Summary
Cet article décrit une méthode d’induction d’état de mal épileptique par injection systémique pilocarpine et du contrôle des convulsions récurrentes spontanées des animaux vivants à l’aide d’un système de l’électroencéphalogramme et de télémétrie sans fil vidéo. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes physiopathologiques de l’épilepsie chronique, épileptogenèse et les crises aiguës.
Abstract
Épilepsie du lobe temporal (TLE) est un trouble neurologique commun à l’âge adulte. Pour les études translationnelles d’épilepsie chronique, pilocarpine induite par l’état de mal épileptique (SE) est souvent choisi pour récapituler les convulsions récurrentes spontanées (SRS). Nous présentons ici un protocole d’induction SE par injection intrapéritonéale (i.p.) de pilocarpine et le suivi des chroniques convulsions récurrentes des animaux vivants à l’aide d’un électroencéphalogramme (EEG) système et télémétrie sans fil vidéo. Nous avons démontré des changements comportements notables qui ont besoin d’attention après injection de pilocarpine et leur corrélation avec la perte neuronale hippocampique à 7 jours et la pilocarpine après 6 semaines. Nous décrivons également les procédures expérimentales de l’implantation d’électrodes pour la vidéo et l’enregistrement de l’EEG et analyse de la fréquence et la durée des crises récurrentes chroniques. Finalement, nous discutons les raisons pouvant expliquer pourquoi les résultats attendus ne sont pas atteints dans chaque cas. Ceci fournit un aperçu de la modélisation d’une épilepsie chronique chez les souris et les lignes directrices pour le dépannage. Nous croyons que ce protocole peut servir de référence pour des modèles appropriés d’épilepsie chronique et épileptogenèse.
Introduction
TLE est l’un des plus communs acquis les épilepsies1. Personnes souffrant d’épilepsie l’expérience des crises récurrentes à la suite des activités neuronales anormales dans le cerveau2,3. Étant donné que TLE est souvent insoluble, il est crucial de comprendre les mécanismes fondamentaux qui sous-tendent le développement de l’épilepsie.
Des modèles animaux qui peuvent récapituler les caractéristiques clés de TLE humaine peuvent offrir mieux apprécier physiopathologie TLE, ce qui nous permet de facilement contrôler et manipuler les facteurs critiques épileptogenèse. Parmi eux, S’induite par le chemoconvulsants a été largement utilisé4,5. Contrairement aux autres modèles de l’épilepsie, telles que la stimulation électrique qui montre sans sclérose hippocampique et SRS robuste6,7,8, l’injection systémique de chemoconvulsants peut imiter les clinique pathogenèse des ELT humaine, c'est-à-dire, lésions cérébrales initiales, une période de latence et une épilepsie chronique scène manifestant SRS5,9,10. Par conséquent, cette technique peut être utilisée dans diverses études expliquant les mécanismes de la lésion cérébrale aiguë, épileptogenèse ou suppression de la saisie. En outre, altérations histopathologiques induites par chemoconvulsants sont semblables à ceux observés chez les humain TLE, fournissant une justification supplémentaire pour utilisation de TLE modèles de rongeurs10,11,12. Notamment, des dommages structuraux impliquant l’hippocampe ont été systématiquement reproduites dans les deux modèles d’acide pilocarpine induite et SE kaïnique. Toutefois, par rapport à l’injection acide kaïnique, le modèle pilocarpine peut produire SRS plus robuste chez les souris, qui peuvent offrir des avantages assez importantes pour l’étude de l’épilepsie chronique lorsqu’on examine la disponibilité large des lignées de souris transgéniques5, 13 , 14 , 15. en outre, la progression de saisie après injection de pilocarpine est généralement plus rapide que dans le modèle acide kaïnique, fournissant des éléments de preuve supplémentaires pour l’utilisation efficace d’un modèle de pilocarpine d’épilepsie.
Ici, nous démontrons une méthode d’induction SE par l’injection intrapéritonéale de la pilocarpine et en effectuant des vidéo et EEG suivi dans l’épilepsie chronique.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université catholique de Corée et ont été effectuées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications n° 80-23).
1. SE Induction
- Acheter souris C57BL/6NHsd mâles de 8 semaines et pèsent chacune des souris. Ensuite, utilisez un stylo marqueur pour marquer les queues des souris pour leur faciliter l’identification durant l’induction SE.
- Calculer la quantité de bromure de méthyle de scopolamine (scopolamine ; 2 mg/kg), hemisulfate de terbutaline (terbutaline ; 2 mg/kg) et le chlorhydrate de pilocarpine (pilocarpine ; 280 mg/kg) selon le poids de la souris et ajouter une solution saline (0,9 % NaCl, 10 mL/kg) pour faire des solutions.
Remarque : Par exemple, si le poids de la souris est 25 g, les montants suivants sont appliqués : Scopolamine et terbutaline : 2 mg/kg * (25 g/1 000 g) = 0,05 mg, solution Saline : 10 mL/kg * (25 g/1 000 g) = 0,25 mL, Pilocarpine : 280 mg/kg * (25 g/1 000 g) = 7 mg , Saline : 10 mL/kg * (25 g/1 000 g) = 0,25 mL. - Charger le mélange scopolamine et terbutaline dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G. Injecter la solution par voie intrapéritonéale dans chaque souris et puis retournez les souris dans leur cage. À 30 min après l’administration de scopolamine et terbutaline, injecter la solution de la pilocarpine dans chaque souris (i.p., seringue de 1 mL, aiguille 30 G). Immédiatement après l’injection de la pilocarpine, placez les souris dans un incubateur (28-30° C) pour l’observation.
- Surveiller attentivement le comportement des souris jusqu'à ce que S’est induite. Si limbiques saisies moteurs correspondant à l’étape 3 ou supérieur selon l’échelle de Racine sont détectés, enregistrer le temps et surveiller les souris pour déterminer si les crises se produisent plus fréquemment. Une fois saisies moteurs continus durent plus de 2 min, placer la souris dans une nouvelle cage à température ambiante et garder le contrôle pendant 3 h déterminer si leurs crises convulsives continuent et S’est induite. Euthanasier les souris qui n’a pas pu entrer SE à environ 2 h après l’injection de la pilocarpine.
Remarque : Échelle de racine ; étape 1, la bouche et les mouvements du visage ; étape 2, tête, hochant la tête ; étape 3, clonus membres antérieurs ; étape 4, élevage avec clonus membres antérieurs ; étape 5, élevage et tombant avec des membres antérieurs clonus16. Si la souris n’est pas transférée à la cage à la température ambiante immédiatement après l’induction SE, la souris peut mourir à cause de l’hyperthermie. - Résilier comportementales crises aiguës à 3 h après le début SE par l’injection de solution de diazépam (i.p., 10 mg/kg, seringue de 1 mL ; aiguille 30 G). Faire la solution de diazépam en diluant 5 mg/mL de diazépam pour polyoxyl 10 % huile de ricin hydrogénée 35 en ajoutant une solution saline (i.p., 10 mL/kg, seringue de 1 mL ; aiguille 30 G).
Note : solution de huile de ricin polyoxyl 10 % 35 hydrogéné : 1 mL de solution d’huile de ricin hydrogénée 35 polyoxyl + 9 mL de solution saline. Conserver la solution à température ambiante. Par exemple, si le poids de corps de la souris est de 25 g, injecter 250 µL de solution de diazépam : 50 diazepam 5 mg/mL µL + ricin hydrogénée de polyoxyl 10 % 35 200 µL d’huile solution = diazépam de 1 mg/mL 250 µL. - Pour les souris de l’imposture, effectuer une injection intrapéritonéale du bromure de méthyle et terbutaline mélange hemisulfate scopolamine (i.p. ; les deux 2 mg/kg, seringue de 1 mL, 10 mL/kg ; aiguille 30 G). 30 min plus tard, injecter la solution saline par voie intrapéritonéale (i.p., 10 mL/kg, seringue de 1 mL ; aiguille 30 G).
Remarque : Si le poids de corps de la souris est de 25 g, injecter 250 µL de solution saline au lieu de pilocarpine. - Après l’injection de diazépam (i.p., seringue de 1 mL, aiguille 30 G), administrer 1 mL de dextrose 5 % par les souris (i.p., seringue de 1 mL, aiguille de 26 G).
Note : 1 mL de l’injection de dextrose 5 % donne source d’énergie et d’hydratation qui peut augmenter le taux de survie. - Au cours de soins post dans l’incubateur (28-30 ° C), essuyez les sécrétions excessives comme la salive, les larmes et les fèces.
- Au jour 1 après l’induction SE, peser les souris et gardez-les dans l’incubateur (28-30 ° C) pendant une journée supplémentaire. Au jour 2, après l’induction SE, peser les souris et les retourner à leur domicile cage. Fournir des chow humide afin de faciliter leur récupération.
Remarque : Dans cette expérience, le taux de mortalité pour C57BL/6NHsd après résiliation SE fut 8,57 % en moyenne (3 sur des 35 souris testés). - Mesurer tous les jours du poids corporel des animaux jusqu'à la pilocarpine après 7 jours et injecter les souris avec dextrose 5 % (seringue de 1 mL, i.p. ; aiguille 26 G) lorsque le poids corporel n’a pas augmenté. Cesser de corps poids surveiller quand les souris commencent à reprendre du poids du corps et consommer chow humide sans difficulté à 2 jours après l’injection de la pilocarpine.
Remarque : Si le poids du corps d’une souris n’a pas augmenté jusqu'à 7 jours post SE, exclure la souris de l’expérimentation et euthanasier de dioxyde de carbone. Selon le fond de la souris, la mort peut occasionnellement survenir ; Cependant, dans le cas de C57BL/6NHsd, moins de 1 % des souris sont morts lors de ces expériences. Avec une survie de plus de 7 jours après l’induction SE, les souris meurent rarement au cours de la période de latence.
2. implantation chirurgicale pour la surveillance de vidéo-EEG
- Préparer des souris 12 semaines (4 semaines après l’induction SE) pour effectuer l’implantation de télémétrie pour la surveillance EEG.
Remarque : Calendrier d’implantation peut être modifié selon les fins expérimentales et les souches de souris. - Avant la chirurgie, anesthésier la souris avec un mélange (4:0.5) de kétamine (50 mg/mL) et de xylazine (23,3 mg/mL) solution dissoute dans une solution saline à la dose de 2,5 µL/g de poids corporel (i.p., seringue de 1 mL, aiguille de 26 G). Surveiller la fréquence respiratoire et l’effort respiratoire de la souris à intervalles réguliers (intervalle de 15 minutes maximum) et d’évaluer la profondeur de l’anesthésie par le réflexe de retrait pédale.
- Placez la souris dans un cadre stéréotaxique avec barres d’oreilles et une plaque de morsure et pommade vétérinaire sur les deux yeux pour éviter la cécité.
- Pour maintenir des conditions stériles pendant la chirurgie, raser des sites chirurgicaux à l’aide d’une lame de rasoir. Veillez à éviter toute contamination de la fourrure du champ chirurgical. Après le rasage, désinfecter la peau avec solution à 70 % d’éthanol et de l’iode.
Remarque : La chirurgie doit être effectuée de façon aseptique, porter des gants stériles et masques, à l’aide de matériel stérilisé et des techniques aseptiques. - Après la confirmation de la profondeur de l’anesthésie, faire une incision médiane de la peau pour exposer le crâne. Deux bavures percer avec un foret joint à l’appareil stéréotaxique au point de coordonnées de la Bregma dans l’axe antéro-postérieur (AP) : +0,1 mm, axe médio-latérale (ML) : +0,1 mm (référence) et AP : −0, 2 mm, ML : +0,22 mm (cortex pariétal gauche)13.
- Essuyer la peau avec des swaps de coton imbibé de PBS, suivie de la solution à 70 % d’éthanol et de l’iode. Faire une incision longitudinale au milieu de la tête avec des ciseaux pour exposer le Lambda (le point où se rencontrent la sagittale et la suture lambdoïde), le Bregma (au point d’intersection de la suture coronale de la suture sagittale) et l’emplacement cible.
- Identifier des repères anatomiques tels que Lambda et Bregma. Placez la mèche au Bregma et note le X, Y coordonne pour ce point.
- Utiliser un cerveau atlas livres ou publié des références pour déterminer les coordonnées appropriées des régions cérébrales pour l’enregistrement de l’EEG. Puis, calculer les coordonnées des vis (référence et enregistrement) en utilisant les coordonnées de Bregma mesuréà étape 2.5.2.
- Abaissez lentement la mèche pour faire un trou de trépan en prenant soin d’éviter d’insérer la mèche trop loin à l’endroit où le crâne devient plus mince.
- Insérer le corps de la monocanal sans fil émetteur EEG derrière la nuque par voie sous-cutanée, placer le flexible conduit près du crâne.
- Placer une vis inox (2 mm de longueur) dans chaque trou de trépan avec des pincettes et serrez-le à l’aide d’un tournevis par rotation vers la droite. Assurez-vous que la vis n’est pas insérée trop bien profondément par le degré de rotation de la vis de réglage afin d’éviter d’endommager les tissus du cerveau ou de la dure-mère.
- Dépouillez le manteau isolant 2 mm de l’extrémité du conduit et étirer le fil assez longtemps pour compléter l’arbre de vis pour une bonne connexion entre le fil et la vis. Connectez le fil de référence pour la vis avant et l’enregistrement à la vis dans le cortex pariétal. Ensuite, appliquez un ciment dentaire pour fixer l’ensemble en place sans exposer les parties métalliques.
- Après avoir vérifié que le ciment dentaire a complètement séché par inspection visuelle, suture de la peau et appliquer la pommade mupirocine topique. Placez votre souris dans une étuve à 30 ° C seul jusqu'à ce qu’il se remet de la chirurgie (environ 30 min). Ensuite, retourner la souris à la cage jusqu'à ce que la surveillance de vidéo-EEG continu commence.
Remarque : Après l’opération, chaque souris sont injecté (i.p., seringue de 1 mL, aiguille 30 G) avec 5 mg/kg de gentamicine (antibiotiques) et 5 mg/kg de kétoprofène (analgésiques). Animaux doit être surveillés jusqu'à ce qu’elles deviennent pleinement ambulants. Émetteur-implanté les souris ont une période de récupération d’environ 1 semaine.
3. jeux vidéo surveillance EEG et analyse
- Placer une souris dans une cage individuelle et la cage sur le dessus des plaques de récepteur sans fil où la cage de Faraday est installée pour éviter l’interruption des signaux électriques de toutes les sources dont un ordinateur, lignes ca et récepteurs adjacents.
Remarque : Consultez le manuel fourni par le fabricant. Il faut éviter les angles morts. - Enregistrer l’activité électrique en utilisant le système de télémétrie de vidéo-EEG sans fil.
- Ouvrez le logiciel pour l’enregistrement de vidéo-EEG. Cliquez sur « Matériel » puis sélectionnez « Editer la configuration ». Correspondre le récepteur et l’émetteur implanté dans chaque souris. Cliquez sur « Channel configuration » et vérifiez que tous les canaux sont actifs. Cliquez sur « Configuration de la vidéo » pour synchroniser la vidéo avec les données de l’EEG (résolution de 40 x 480 et la cadence de 30,00).
Remarque : Installez une caméra IP avec la sensibilité élevée s’il est essentiel de recueillir des qualités de bonne image qui identifient les subtils changements de comportement des souris pendant la nuit. - Cliquez sur « Setup » et « P3 setup » pour information animale individuelle d’entrée, une caméra apparié et graphique.
- Cliquez sur « Acquisition » et « A/fréquence d’échantillonnage de D » aux fréquences d’échantillonnage d’installation. Cliquez sur « Data set name » pour désigner chaque expérience.
Remarque : Fréquence d’échantillonnage pour EEG doit être supérieur à 500 Hz. en raison de la grande vidéo et la taille de données EEG, il est recommandé que seuls 24 h de données sont gérées par session plutôt que d’utiliser 2-semaine-enregistrement continu en un seul fichier. Données peuvent être enregistrées séparément à intervalles de 8 heures ou 12 heures en cas de manque de mémoire RAM. - Activer l’émetteur avec un barreau magnétique, puis cliquez sur « Start acquisition » pour recueillir l’enregistrement de vidéo-EEG. Surveiller en permanence la souris par le système de vidéo-EEG pendant au moins 2 semaines.
Remarque : Chez les souris C57BL/6, SRS a tendance à se produire dans les clusters que dernière environ 5,2 jours et la durée de la période exempte de saisie est d’environ 6,7 jours17.
- Ouvrez le logiciel pour l’enregistrement de vidéo-EEG. Cliquez sur « Matériel » puis sélectionnez « Editer la configuration ». Correspondre le récepteur et l’émetteur implanté dans chaque souris. Cliquez sur « Channel configuration » et vérifiez que tous les canaux sont actifs. Cliquez sur « Configuration de la vidéo » pour synchroniser la vidéo avec les données de l’EEG (résolution de 40 x 480 et la cadence de 30,00).
- Déterminer la fréquence des crises et la durée de l’inspection manuelle en utilisant le logiciel d’analyse.
- Délimiter la zone montrant SRS et exporter les données pour l’analyse statistique. Soyez prudent d’exclure les artefacts d’EEG qui peuvent être générés par se gratter la tête ou à chiquer ; ils peuvent être supprimés en vérifiant les données vidéo.
Remarque : SRS est définie comme l’apparition soudaine d’épileptiforme répétitive activité de fortification (≥ 3 Hz) qui continue d’exister pour plus de 10 s. comportements convulsifs peuvent se faire accompagner fréquemment dans un sursaut d’activité de fortification. Crises convulsives-non peuvent démontrer aussi électrographiques activités dopage sans comportements convulsifs. Fin de saisie est définie comme le moment où les pointes de cuisson retournent à activité basale. - Pour l’analyse de la fréquence des crises, divisez le nombre total de cas SRS détectés durant les 2 semaines par le nombre total de jours d’enregistrement pour chaque animal.
- Pour l’analyse de la durée de la saisie, mesurer le temps de l’apparition à la fin de l’épileptiforme activités de fortification.
- Délimiter la zone montrant SRS et exporter les données pour l’analyse statistique. Soyez prudent d’exclure les artefacts d’EEG qui peuvent être générés par se gratter la tête ou à chiquer ; ils peuvent être supprimés en vérifiant les données vidéo.
- Après l’achèvement de l’enregistrement de vidéo-EEG, fixer le cerveau avec 4 % paraformaldéhyde par perfusion de transcardial. Pour anesthésier la souris, injecter une solution (4:0.5) de kétamine (50 mg/mL) et de xylazine (23,3 mg/mL) dissous dans une solution saline à la dose de 10 μL/g de poids corporel (i.p., seringue de 1 mL, aiguille de 26 G). Une fois que la souris est confirmée pour être profondément anesthésiés, effectuer une perfusion transcardial.
- Avant d’isoler le cerveau de souris, récupérer l’émetteur de la souris pour être réutilisés après nettoyage.
- Enlever le ciment dentaire autour des prospects à l’aide de pinces.
- Tremper l’extrémité du conduit avec du ciment dentaire dans l’acétone 100 % jusqu'à ce que le ciment dentaire est dissoute.
- Retirer les contaminants des tissus autour de l’émetteur en les rinçant avec de l’eau distillée.
- Rincer l’émetteur avec l’éthanol à 70 % pour 3 h et l’air sec il pour le stockage. Immédiatement avant la prochaine utilisation, rincer la vis et l’émetteur avec l’éthanol à 70 %, suivie de l’eau distillée et placez-les dans une solution saline.
Remarque : Il faut pour éviter de couper les fils souples en décapitant la souris depuis, si les câbles souples sont trop courtes, le bruit dans la prochaine implantation et l’enregistrement de vidéo-EEG peut augmenter.
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Representative Results
SE réussie peut induire la mort des cellules hippocampiques et SRS (Figure 1 et Figure 2). Nous terminé comportementales aiguës saisies par injection de diazépam à 3 h après le début SE et sacrifié les souris 7 jours ou 6 semaines plus tard.
Pour la surveillance de vidéo-EEG, les souris ont reçu l’implant chirurgie à 4 semaines après SE et cas SRS ont été évalués pendant 2 semaines de 5 à 7 semaines après l’apparition SE.
La figure 1 illustre les décès de cellules dans l’hippocampe évalué par coloration au violet de crésyle. À 7 jours après SE, pycnotiques cellules ont été détectés dans les régions de hile (Figure 1Ad) le gyrus denté et la couche de cellules pyramidales du sous-champ CA3 de l’hippocampe (Figure 1Af), tandis que l’hippocampe intact a été observée chez les animaux de sham injectés avec du sérum physiologique au lieu de pilocarpine (Aa-cdela Figure 1). Fait intéressant, les animaux qui ont subi plusieurs crises, mais a échoué à entrer dans SE, ont montré aucune mort cellulaire dans la région du hile ou la couche de cellules pyramidales (Ag-idela Figure 1). À 6 semaines après SE, on a observé une réduction marquée du nombre de cellules Hilaire (Figure 1Bm). En outre, la perte neuronale a été observée dans la région CA1 (Figure 1Bn) et CA3 (Figure 1Bo) régions.
La figure 2 montre les traces EEG représentatives dans les trompe-l'œil et les groupes SE (Figure 2A). Par rapport à du groupe fictif montrant l’activité électrique physiologique, le groupe montrait parfois des décharges épileptiformes accompagnées de comportements convulsifs. Les emplacements des électrodes épidurales sont illustrées à la Figure 2C. Figure 2 B montre un exemple des bruits électriques d’un moniteur adjacent et l’échec de la collection de signal. Nous avons aussi démontré traces EEG des animaux actionnés par l’imposture qui a montré des saisies spontanées pendant les 2 semaines d’enregistrement vidéo-EEG (Figure 2A) et trouvé des lésions corticales à perfusion, peut-être dérivée de la mise en place trop profonde des vis épidurales (Figure 2D).
Figure 1 : La mort neuronale dans l’hippocampe après SE induite par la pilocarpine. Images représentant des groupes de (A) 7 jours et (B), 6 semaines après l’injection de pilocarpine ou de sérum physiologique. Images grossies montrent le hile (a, j), CA1 sous-champ (b, k) et sous-champ CA3 (c, l) du groupe fictif imprégnées d’une solution saline, le hile (d, m), CA1 sous-champ (e, n) et le sous-champ CA3 (f, o) du groupe SE et le hile (g), CA1 sous-champ (h) et sous-champ CA3 (j’ai) des souris qui ne développent pas de flèches SE. Black dans un get j indiquer certaines cellules Hilaire représentatifs, et pointes de flèches en d et m indiquent les cellules pycnotiques. Barre d’échelle en bas à gauche = 200 µm, valable pour l’ensemble de la gauche plus colonne, barre d’échelle dans a et c = 20 µm, valable pour l’ensemble colonne du milieu et la colonne de droite. Abréviations dans cette figure : CA1, CA3 : Cornu Ammonis hippocampe sous-champs ; DG : Gyrus denté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Enregistrement vidéo et EEG montre des convulsions récurrentes spontanées chez la souris épileptique. (A) représentant EEG retrace de sham-(en haut) et les animaux SE-manipulé (en bas). Remarquer que les animaux SE-soumis épileptiforme activité de fortification (≥ 3 Hz), non exposées par les animaux de l’imposture. (B) une image représentative des bruits électriques et l’échec de la collection de signal. Remarque les pointes unipolaire de forte amplitude et l’arrêt des signaux électriques. (C) schéma du cerveau de souris avec l’emplacement des électrodes. (D), deux images montrant le cerveau intact et blessé dans le cortex, probablement à cause d’insertion trop profonde des vis péridurales. La flèche noire à l’image de droite indique le site de lésions corticales. Echelle = 250 µm. (E) représentant EEG traces d’animaux actionnés par l’imposture avec ou sans lésion cérébrale. Notez qu’actionnés par l’imposture des animaux avec des lésions corticales généré activité de fortification et SRS convulsif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cet ouvrage décrit les procédures expérimentales pour l’induction SE et l’évaluation des crises chroniques.
Plusieurs facteurs peuvent affecter l’induction SE réussie. La surveillance comportementale précise selon l’échelle de la Racine est critique pour le développement du SRS. Tête en hochant la tête, clonus du membre antérieur, élevage et en baisse sont les caractéristiques comportementales des crises aiguës se développant en phase SE4,16. Une fois la première saisie de moteur est détectée, la longueur de l’intervalle entre les plus tard crises convulsives diminue avant d’entrer dans SE. Par ailleurs, SE doit être maintenue pendant au moins 6 h sauf si des crises comportementales sont terminent par diazépam5. Il est à noter que les chercheurs doivent être conscients de la possibilité que subi saisie activités peuvent être détectées par l’intermédiaire d’electrocorticograms, même si des crises comportementales semblent s’estomper avec l’injection de diazépam. Augmentation de la température ambiante après injection de pilocarpine jusqu'à ce que l’induction peut grandement améliorer le nombre d’animaux avec soi. Il est également important d’offrir des soins après saisie intensive, notamment une hydratation suffisante, soutien nutritionnel et poids de surveillance pour les taux de survie supérieurs à environ 70-80 % en moyenne de5,18. Selon le bagage génétique de l’animal, sensibilité à la pilocarpine peut différer. Si animaux affiche des crises aiguës graves avec une mortalité élevée, la réduction de la posologie de pilocarpine, durée SE, ou accrue de scopolamine et terbutaline peut être utile. Alors que SE grave est connu pour être liés à la hausse de fréquence des SRS, avec une mortalité plus élevée, il est crucial de tenir compte de ces facteurs. Mort neuronale hippocampique est constamment observés après SE. À 6 h post-soi, une perte importante des interneurones Hilaire a été rapporté19. À 7 jours après SE, neurones pyramidaux dans le sous-champ CA3 typiquement meurent et sont continuellement observés à 6 semaines après l’induction SE, bien que l’étendue des dommages neuronaux dans la couche de cellules pyramidales est variable chez la souris. La perte de neurones dans le sous-champ de CA1 de l’hippocampe peut également être observée fréquemment. Fait intéressant, les animaux avec des saisies multiples qui n’entrent pas dans SE montre hippocampe presque intact semblable à du groupe fictif, indiquant la mort cellulaire histologique peut être un bon marqueur de crises aiguës suffisamment graves.
Environ 4 semaines après SE, toutes les souris C57BL/6NHsd pilocarpine est devenu épileptiques et SRS ont montré, illustrant l’une des principales mérite à l’aide de ce modèle. Puisque les crises chroniques sont groupés, la vidéo-EEG devrait être enregistrée en continu pendant au moins 2 semaines, plutôt que par intermittence, même si la durée d’enregistrement peut être modifiée selon les souches de souris ou des fins expérimentales,17. En outre, spontanées saisies en TLE ont des variations diurnes, démontrant la haute fréquence SRS dans l’après-midi fin des années20. Pratiquement, pour l’enregistrement de vidéo-EEG précis, toutes les sources y compris les lignes AC, ordinateurs, appareils photo ou émetteurs implantés chez la souris dans le récepteur adjacente doivent être bloqué. L’installation de la cage de Faraday et de caméras à haute sensibilité pendant la journée et la nuit peut diminuer les bruits électriques et aide à identifier généralisée des crises chroniques, respectivement. Enfin, il est extrêmement important d’éviter des dommages au cerveau lorsque les vis sont placées sur la surface de la dure-mère, tel qu’il peut générer des données EEG trompeuses. Bien que la fréquence SRS n’était pas élevée, toute lésions corticales mécaniques par l’insertion de vis forcé pourraient générer des crises convulsives en seulement une semaine.
En conclusion, malgré le temps des contraintes pour la modélisation et l’exigence d’une formation approfondie pour effectuer l’implant cabinets de consultation et d’analyse de l’EEG, la S’induite par la pilocarpine est l’un des meilleurs modèles pour l’étude épilepsie chronique chez les animaux actuellement disponible modèles d’ELT. Nous décrivons ici une méthode d’induction SE après injection de pilocarpine et évaluer des crises chroniques à l’aide d’un système de vidéo-EEG de télémétrie sans fil. Nous croyons que ce protocole peut fournir des informations détaillées pour des modèles animaux appropriés pour l’épilepsie chronique et épileptogenèse.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation de recherche National de Corée (NRF) financé par le gouvernement coréen (FRO-2014R1A1A3049456) et une subvention de la Corée Health Technology R & D Project à travers la Corée santé Industrie développement Institut (KHIDI), financé par le ministère de la santé et du bien-être social, République de Corée (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
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