu Ammonis Hippocampus delfält; GD: Dentate gyrus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Video och EEG inspelning visar spontan återkommande anfall av epileptiska mus. (A) representativa EEG spår från sham-(överst) och SE-manipulerade djur (nederst). Observera att SE-betvingat djur visar epileptiform tillsatta aktivitet (≥ 3 Hz), inte utställda av sham djur. (B) en representativ bild av elektriska ljud och misslyckande i samlingen signal. Observera att hög amplitud unipolär spikar och utsättning av elektriska signaler. (C) Schematisk ritning av mus hjärnan med platser av elektroder. (D), två bilder som visar hjärnans intakt och skadad i cortex, möjligen på grund av överdrivet djup införande av epidural skruvar. Den svarta pilen i den högra bilden visar platsen för kortikala skadan. Skalstapeln = 250 µm. (E) representativa EEG spår av sham-manipulerade djur med eller utan hjärnskada. Observera att sham-manipulerade djur med kortikala skadan genererade tillsatta aktivitet och krampaktig SRS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver de experimentella procedurerna för SE induktion och utvärdering av kroniska kramper.
Flera faktorer kan påverka framgångsrika SE induktion. Korrekt beteendemässiga övervakning enligt Racine skala är avgörande för utveckling av SRS. Huvud nickar, forelimb Klonus, uppfödning, och faller är beteendemässiga kännetecken för akut anfall utvecklas till SE fas4,16. När det första motoriska beslaget upptäcks, längden på intervallet mellan de senare krampanfall minskar innan SE. Dessutom bör SE upprätthållas för minst 6 h om beteendemässiga anfall avslutas med diazepam5. Det är värt att notera att forskare bör vara medvetna om möjligheten som lidit beslag verksamhet kan upptäckas via electrocorticograms, även om beteendemässiga kramper verkar avta med diazepam injektion. Ökande omgivningstemperatur efter pilokarpin injektion tills SE induktion kan förbättra antalet djur med SE. Det är också viktigt att ge intensivvård efter beslag, inklusive tillräcklig återfuktning, näring och vikt övervakning för högre överlevnad än ca 70-80% i genomsnitt5,18. Beroende på djurets genetisk bakgrund, kan känslighet för pilokarpin variera. Om djur visar svår akut anfall med hög dödlighet, kan minskning av pilokarpin dosering, SE varaktighet, eller ökad Skopolamin och terbutalin vara till hjälp. Även svår SE är kända för att vara besläktade med högre incidens av SRS, med högre dödlighet, är det avgörande att beakta dessa faktorer. Hippocampus neuronala dödsfall är genomgående observerats efter SE. På 6 h post-SE varit omfattande förlust av hilar interneuroner rapporterade19. 7 dagar efter SE, pyramidal nervceller i CA3 delfältet vanligtvis dör och observeras kontinuerligt vid 6 veckor efter SE induktion, även om omfattningen av nervcellskador i pyramidal cell-lagret är variabel i möss. Neuronala förlust i CA1 delfältet av hippocampus kan också observeras ofta. Intressant, djur med multipla krampanfall som inte anger SE visade nästan intakt hippocampus liknande till gruppen sham, indikerande histologisk celldöd kan vara en bra markör för tillräckligt allvarliga akuta anfall.
På cirka 4 veckor efter SE, alla pilokarpin-behandlade C57BL/6NHsd möss blev epileptiska och visade SRS, visar en av stora förtjänar med denna modell. Eftersom kroniska kramper är grupperade, bör video-EEG registreras kontinuerligt i minst 2 veckor i stället för ibland, även om registreringsperiod kan ändras beroende på mus stammar eller försöksändamål17. Dessutom har spontana kramper i TLE dagaktiva variationer visar hög SRS frekvens i den sena eftermiddagen20. Praktiskt, för korrekt video-EEG inspelning behöver några källor inklusive AC linjer, datorer, kameror eller sändare implanterad i musen i intilliggande mottagaren vara blockerad. Installationen av Faradays bur och kameror med hög känslighet under dagen och natten kan minska elektriskt brus och hjälp att identifiera generaliserade kronisk anfall, respektive. Slutligen är det extremt viktigt att undvika hjärnskador när skruvarna placeras på ytan av dura mater som det kan generera missvisande EEG data. Även om SRS frekvensen inte var hög, generera några mekaniska kortikala skador genom påtvingad skruv krampanfall på bara en vecka.
Sammanfattningsvis, trots tiden begränsningar för modellering och kravet på djupgående utbildning för att utföra implantat operationer och EEG analys, är pilokarpin-inducerad SE en av de bästa modellerna för att studera kronisk epilepsi bland tillgängliga djur modeller av TLE. Här, beskriver vi en metod för att förmå SE efter pilokarpin injektion och bedömningen av kroniska kramper med hjälp av en trådlös telemetrisystem video-EEG. Vi tror att detta protokoll kan ge detaljerad information för lämplig djurmodeller för kronisk epilepsi och epileptogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Research Foundation i Korea (NRF) bidraget finansieras av den koreanska regeringen (NRF-2014R1A1A3049456) och ett bidrag från Korea hälsa teknik R & D projekt genom den Korea hälsa industri utveckling Institute (KHIDI), finansieras av ministeriet för hälsa & välfärd, Sydkorea (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Epilepsy. N Engl J Med. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 7 (4), 348-354 (2007).
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nat Rev Neurol. 5 (7), 380-391 (2009).
- Cavalheiro, E. A. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 16 (1-2), 33-37 (1995).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Prog Neurobiol. 73 (1), 1-60 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (10), 2887-2899 (2013).
- Sharma, A. K., et al. Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis, induced rodent models and lesions. Toxicol Pathol. 35 (7), 984-999 (2007).
- Hellier, J. L., Dudek, F. E. Chemoconvulsant model of chronic spontaneous seizures. Curr Protoc Neurosci. 9, Chapter 9 Unit 9 19 (2005).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic epilepsy. Epilepsy Behav. 14, Suppl 1 16-25 (2009).
- Mathern, G. W., Adelson, P. D., Cahan, L. D., Leite, J. P. Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyer's hypothesis revisited. Prog Brain Res. 135, 237-251 (2002).
- Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
- Brulet, R., Zhu, J., Aktar, M., Hsieh, J., Cho, K. O. Mice with conditional NeuroD1 knockout display reduced aberrant hippocampal neurogenesis but no change in epileptic seizures. Exp Neurol. 293, 190-198 (2017).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nat Commun. 6, 6606 (2015).
- Cavalheiro, E. A., Santos, N. F., Priel, M. R. The pilocarpine model of epilepsy in mice. Epilepsia. 37 (10), 1015-1019 (1996).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
- Hester, M. S., Danzer, S. C. Accumulation of abnormal adult-generated hippocampal granule cells predicts seizure frequency and severity. J Neurosci. 33 (21), 8926-8936 (2013).
- Shibley, H., Smith, B. N. Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice. Epilepsy Research. 49 (2), 109-120 (2002).
- Borges, K., et al. Neuronal and glial pathological changes during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model. Exp Neurol. 182 (1), 21-34 (2003).
- Pavlova, M. K., Shea, S. A., Bromfield, E. B. Day/night patterns of focal seizures. Epilepsy Behav. 5 (1), 44-49 (2004).
