Summary
Dit manuscript wordt een methode van het inducerende status epilepticus door systemische pilocarpine injectie en de bewaking van spontane recidiverende aanvallen in levende dieren met behulp van een draadloze telemetrie video en electroencephalogram systeem beschreven. Dit protocol kan worden gebruikt voor het bestuderen van de pathofysiologische mechanismen van chronische epilepsie, epileptogenese en acute aanvallen.
Abstract
Temporale kwab epilepsie (TLE) is een gemeenschappelijk neurologische stoornis in de volwassenheid. Voor translationeel onderzoek naar chronische epilepsie, is pilocarpine-geïnduceerde status epilepticus (SE) vaak geselecteerd om te recapituleren van spontane recidiverende aanvallen (SRS). Hier presenteren we een protocol van SE inductie door intraperitoneaal (i.p.) injectie van pilocarpine en monitoring van chronische terugkerende aanvallen in levende dieren met behulp van een draadloze telemetrie video en electroencephalogram (EEG) systeem. We toonden opmerkelijke gedragsveranderingen die aandacht nodig na pilocarpine injectie en hun correlatie met hippocampal neuronale verlies op 7 dagen en 6 weken na pilocarpine hebben. Ook beschrijven we de experimentele procedures elektrode innesteling voor video en EEG opname en analyse van de frequentie en de duur van de chronische recidiverende aanvallen. Tot slot bespreken we de mogelijke redenen waarom de verwachte resultaten niet worden bereikt in elk geval. Dit biedt een basisoverzicht van het modelleren van chronische epilepsie in muizen en richtlijnen voor het oplossen van problemen. Wij geloven dat dit protocol kan dienen als referentie voor het geschikte modellen van chronische epilepsie en epileptogenese.
Introduction
TLE is één van de meest voorkomende verworven epilepsies1. Mensen met epilepsie ervaren terugkerende aanvallen als gevolg van abnormale neuronale activiteiten in de hersenen2,3. Gezien het feit dat TLE vaak hardnekkig is, is het van cruciaal belang om te begrijpen van de fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van epilepsie.
Dierlijke modellen die de belangrijkste kenmerken van menselijke TLE kunnen recapituleren bieden betere waardering van TLE pathofysiologie, waardoor wij gemakkelijk controleren en manipuleren van de kritische factoren in epileptogenese. Onder hen is de chemoconvulsants-geïnduceerde SE gebruikte4,5. In tegenstelling tot andere epilepsie-modellen, zoals elektrische stimulatie waaruit blijkt van geen hippocampal sclerose en robuuste SRS6,7,8, kan de systemische injectie van chemoconvulsants na te bootsen klinische pathogenese van menselijke TLE, dat wil zeggen, eerste hersenletsel, een latente periode en een chronische epileptisch etappe manifesting SRS5,-9,10. Daarom is deze techniek kan worden gebruikt in verschillende studies uit te leggen de mechanismen van acute schade aan de hersenen, epileptogenese of inbeslagneming onderdrukking. Bovendien zijn histopathologische veranderingen geïnduceerd door chemoconvulsants vergelijkbaar met die in de menselijke TLE, die een extra reden voor gebruik van TLE knaagdier modellen10,11,12. Met name hebben structurele schade waarbij de hippocampus consequent weergegeven in beide kainic zuur - en pilocarpine-geïnduceerde SE modellen. Echter kan in vergelijking met kainic zuur injectie, het pilocarpine model produceren meer robuuste SRS in muizen, die aanzienlijke voordelen aanbieden kunnen voor het bestuderen van chronische epilepsie bij het overwegen van de brede beschikbaarheid van transgene muis lijnen5, 13 , 14 , 15. Bovendien, inbeslagneming progressie na pilocarpine injectie is over het algemeen sneller dan in het kainic zuur model, extra bewijze voor doeltreffend gebruik van een pilocarpine model van epilepsie.
Wij tonen hier, een methode van inducerend SE door het i.p. injectie van pilocarpine en door het uitvoeren van video- en EEG-monitoring bij chronische epilepsie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Katholieke Universiteit van Korea en werden uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (NIH publicaties nr. 80-23).
1. de SE inductie
- Koop 8-week-oude mannelijke C57BL/6NHsd muizen en weeg elke muis. Gebruik vervolgens een viltstift markeren de staarten van alle muizen voor hun gemakkelijke identificatie tijdens SE inductie.
- Berekent het bedrag van methylbromide scopolamine (scopolamine; 2 mg/kg), terbutaline hemisulfate (terbutaline; 2 mg/kg) en pilocarpine hydrochloride (pilocarpine; 280 mg/kg) gebaseerd op het gewicht van de muis en voeg zoutoplossing (0,9% NaCl, 10 mL/kg) aan het maken van oplossingen.
Opmerking: Bijvoorbeeld, als het gewicht van de muis 25 g is, de volgende bedragen worden toegepast: Scopolamine en terbutaline: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0,05 mg, Saline: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL, Pilocarpine: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg , Zoute: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL. - Laad de scopolamine en terbutaline mengsel in een injectiespuit 1 mL met een naald 30 G. De oplossing van intraperitoneally injecteren met elke muis en de muizen dan terug te keren naar hun kooien. Op 30 min na toediening van scopolamine en terbutaline, door pilocarpine oplossing te injecteren in elke muis (spuit van 1 mL, i.p.; 30 G naald). Onmiddellijk na pilocarpine injectie, plaats u de muizen in een incubator (28-30° C) voor observatie.
- Zorgvuldig toezicht houden op het gedrag van de muizen totdat de SE wordt geïnduceerd. Als limbische motor vangsten die met stadium 3 of hoger van Racine verdeeld corresponderen worden gedetecteerd, neem de tijd en controleren van de muizen om te bepalen of de aanvallen zich vaker voordoen. Zodra continu motor vangsten meer dan 2 min laatste, plaatst u de muisaanwijzer in een nieuwe kooi bij kamertemperatuur en houd toezicht gedurende 3 uur om te bepalen of hun convulsive aanvallen blijven en SE wordt geïnduceerd. Euthanaseren van de muizen die niet Voer SE ongeveer 2 uur na pilocarpine injectie.
Opmerking: Racine van de schaal; fase 1, mond en gezicht verkeer; fase 2, hoofd knikken; stadium 3, voorpoot clonus; fase 4, fokken met voorpoot clonus; fase 5, fokken en vallen met voorpoot clonus16. Als de muis niet worden doorgegeven aan de kooi bij kamertemperatuur onmiddellijk na SE inductie, kan de muis sterven als gevolg van hyperthermie. - Beëindigen gedrags acute aanvallen op 3 uur na het begin van de SE door het injecteren van diazepam oplossing (i.p. 10 mg/kg 1 mL spuit; 30 G naald). Maak de diazepam oplossing door verdunning van 5 mg/mL diazepam in 10% polyoxyl 35 gehydrogeneerde ricinusolie door toevoeging van zout (i.p. 10 mL/kg; 1 mL spuit; 30 G naald).
Opmerking: 10% polyoxyl 35 gehydrogeneerde ricinusolie oplossing: 1 mL polyoxyl 35 gehydrogeneerde ricinusolie oplossing + 9 mL zoutoplossing. De oplossing op kamertemperatuur worden opgeslagen. Bijvoorbeeld, als de muis lichaamsgewicht 25 g bedraagt, injecteren 250 µL van diazepam oplossing: 50 µL 5 mg/mL diazepam + 200 µL 10% polyoxyl 35 gehydrogeneerde castor olie oplossing = 250 µL 1 mg/mL diazepam. - Voor sham muizen, verrichten een i.p. injectie van de scopolamine methylbromide en terbutaline hemisulfate mengsel (i.p.; beide 2 mg/kg, 10 mL/kg; 1 mL spuit; 30 G naald). 30 min later, spuit de zoutoplossing intraperitoneally (i.p. 10 mL/kg; 1 mL spuit; 30 G naald).
Opmerking: Als de muis lichaamsgewicht 25 g bedraagt, injecteren 250 µL van zout in plaats van pilocarpine. - Na diazepam injectie (1 mL spuit, i.p.; 30 G naald), 1 mL 5% dextrose per individuele muis (spuit van 1 mL, i.p.; 26 G naald) te beheren.
Opmerking: 1 mL 5% dextrose injectie biedt energiebron en hydratatie die de overlevingskans verhogen kan. - Veeg tijdens na zorg in de incubator (28-30 ° C), van buitensporige secreta zoals speeksel, tranen en ontlasting.
- Op dag 1 na SE inductie, weeg de muizen en ze voor een extra dag in de incubator (28-30 ° C) bewaren. Op dag 2 na SE inductie, weeg de muizen en terugsturen naar hun thuis kooi. Bieden vochtige chow ter vergemakkelijking van hun herstel.
Opmerking: In dit experiment was het sterftecijfer voor C57BL/6NHsd na SE beëindiging € 8,57% gemiddeld (3 uit van 35 muizen getest). - Meet dagelijks lichaamsgewicht van de dieren tot 7 dagen na pilocarpine en injecteren van de muizen met 5% dextrose (spuit van 1 mL, i.p.; 26 G naald) wanneer het lichaamsgewicht niet is toegenomen. Stop gewicht controle van het lichaam wanneer de muizen beginnen te herwinnen lichaamsgewicht en consumeren van vochtige chow zonder moeite 2 dagen na pilocarpine injectie.
Opmerking: Als het lichaamsgewicht van een muis niet tot 7 dagen post SE verhogen, uitsluiten van de muis van het experiment en euthanaseren door kooldioxide. Afhankelijk van de achtergrond van de muis, kan de dood af en toe optreden; echter, in het geval van C57BL/6NHsd, minder dan 1% van de muizen overleed in deze experimenten. Met de overleving van meer dan 7 dagen na SE inductie sterven de muizen zelden in de latente periode.
2. implantatie chirurgie voor Video-EEG toezicht
- Bereiden 12-week-oude muizen (4 weken na SE inductie) voor het uitvoeren van telemetrie implantatie voor de controle van de EEG.
Opmerking: Timing van implantatie kan worden aangepast afhankelijk van de experimentele doeleinden en de muis-stammen. - Anesthetize voor de operatie, de muis met een mengsel van (4:0.5) van ketamine (50 mg/mL) en xylazine (23.3 mg/mL) oplossing ontbonden in een zoutoplossing bij een dosis van 2,5 µL/g lichaamsgewicht (spuit van 1 mL, i.p.; 26 G naald). Ademhaling en luchtwegen inspanning van de muis controleren op gezette tijden (15 min interval maximale) en beoordelen van de diepte van de verdoving door de pedaal terugtrekking reflex.
- Plaatst u de muisaanwijzer in een stereotaxic frame met oor bars en een hap-plaat en dierenarts zalf toepassen op beide ogen te voorkomen blindheid.
- Als u wilt behouden steriele omstandigheden tijdens de operatie, scheren chirurgische sites die gebruik maken van een scheermesje. Wees voorzichtig om te voorkomen dat besmetting van de vacht van het chirurgische gebied. Desinfecteer na het scheren, de huid met 70% ethanol en jodium oplossing.
Opmerking: Operatie moet worden uitgevoerd in een aseptische wijze dragen van steriele handschoenen en maskers, met behulp van gesteriliseerde apparatuur en aseptische technieken. - Na het bevestigen van de diepte van de verdoving, maken een insnijding van de middellijn van de huid tot het blootstellen van de schedel. Maak twee burr gaatjes met een boor gekoppeld aan het stereotaxic apparaat op de coördinaten van de Bregma in de anteroposterior as (AP): + 0,1 mm, mediolateral as (ML): + 0,1 mm (referentie) en AP: −0.2 mm, ML: +0.22 mm (linker pariëtale cortex)13.
- Veeg de huid met PBS-gedrenkt katoen swaps, gevolgd door 70% ethanol en jodium oplossing. Maak een longitudinale snede in het midden van het hoofd met een schaar de Lambda (het punt waar de Sagittaal en de lambdoid hechtdraad ontmoeten), de Bregma (het punt van de kruising van de coronale hechtdraad door de Sagittaal hechtdraad) en de doellocatie bloot te stellen.
- Anatomische bezienswaardigheden zoals Lambda en Bregma te identificeren. Plaats de boor op Bregma en noteer de X, Y-coördinaten van dit punt.
- Gebruik een hersenen atlas boeken of referenties om te bepalen van de juiste coördinaten van de hersengebieden voor EEG opname gepubliceerd. Dan, bereken de coördinaten van de schroeven (referentie en opname) met behulp van de coördinaten van de Bregma gemeten bij stap 2.5.2.
- Langzaam lager de boor om een burr gat voorzichtig om te voorkomen dat de boor invoegen te ver op het punt waar de schedel steeds dunner te maken.
- Invoegen het lichaam van de enkellijns draadloos EEG zender achter de achterkant van de nek subcutaan en flexibele plaats leidt in de buurt van de schedel.
- Plaatsen van een schroef van roestvrij staal (2 mm lengte) in elke burr gat met een pincet en draai met behulp van een schroevendraaier door rechtsom draaien. Controleer of dat de schroef niet te veel diep door het aanpassen van de mate van rotatie van de schroef om schade te voorkomen aan de dura of de weefsels van de hersenen is geplaatst.
- Strippen van de isolatie vacht 2 mm van het uiteinde van de leads en rekken van de draad lang genoeg om af te ronden de schacht van de schroef voor een goede aansluiting tussen de draad en de schroef. Steek de stekker van de verwijzing in de voorste schroef en de voorsprong van de opname naar de schroef in de pariëtale cortex. Vervolgens passen tandheelkundige cement om de gehele vergadering in plaats zonder bloot van de metalen delen.
- Nadat u hebt gecontroleerd dat de tandheelkundige cement volledig is opgedroogd door visuele inspectie, suture van de huid en toepassen actueel mupirocine zalf. Plaatst u de muisaanwijzer in een 30 ° C incubator alleen totdat het herstelt van de chirurgie (ongeveer 30 min). Vervolgens terug de muis naar de kooi totdat continue video-EEG controle begint.
Opmerking: Na de operatie, wordt elke muis (spuit van 1 mL, i.p.; 30 G naald) geïnjecteerd met 5 mg/kg gentamicine (antibiotica) en 5 mg/kg van ketoprofen (pijnstillers). Dieren moeten worden gecontroleerd totdat ze volledig ambulant. Zender-geïmplanteerd muizen hebben een herstelperiode van ongeveer 1 week.
3. video en EEG Monitoring en analyse
- Plaats een muis in een individuele kooi en plaats van de kooi op de top van de draadloze ontvanger platen waarop de kooi van Faraday is geïnstalleerd om te voorkomen dat de onderbreking van de elektrische signalen van alle bronnen die met inbegrip van een computer, AC lijnen en aangrenzende ontvangers.
Opmerking: Raadpleeg de handleiding die door de fabrikant. Zorg moet worden genomen om te voorkomen van blinde vlekken. - De elektrische activiteit met behulp van de draadloze video-EEG telemetriesysteem opnemen.
- Open de software voor video-EEG opname. Klik op "Hardware" en selecteer "Edit configuratie". Overeenkomen met de ontvanger en zender elke muis ingeplant. Klik op "Channel configuratie" en bevestig dat alle kanalen actief zijn. Klik op "Video configuration" de video synchroniseren met de gegevens van de EEG (resolutie van 40 x 480 en frame rates van 30,00).
Opmerking: Installeer een IP camera met hoge gevoeligheid als het is van cruciaal belang voor het verzamelen van goed imago kwaliteiten die subtiele gedragsveranderingen van de muizen aan de nacht herkennen kunnen. - Klik op 'Setup' en 'P3 setup' invoergegevens voor de individuele dieren, gecompenseerde camera en de instelling van de grafiek.
- Klik op "Verwerving" en "A/D sampling rate" setup samplingfrequenties. Klik op "naam van de gegevensset" aan te wijzen elk experiment.
Opmerking: Samplefrequentie voor EEG moet hoger zijn dan 500 Hz. als gevolg van de grote video en de grootte van de gegevens van de EEG, verdient het aanbeveling dat alleen 24 h gegevens per sessie worden afgehandeld in plaats van met behulp van een ononderbroken 2-week-registratie als één bestand. 8 h of 12u tussenpozen in geval van RAM geheugentekort kunnen gegevens afzonderlijk worden opgeslagen. - De zender met een magnetische bar activeren en klik op "Start overname" voor het verzamelen van de video-EEG opname. Door video-EEG systeem controleren voortdurend de muis voor ten minste 2 weken.
Opmerking: Voor C57BL/6 muizen meestal SRS in clusters voorkomen dat laatste ongeveer 5,2 dagen en de duur van de inbeslagneming-vrije periode is ongeveer 6,7 dagen17.
- Open de software voor video-EEG opname. Klik op "Hardware" en selecteer "Edit configuratie". Overeenkomen met de ontvanger en zender elke muis ingeplant. Klik op "Channel configuratie" en bevestig dat alle kanalen actief zijn. Klik op "Video configuration" de video synchroniseren met de gegevens van de EEG (resolutie van 40 x 480 en frame rates van 30,00).
- De inbeslagneming frequentie en duur bepalen door handmatige inspectie met behulp van de software van de analyse.
- Markeer het gebied met SRS en exporteren van de gegevens voor statistische analyse. Wees voorzichtig om uit te sluiten artefacten van de EEG die kunnen worden gegenereerd door het hoofd krabben of kauwen; Deze kunnen worden verwijderd door het controleren van de videogegevens.
Opmerking: SRS is gedefinieerd als een plotseling begin van repetitieve epileptiform stekelige activiteit (≥ 3 Hz) die blijft bestaan voor meer dan 10 s. Convulsive gedrag kunnen vaak gepaard gaan met een uitbarsting van stekelige activiteit. Non-convulsive vangsten kunnen ook electrographic blancobepalingen activiteiten zonder convulsive gedrag aantonen. Beëindiging van het beslag wordt gedefinieerd als die zich voordoen wanneer de vuren spikes naar basislijn activiteit terugkeert. - Voor analyse van inbeslagneming frequentie, deelt u het totale aantal SRS gevallen ontdekt tijdens de 2 weken door het totale aantal opname dagen voor ieder dier afzonderlijk.
- Voor analyse van de duur van de inbeslagneming, de tijd vanaf het begin tot het einde van de epileptiform stekelige activiteiten te meten.
- Markeer het gebied met SRS en exporteren van de gegevens voor statistische analyse. Wees voorzichtig om uit te sluiten artefacten van de EEG die kunnen worden gegenereerd door het hoofd krabben of kauwen; Deze kunnen worden verwijderd door het controleren van de videogegevens.
- Na voltooiing van de opname van de video-EEG, herstellen van de hersenen met 4% paraformaldehyde door transcardial perfusie. Anesthetize van de muis te injecteren een oplossing (4:0.5) van ketamine (50 mg/mL) en xylazine (23.3 mg/mL) opgelost in een zoutoplossing bij een dosis van 10 μL/g lichaamsgewicht (spuit van 1 mL, i.p.; 26 G naald). Nadat de muis wordt bevestigd te diep worden verdoofd, uitvoeren transcardial perfusie.
- Voor het isoleren van de hersenen van de muis, wordt de zender ophalen door de muis voor hergebruik na zuivering.
- Verwijder de tandheelkundige cement rond de leads met pincet.
- Geniet het puntje van de leads met tandheelkundige cement in 100% aceton totdat de tandheelkundige cement wordt ontbonden.
- Het verwijderen van weefsel contaminanten rond de zender door het spoelen met gedistilleerd water.
- Spoel de zender met 70% ethanol voor 3 h en lucht droog het voor opslag. Onmiddellijk voorafgaand aan het volgende gebruik, spoel de schroef en de borstband met 70% ethanol, gevolgd door gedestilleerd water, en plaats ze in een zoutoplossing.
Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de flexibele draden snijden wanneer de muis sinds, onthoofden als de flexibele leads te kort, het lawaai in de volgende implantatie en video-EEG opname kan verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle SE kan induceren hippocampal celdood en SRS (Figuur 1 en Figuur 2). Wij beëindigd gedrags acute aanvallen door diazepam injectie 3 uur na het begin van de SE en de muizen 7 dagen of 6 weken later opgeofferd.
Voor video-EEG-monitoring, de muizen ontvangen implantaat chirurgie op 4 weken na SE en SRS gevallen werden geëvalueerd voor 2 weken van 5-7 weken na het begin van de SE.
Figuur 1 toont een cel sterfgevallen in de hippocampus beoordeeld door cresyl violet kleuring. 7 dagen na SE, werden pyknotische cellen ontdekt in de hilar regio's (Figuur 1Ad) de getand gyrus en de piramidale cellaag van de CA3 subveld van de hippocampus (Figuur 1Af), overwegende dat intact hippocampus werd waargenomen in de sham-dieren ingespoten met zoutoplossing in plaats van pilocarpine (Figuur 1Aa-c). Interessant, dieren die onderging meerdere aanvallen, maar kan niet invoeren SE, toonde geen celdood in de hilar regio of de piramidale cellaag (Figuur 1Ag-i). Op 6 weken na SE, werd een duidelijke vermindering in het aantal hilar cellen (Figuur 1Bm) waargenomen. Daarnaast neuronale verlies werd waargenomen in de CA1 (Figuur 1Bn) en CA3 (Figuur 1Bo) regio's.
Figuur 2 toont de representatieve EEG sporen in de sham en SE groepen(Figuur 2). Vergeleken met de groep van de sham fysiologische elektrische activiteit tonen, toonde de SE groep af en toe epileptiform lozingen vergezeld met convulsive gedragingen. De locaties van de epidurale elektroden worden geïllustreerd in Figuur 2C. Figuur 2 B toont een voorbeeld van de elektrische geluiden van een aangrenzende monitor en het falen van signaal-collectie. We toonden ook EEG sporen van sham-gemanipuleerd dieren die spontane aanvallen toonde tijdens de 2 weken van video-EEG opname (Figuur 2E) gevonden en corticale verwondingen bij perfusie, mogelijk afgeleid van de overdreven diep plaatsing van de epidurale schroeven (Figuur 2D).
Figuur 1 : Neuronale dood in de hippocampus na pilocarpine-geïnduceerde SE. Representatieve beelden uit de groepen (A) 7 dagen en (B) 6 weken na pilocarpine of zoutoplossing injectie. Vergrote afbeeldingen tonen de hilus (a, j'ai flanqué), CA1 subveld (b, k), en CA3 subveld (c, l) van sham saline-behandelde groep, de hilus (d, m), CA1 subveld (e, n) , CA3 subveld (f, o) van de SE groep, en de hilus (g), CA1 subveld (h) en de CA3 subveld (ik) van de muizen die geen SE. Black pijlen in een gen j ontwikkelen Sommige van de representatieve hilar cellen geven, en pijlpunten in d en m geven pyknotische cellen. Schaal bar op de bodem links = 200 µm, geldig voor het gehele liet de meeste kolom, schaal bar in a en c = 20 µm, geldig voor de hele middelste kolom en een rechter kolom. Afkortingen in deze figuur: CA1, CA3: Cornu Ammonis hippocampal Subvelden; DG: Getand gyrus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Video en EEG opname toont spontane recidiverende aanvallen in de epileptische muis. (A) representatieve EEG sporen van sham-(boven) en SE-gemanipuleerd dieren (onder). Merk op dat SE-onderworpen dieren toont epileptiform stekelige activiteit (≥ 3 Hz), niet tentoongesteld door sham dieren. (B) een representatief beeld van elektrische geluiden en falen van de signaal-collectie. Let op de hoge amplitude unipolaire spikes en stopzetting van elektrische signalen. (C) Schematische tekening van de hersenen van de muis met locaties van elektroden. (D) twee afbeeldingen tonen de hersenen intact en gewonden in de cortex, mogelijk als gevolg van overdreven diep inbrengen van een epidurale schroeven. De zwarte pijl in de rechterafbeelding geeft de site van de corticale schade. Schaal bar = 250 µm. (E) vertegenwoordiger EEG sporen van sham-gemanipuleerd dieren met of zonder hersenletsel. Stel vast dat dieren sham-gemanipuleerd met corticale schade geleid blancobepalingen activiteit en convulsive SRS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk beschrijft de experimentele procedures voor de SE inductie en de evaluatie van chronische vangsten.
Verschillende factoren kunnen van invloed zijn op de succesvolle SE inductie. Nauwkeurige gedrags toezicht volgens de schaal van Racine is cruciaal voor de ontwikkeling van de SRS. Hoofd knikken, voorpoot clonus, fokken, en vallen zijn de gedragsmatige kenmerken van acute aanvallen ontwikkelen tot SE fase4,16. Zodra de eerste motor inbeslagneming wordt gedetecteerd, de lengte van het interval tussen de later convulsive vangsten vermindert alvorens SE. Bovendien moet SE worden volgehouden gedurende ten minste 6 uur, tenzij gedrags vangsten wordt afgesloten met diazepam5. Het is vermeldenswaard dat onderzoekers moeten zich bewust zijn van de mogelijkheid die inbeslagneming activiteiten kunnen worden opgespoord via electrocorticograms, opgelopen hoewel gedrags vangsten lijken te laten verdwijnen met diazepam injectie. Toename van omgevingstemperatuur na pilocarpine injectie tot SE inductie sterk het aantal dieren met SE verbeteren kan. Het is ook belangrijk om te verzorgen intensief na inbeslagneming, met inbegrip van voldoende hydratatie, nutritionele ondersteuning en gewicht controle voor hogere overlevingskans van de patiënt dan ongeveer 70-80% gemiddeld5,18. Afhankelijk van de genetische achtergrond van het dier afwijken gevoeligheid voor pilocarpine. Als de dieren weer ernstige acute aanvallen met hoge mortaliteit, kan de vermindering van pilocarpine dosering, de duur van de SE, of verhoogde scopolamine en terbutaline nuttig zijn. Terwijl ernstige SE is bekend om zijn gerelateerd aan hogere incidentie van SRS, met hogere mortaliteit, is het van cruciaal belang te overwegen deze factoren. Hippocampal neuronale dood consequent in acht worden genomen na SE. 6 h post-SE, heeft uitgebreide verlies van hilar interneuronen gerapporteerde19geweest. 7 dagen na SE, piramidale neuronen in het subveld CA3 meestal sterven, en voortdurend worden waargenomen bij 6 weken na SE inductie, hoewel de omvang van neuronale schade in de piramidale cellaag variabele in muizen. Neuronale verlies in de CA1 subveld van de hippocampus kan ook vaak worden waargenomen. Interessant is dat dieren met meerdere aanvallen die voer niet SE bleek bijna intact hippocampus gelijkaardig aan de sham-groep, met de vermelding histologische celdood kunnen een goede marker van voldoende ernstige acute aanvallen.
Op ongeveer 4 weken na SE, alle pilocarpine-behandeld C57BL/6NHsd muizen werd epileptische en toonde SRS, waaruit blijkt dat een van de belangrijkste verdiensten met behulp van dit model. Omdat chronische vangsten zijn geclusterd, moet de video-EEG worden geregistreerd continu gedurende ten minste 2 weken in plaats van met tussenpozen, hoewel de opname periode kan worden aangepast afhankelijk van de stammen van de muis of experimentele doeleinden17. Bovendien hebben spontane aanvallen in TLE dagverloop variaties aan te tonen de hoge frequentie van de SRS in de late middag20. Praktisch, voor nauwkeurige video-EEG opname moeten alle bronnen die met inbegrip van AC lijnen, computers, camera's of zenders geïmplanteerd in de muis in de aangrenzende ontvanger worden geblokkeerd. De installatie van de kooi van Faraday en camera's met hoge gevoeligheid tijdens de dag en nacht kan elektrische ruis verminderen en helpen om te identificeren veralgemeend chronische vangsten, respectievelijk. Tot slot, het is uiterst belangrijk te voorkomen dat schade aan de hersenen wanneer de schroeven worden geplaatst op het oppervlak van de dura mater, zoals het misleidende EEG gegevens kan genereren. Hoewel de SRS-frequentie niet hoog was, kunnen eventuele mechanische corticale verwondingen door gedwongen schroef opneming convulsive vangsten genereren in slechts een week.
Kortom, ondanks de tijd beperkingen voor modellering en de eis van diepgaande opleiding om uit te voeren operaties en analyse van de EEG implantaat, is de pilocarpine-geïnduceerde SE een van de beste modellen voor de studie van chronische epilepsie onder beschikbare dier modellen van TLE. Hier beschrijven we een methode van inducerend SE na pilocarpine injectie en beoordeling van de chronische aanvallen met behulp van een draadloze video-EEG telemetriesysteem. Wij geloven dat dit protocol kan gedetailleerde informatie voor geschikt diermodellen voor chronische epilepsie en epileptogenese bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Research Foundation van Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (NRF-2014R1A1A3049456) en een subsidie van de Korea Health Technology R & D Project via de Korea gezondheid industrie Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het ministerie van gezondheid & welzijn, Republiek Korea (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Epilepsy. N Engl J Med. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 7 (4), 348-354 (2007).
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nat Rev Neurol. 5 (7), 380-391 (2009).
- Cavalheiro, E. A. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 16 (1-2), 33-37 (1995).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Prog Neurobiol. 73 (1), 1-60 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (10), 2887-2899 (2013).
- Sharma, A. K., et al. Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis, induced rodent models and lesions. Toxicol Pathol. 35 (7), 984-999 (2007).
- Hellier, J. L., Dudek, F. E. Chemoconvulsant model of chronic spontaneous seizures. Curr Protoc Neurosci. 9, Chapter 9 Unit 9 19 (2005).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic epilepsy. Epilepsy Behav. 14, Suppl 1 16-25 (2009).
- Mathern, G. W., Adelson, P. D., Cahan, L. D., Leite, J. P. Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyer's hypothesis revisited. Prog Brain Res. 135, 237-251 (2002).
- Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
- Brulet, R., Zhu, J., Aktar, M., Hsieh, J., Cho, K. O. Mice with conditional NeuroD1 knockout display reduced aberrant hippocampal neurogenesis but no change in epileptic seizures. Exp Neurol. 293, 190-198 (2017).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nat Commun. 6, 6606 (2015).
- Cavalheiro, E. A., Santos, N. F., Priel, M. R. The pilocarpine model of epilepsy in mice. Epilepsia. 37 (10), 1015-1019 (1996).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
- Hester, M. S., Danzer, S. C. Accumulation of abnormal adult-generated hippocampal granule cells predicts seizure frequency and severity. J Neurosci. 33 (21), 8926-8936 (2013).
- Shibley, H., Smith, B. N. Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice. Epilepsy Research. 49 (2), 109-120 (2002).
- Borges, K., et al. Neuronal and glial pathological changes during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model. Exp Neurol. 182 (1), 21-34 (2003).
- Pavlova, M. K., Shea, S. A., Bromfield, E. B. Day/night patterns of focal seizures. Epilepsy Behav. 5 (1), 44-49 (2004).
