Summary
Dette manuskriptet beskriver en metode for å indusere status epilepticus ved systemisk pilokarpin injeksjon og overvåking spontan tilbakevendende beslag i levende dyr med en trådløs telemetri video og EEG system. Denne protokollen kan benyttes for å studere pathophysiologic mekanismer av kronisk epilepsi, epileptogenesis og akutt beslag.
Abstract
Tinninglappen epilepsi (TLE) er en vanlig nevrologisk lidelse i voksen alder. For translational studier av kronisk epilepsi, er pilokarpin-indusert status epilepticus (SE) ofte valgt å recapitulate spontan tilbakevendende beslag (SRS). Her presenterer vi protokollen SE induksjon av intraperitoneal (IP) injeksjon av pilokarpin og overvåking av kronisk regelmessige beslag i levende dyr med en trådløs telemetri video og EEG (EEG) system. Vi vist bemerkelsesverdig atferdsendringer som trenger oppmerksomhet etter pilokarpin injeksjon og deres sammenheng med hippocampus neuronal tap på 7 dager og 6 uker etter pilokarpin. Vi beskriver også eksperimentelle prosedyrene for elektrode implantasjon og EEG opptak og analyse av hyppigheten og varigheten av kronisk tilbakevendende beslag. Til slutt, vi diskuterer mulige årsaker hvorfor de forventede resultatene ikke er oppnådd i hvert tilfelle. Dette gir en grunnleggende oversikt over modellering kronisk epilepsi i mus og retningslinjer for feilsøking. Vi tror denne protokollen kan tjene som en opprinnelig plan for egnet modeller av kronisk epilepsi og epileptogenesis.
Introduction
TLE er en av de vanligste ervervede epilepsies1. Personer med epilepsi oppleve tilbakevendende beslag som følge av unormal neuronal aktiviteter i hjernen2,3. Gitt at TLE er ofte vanskelige, er det avgjørende å forstå grunnleggende mekanismene bak utviklingen av epilepsi.
Dyr modeller som kan recapitulate de viktigste kjennetegnene ved menneskelige TLE kan tilby bedre forståelse av TLE patofysiologi, slik at vi kan lett overvåke og manipulere kritiske faktorer i epileptogenesis. Blant dem er chemoconvulsants-indusert SE brukte4,5. I motsetning til andre epilepsi modeller, som elektrisk stimulering som viser ingen hippocampus sklerose og robust SRS6,7,8, kan systemisk injeksjon av chemoconvulsants etterligne klinisk patogenesen av menneskelig TLE, dvs., første hjerneskade, en latent periode og en kronisk epileptisk scenen manifestere SRS5,9,10. Derfor, denne teknikken kan benyttes i ulike studier forklare mekanismene akutt hjerneskade, epileptogenesis eller anfall undertrykkelse. Videre er histopathological forandringer indusert av chemoconvulsants like de sett i menneskelig TLE, gir en ekstra begrunnelse for bruk av TLE gnager modeller10,11,12. Spesielt, har strukturelle skader som involverer hippocampus konsekvent gjenskapt i begge kainic syre - og pilokarpin-indusert SE modeller. Men kan sammenlignet med kainic syre injeksjon, pilokarpin modellen produsere mer robust SRS i mus, som kan gi betydelig fordeler for å studere kronisk epilepsi når bredt tilgjengeligheten av transgene musen linjer5, 13 , 14 , 15. videre anfall progresjon etter pilokarpin injeksjon er generelt raskere enn i kainic syre modellen, gir ytterligere bevis for effektiv bruk av en pilokarpin modell av epilepsi.
Her viser vi en metode for å indusere SE IP injeksjon av pilokarpin og video og EEG overvåking kronisk epilepsi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av etikk i katolske universitetet i Korea og ble utført i samsvar med den nasjonale institutter for helse Guide og bruk av forsøksdyr (NIH publikasjoner nummer 80-23).
1. SE induksjon
- Kjøp 8-uke-gamle mannlige C57BL/6NHsd mus og veie hver musen. Deretter Bruk en markør pennen merke haler av alle mus for deres lett identifikasjon under SE Innledning.
- Beregne hvor mye scopolamine metylbromid (scopolamine, 2 mg/kg), terbutaline hemisulfate (terbutaline, 2 mg/kg) og pilokarpin hydroklorid (pilokarpin, 280 mg/kg) basert på musen vekt og legge saltvann (0,9% NaCl, 10 mL/kg) å lage løsninger.
Merk: For eksempel hvis vekten av musen er 25 g, disse tallene er brukt: Scopolamine og terbutaline: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0,05 mg, Saline: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL, Pilocarpine: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg , Saltvann: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL. - Legg scopolamine og terbutaline blandingen i 1 mL sprøyte med en 30 G nål. Injisere løsningen intraperitoneally i hver musen, og deretter returnerer mus til deres burene. 30 minutter etter scopolamine og terbutaline, injisere pilokarpin løsning i hver mus (IP, 1 mL sprøyte, 30 G p). Umiddelbart etter pilokarpin injeksjon, plassere mus i en inkubator (28-30° C) for observasjon.
- Nøye overvåke virkemåten til mus til SE er indusert. Hvis limbiske motor beslag som tilsvarer trinn 3 eller høyere ifølge Racines skala oppdages, fortegnelse tid og overvåke mus for å fastslå om beslag oppstå oftere. Når kontinuerlig motor beslag vare mer enn 2 min, plasserer musen i nye bur ved romtemperatur og holde overvåking for 3 h å avgjøre om deres convulsive beslag fortsette og SE er indusert. Euthanize musene som ikke kunne angi SE på ca 2 timer etter pilokarpin injeksjon.
Merk: Racines skala. Trinn 1, munn og ansikts bevegelser; scene 2, hodet nikker; scene 3, forlemen clonus; Stage 4, oppdrett med forlemen clonus; Trinn 5, oppdrett og faller med forlemen clonus16. Hvis musen ikke er overført til buret ved romtemperatur umiddelbart etter SE induksjon, kan musen dø på grunn av hypertermi. - Avslutte atferdsmessige akutt beslag på 3t etter SE utbruddet ved å injisere diazepam løsning (IP, 10 mg/kg, 1 mL sprøyte, 30 G p). Gjøre diazepam løsningen ved å fortynne 5 mg/mL av diazepam i 10% polyoxyl 35 hydrogenert ricinusolje ved å legge til saltvann (IP, 10 mL/kg, 1 mL sprøyte, 30 G p).
Merk: 10% polyoxyl 35 hydrogenert ricinusolje løsning: 1 mL polyoxyl 35 hydrogenert ricinusolje løsning + 9 mL saltvann. Lagre løsningen ved romtemperatur. For eksempel hvis musen kroppsvekt 25 g, injisere 250 µL av diazepam løsning: 50 µL 5 mg/mL diazepam + 200 µL 10% polyoxyl 35 hydrogenert castor olje løsning = 250 µL 1 mg/mL diazepam. - Humbug mus, utføre en IP injeksjon av scopolamine metylbromid og terbutaline hemisulfate blandingen (IP, begge 2 mg/kg, 10 mL/kg; 1 mL sprøyte 30 G p). 30 min senere, injisere saltkildene intraperitoneally (IP, 10 mL/kg, 1 mL sprøyte, 30 G p).
Merk: Hvis musen kroppsvekt 25 g, injisere 250 µL saltoppløsning i stedet for pilokarpin. - Etter diazepam injeksjon (IP, 1 mL sprøyte, 30 G nål), administrere 1 mL av 5% druesukker per personlige mus (IP, 1 mL sprøyte, 26 G p).
Merk: 1 mL av 5% druesukker injeksjon gir energikilde og hydrering som kan øke overlevelse. - Under etter omsorg i inkubator (28-30 ° C), tørke av overdreven sekret som spytt, tårer og avføring.
- På dag 1 etter SE innledningen veie mus og holde dem i inkubator (28-30 ° C) for en ekstra dag. På dag 2, etter SE innledningen veie mus og returnere dem til deres hjem bur. Gir fuktighet chow å lette deres.
Merk: I dette eksperimentet var dødeligheten for C57BL/6NHsd SE etterlønn 8,57% i gjennomsnitt (3 ut av 35 mus testet). - Måle daglig kroppsvekt av dyrene inntil 7 dager etter pilokarpin og injisere mus med 5% druesukker (IP, 1 mL sprøyte, 26 G nål) når kroppsvekten har ikke økt. Stopp kroppen vekt overvåking når mus begynner å gjenvinne kroppsvekt og forbruke fuktig chow uten problemer på 2 dager etter pilokarpin injeksjon.
Merk: Hvis kroppsvekten av en mus ikke økte til 7 dager innlegg SE, utelate musen fra eksperimentet og euthanize av karbondioksid. Avhengig av bakgrunnen av musen, kan død noen ganger skje; men i tilfelle av C57BL/6NHsd, mindre enn 1% av mus døde i disse eksperimentene. Overlevelse av mer enn 7 dager etter SE innledningen dø musene sjelden i latent perioden.
2. implantasjon kirurgi for EEG Video-overvåking
- Forberede 12 uke gammel mus (4 uker etter SE innledningen) til å utføre telemetri implantasjon for EEG overvåking.
Merk: Tidspunktet for implantasjon kan endres avhengig av de eksperimentelle formålene og musen stammer. - Før kirurgi, bedøve musen med en blanding (4:0.5) av ketamin (50 mg/mL) og xylazine (23.3 mg/mL) løsning oppløst i saltvann i en dose av 2,5 µL/g-kroppsvekt (IP, 1 mL sprøyte, 26 G p). Overvåke respirasjonsfrekvens og respiratoriske innsats av musen med jevne mellomrom (15 min intervall maksimal) og vurdere dybden av anestesi av pedal uttak refleks.
- Plasser musen i en stereotaxic ramme med øret barer og bite plate og anvende vet salve på begge øynene å unngå blindhet.
- For å opprettholde sterile forhold under operasjonen, barbere kirurgiske områder med et barberblad. Pass på å hindre pels forurensning av kirurgiske feltet. Etter barbering, Desinfiser huden med 70% etanol og joden løsning.
Merk: Operasjonen skal utføres på en steril måte seg sterilt hansker og masker, bruke sterilisert utstyr og steril teknikk. - Etter bekrefter dybden av anestesi, lage en midtlinjen snitt i huden å utsette skallen. Gjøre to burr hull med en drill knyttet til stereotaxic apparatet ved koordinatene fra Bregma i anteroposterior-aksen (AP): +0.1 mm, mediolateral-aksen (ML): +0.1 mm (referanse) og AP: −0.2 mm, ML: +0.22 mm (venstre parietal cortex)13.
- Tørke huden med PBS-gjennomvåt bomull bytteavtaler, etterfulgt av 70% etanol og joden løsning. Gjøre en langsgående snitt i hodet med saks å avsløre Lambda (punktet der den sagittal og det lambdoid suture møtes), Bregma (punktet krysset av det Koronal suture av det sagittal suture) og målplasseringen.
- Identifisere anatomiske landemerker som Lambda og Bregma. Plasser borekronen Bregma og Merk X, Y-koordinater for dette punktet.
- Bruke en hjerne atlas bøker eller publisert referanser for å finne riktige koordinatene av hjernen regioner for EEG opptak. Deretter beregne koordinatene til skruene (referanse og opptak) bruker Bregma koordinatene måles på trinn 2.5.2.
- Sakte senke borekronen gjøre burr hull forsiktige for å unngå å sette inn borekronen langt på punktet der skallen blir tynnere.
- Sett inn kroppen til den ene kanalen trådløs EEG senderen bak i nakken på subcutaneously og plassere fleksibel fører nær skallen.
- Plasser en rustfritt stål skrue (2 mm lengde) inn hvert burr hull med pinsett og stram den med en skrutrekker av klokken. Kontroller at skruen ikke settes for langt dypt ved å justere graden av skruen rotasjon for å hindre skade på dura eller hjernen vev.
- Strip isolasjon pelsen 2 mm fra spissen av fører og strekke ledningen lenge nok runde skruen akselen etter en god forbindelse mellom ledningen og skruen. Koble referanse ledelsen foran skruen og opptak føre til skruen i parietal cortex. Bruk deretter dental sement for å sikre hele forsamlingen på plass uten å utsette metalldeler.
- Etter bekrefter at dental sement har tørket helt ved by visuell inspeksjon, Sutur i huden og bruke aktuelle mupirocin salve. Plass musen i en 30 ° C inkubator alene til gjenoppretter fra kirurgi (ca 30 min). Tilbake deretter musen til hjem buret til kontinuerlig EEG video-overvåking begynner.
Merk: Etter operasjonen injiseres hver mus (IP, 1 mL sprøyte, 30 G p) med 5 mg/kg av gentamicin (antibiotika) og 5 mg/kg av ketoprofen (smertestillende). Dyr burde være kontrollert før de blir fullt ambulant. Sender-implantert mus har en restitusjonsperiode av ca 1 uke.
3. video og EEG oppfølging og analyse
- Plasser musen i en individuell buret og plassere buret på den trådløse mottakerkassen plater der buret er installert for å unngå avbrudd av elektriske signaler fra alle kilder, inkludert en datamaskin, AC linjer og tilstøtende mottakere.
Merk: Se manuell levert av produsenten. Man må være forsiktig å unngå blinde flekker. - Registrere den elektriske aktiviteten bruker trådløs video-EEG telemetrisystem.
- Åpne programvaren for EEG video-opptak. Klikk "Hardware" og velg "Rediger konfigurasjon". Koble mottakeren senderen implantert i hver musen. Klikk "Kanal konfigurasjon" og Bekreft alle kanaler er aktive. Klikk "Video konfigurasjon" synkronisere video med EEG data (resolution av 40 x 480 og rammen rate 30,00).
Merk: Du kan installere et IP kameraet med høy følsomhet hvis det er viktig å samle god image egenskaper som kan identifisere subtile atferdsendringer av mus natten. - Klikk "Setup" og "P3 setup" inndatainformasjon enkelte dyr, matchet kamera og graf innstillingen.
- Klikk "Erverv" og "A/D samplingsfrekvens" til installasjonsprogrammet samplingsfrekvenser. Klikk "datasett navn" Angi hvert eksperiment.
Merk: Samplingsfrekvensen for EEG må være høyere enn 500 Hz. stor video og EEG datastørrelsen, anbefales det at bare 24 h data behandles per økt istedenfor å bruke en kontinuerlig 2-uke-opptak som en fil. Data kan lagres separat på 8 h eller 12t intervaller i lite RAM minne. - Aktivere senderen med en magnetisk bar og klikk "Start oppkjøpet" samle EEG video-opptaket. Kontinuerlig overvåke musen EEG video-systemet i minst 2 uker.
Merk: For C57BL/6 mus, SRS tendens til å oppstå i klynger som sist om 5,2 dager og varigheten av anfall-fri periode er ca 6,7 dager17.
- Åpne programvaren for EEG video-opptak. Klikk "Hardware" og velg "Rediger konfigurasjon". Koble mottakeren senderen implantert i hver musen. Klikk "Kanal konfigurasjon" og Bekreft alle kanaler er aktive. Klikk "Video konfigurasjon" synkronisere video med EEG data (resolution av 40 x 480 og rammen rate 30,00).
- Bestemme anfall hyppighet og varighet ved manuell inspeksjon ved hjelp av analyseprogramvare.
- Merk området viser SRS og eksportere data for statistisk analyse. Være forsiktig å ekskludere EEG gjenstander som kan genereres ved skrape hodet eller chewing; Disse kan fjernes ved å sjekke videodata.
Merk: SRS er definert som en bardus onset av repeterende epileptiform skyter aktivitet (≥ 3 Hz) som vedvarer for mer enn 10 s. Convulsive atferd kan ofte bestille et utbrudd av skyter aktivitet. Non-convulsive beslag kan også vise electrographic skyter aktiviteter uten convulsive atferd. Anfall oppsigelse defineres som oppstår når avfyring toppene tilbake til planlagt aktivitet. - For analyse av beslag frekvens, deler du totalt antall SRS tilfeller oppdaget under 2 uker av antall opptak dager for hvert individuelle dyr.
- For analyse av beslag varighet, måle tiden fra begynnelsen til slutten av epileptiform skyter aktiviteter.
- Merk området viser SRS og eksportere data for statistisk analyse. Være forsiktig å ekskludere EEG gjenstander som kan genereres ved skrape hodet eller chewing; Disse kan fjernes ved å sjekke videodata.
- Etter ferdigstillelse av EEG video-opptaket, fikse hjernen med 4% paraformaldehyde av transcardial perfusjon. Å bedøve musen, injisere en løsning (4:0.5) av ketamin (50 mg/mL) og xylazine (23.3 mg/mL) oppløst i saltvann i en dose av 10 μL/g-kroppsvekt (IP, 1 mL sprøyte, 26 G p). Når musen er bekreftet å være dypt anesthetized, utføre transcardial perfusjon.
- Før isolere musen hjernen, hente senderen fra musen for gjenbruk etter rensing.
- Fjerne dental sement rundt fører ved hjelp av pinsett.
- Suge spissen av fører med dental sement i 100% aceton til dental sement er oppløst.
- Fjerne vev forurensninger rundt senderen av skylle den med destillert vann.
- Skyll senderen med 70% etanol 3t og luft tørke den for lagring. Umiddelbart før neste bruk, skyll skruen og senderen med 70% etanol, etterfulgt av destillert vann, og plasseres i saltvann.
Merk: Hensyn må tas å unngå klipping fleksibel ledningene når decapitating musen siden, hvis de fleksible fører er for kort, støyen i neste implantasjon og EEG video-opptak kan øke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket SE kan indusere hippocampus celledød og SRS (figur 1 og figur 2). Vi avsluttet atferdsmessige akutt beslag av diazepam injeksjon på 3t etter SE utbruddet og ofret musene 7 dager eller 6 uker senere.
EEG video-overvåking, musene mottatt implantat kirurgi på 4 uker etter SE og SRS tilfeller ble vurdert i 2 uker fra 5-7 uker etter SE utbruddet.
Figur 1 viser cellen dødsfall prefiks vurdert av cresyl violet flekker. På 7 dager etter SE, ble pyknotic celler oppdaget i hilar områder (figur 1annonse) av dentate gyrus og pyramideformet celle laget av CA3 underfeltet av hippocampus (figur 1Af), mens intakt hippocampus ble observert i humbug dyr injisert med saltvann i stedet for pilokarpin (figur 1Aa-c). Interessant, dyr som gjennomgikk flere beslag, men klarte ikke å angi SE, viste ingen celledød i hilar regionen eller pyramideformet celle laget (figur 1Ag-i). På 6 uker etter SE, ble en markert nedtrapping observert i antall hilar celler (figur 1Bm). I tillegg neuronal tap ble observert i CA1 (figur 1Bn) og CA3 (figur 1Bo) regioner.
Figur 2 viser representant EEG spor i svindel og SE grupper (figur 2A). Sammenlignet med humbug gruppen viser fysiologiske elektrisk aktivitet, gruppen SE noen ganger viste epileptiform utslipp sammen med convulsive atferd. Plasseringen av epidural elektrodene er illustrert i figur 2C. Figur 2 B viser et eksempel på de elektriske lydene fra en nærliggende dataskjerm og svikt i signal samling. Vi også demonstrert EEG spor humbug-manipulert dyr som viste spontan beslag i 2 uker av EEG video-opptak (figur 2E) og fant kortikale skader på perfusjonsmåler, muligens avledet fra overdrevet dyp plassering epidural skruene (figur 2D).
Figur 1 : Neuronal død prefiks etter pilokarpin-indusert SE. Representant bilder fra grupper av (A) 7 dager og (B) 6 uker etter pilokarpin eller saltvann injeksjon. Forstørret bildene viser hilus (en, j), CA1 underfelt (b, k), og CA3 underfelt (c, l) av saltholdig-behandlet humbug, hilus (d, m), CA1 underfelt (e, n) , og CA3 underfelt (f, o) SE gruppen og hilus (g), CA1 underfelt (h) og CA3 underfelt (jeg) av musene som ikke utvikle SE. Black pilene i en gog j angir noen av representative hilar cellene, og pilspisser i d og m angir pyknotic celler. Skala bar i nedre venstre side = 200 μm, gyldig for hele igjen de fleste kolonne, skala bar i en og c = 20 µm, gyldig for hele kolonnen i midten og høyre kolonne. Forkortelser i dette tallet: CA1, CA3: Cornu Ammonis hippocampus underfelt; DG: Dentate gyrus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Video og EEG innspillingen viser spontan tilbakevendende beslag i epileptiske musen. (A) representant EEG spor fra humbug (øverst) og SE-manipulert dyr (nederst). Merk at SE-utsatt dyr viser epileptiform skyter aktivitet (≥ 3 Hz), ikke utstilt av humbug dyr. (B) en representativt bilde av elektrisk støy og svikt i samlingen signal. Note høy amplitude Unipolare pigger og seponering av elektriske signaler. (C) skjematisk tegning av musen hjernen med steder av elektroder. (D) to bilder viser intakt og skadet hjernen i cortex, muligvis fordi svært dype epidural skruer. Den svarte pilen i høyre bildet viser webområdet kortikale skader. Skala bar = 250 µm. (E) representant EEG spor av humbug-manipulert dyr med eller uten hjerneskade. Merk at humbug-manipulert dyr med kortikale skader generert skyter aktivitet og convulsive SRS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette verket beskriver eksperimentelle prosedyrer SE innledningen og evaluering av kronisk beslag.
Flere faktorer kan påvirke vellykket SE induksjon. Nøyaktig atferdsmessige overvåking ifølge Racine skalaen er avgjørende for utviklingen av SRS. Hodet nikker, forlemen clonus, oppdrett, og faller er atferdsdata kjennemerkene til akutt beslag utvikler seg til SE fase4,16. Når første motor beslaget oppdages, lengden på intervallet mellom senere convulsive beslag reduseres før SE. SE videre bør opprettholdes i minst 6 h, med mindre opptreden beslag er avsluttet av diazepam5. Det er verdt å merke seg at forskere bør være oppmerksom på muligheten for at vedvarende anfall aktiviteter kan registreres via electrocorticograms, selv om atferdsmessige beslag synes å avta med diazepam injeksjon. Øke omgivelsestemperatur etter pilokarpin injeksjon til SE induksjon kan forbedre antall dyr med SE. Det er også viktig å gi intensiv etter anfall omsorg, inkludert tilstrekkelig fuktighet, ernæringsmessig støtte og vekt overvåking for høyere overlevelse enn ca 70-80% i gjennomsnitt5,18. Avhengig av dyrets genetiske bakgrunn avvike mottakelighet for pilokarpin. Hvis dyr viser alvorlig akutt beslag med høy dødelighet, kan reduksjon av pilokarpin dosering, SE varigheten eller økt scopolamine og terbutaline være nyttig. Mens alvorlig SE er kjent for å være knyttet til høyere forekomst av SRS, med høyere dødelighet, er det avgjørende å vurdere disse faktorene. Hippocampus neuronal dødsfall er konsekvent observert etter SE. På 6 h stolpe-SE, har omfattende tap av hilar interneurons vært rapportert19. På 7 dager etter SE, pyramidale nevroner i CA3 underfeltet vanligvis dør, og er kontinuerlig observert på 6 uker etter SE induksjon, selv om omfanget av neuronal skade i pyramideformet celle laget er variabel i mus. Neuronal tap i CA1 underfeltet av hippocampus kan også sees ofte. Interessant, dyr med flere beslag som ikke angir SE viste nesten intakt hippocampus lik gruppen humbug indikerer histologic celledød kan være en god markør tilstrekkelig alvorlig akutt beslag.
På ca 4 uker etter SE, alle pilokarpin-behandlet C57BL/6NHsd mus ble epileptiske og viste SRS, demonstrerer en av store fortjeneste ved hjelp av denne modellen. Siden kroniske beslag klynger, skal video-EEG registreres kontinuerlig i minst 2 uker heller enn midlertidig, selv om innspillingen perioden kan endres avhengig av musen stammer eller eksperimentelle formål17. Videre har spontan beslag i TLE daglige variasjoner demonstrere høy SRS frekvens i sen ettermiddag20. Praktisk talt, for nøyaktig EEG video-opptak må noen kilder, inkludert AC linjer, datamaskiner, kameraer eller sendere implantert i musen i tilstøtende mottakeren blokkeres. Installasjonen av buret og kameraer med høy følsomhet under dag og natt kan minske elektrisk støy og angi generalisert kronisk beslag, henholdsvis. Endelig, er det ekstremt viktig å unngå hjerneskade når skruene er plassert på overflaten av den dura mater det kan generere misvisende EEG data. Selv om SRS frekvensen ikke var høy, kan noen mekaniske kortikale skader ved tvunget skruen innsetting generere convulsive beslag i bare en uke.
Som konklusjon, til tross for tiden begrensninger for modellering og kravet om grundig opplæring for å utføre implantat kirurgi og EEG analyse, er pilokarpin-indusert SE en av de beste modellene for å studere kronisk epilepsi blant tilgjengelige dyr modeller av TLE. Her beskriver vi en metode for å indusere SE etter pilokarpin injeksjon og vurdere kronisk beslag bruker trådløs telemetri EEG video-system. Vi tror denne protokollen kan gi detaljert informasjon om passende dyr modeller for kronisk epilepsi og epileptogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation av Korea (NRF) stipendet finansiert av koreanske regjeringen (NRF-2014R1A1A3049456) og et stipend fra Korea helse teknologi R & D prosjektet gjennom den Korea helse industri Development Institute (KHIDI), finansiert av helse og velferd, Sør-Korea (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Epilepsy. N Engl J Med. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E.
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nat Rev Neurol. 5 (7), 380-391 (2009).
- Cavalheiro, E. A. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 16 (1-2), 33-37 (1995).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Prog Neurobiol. 73 (1), 1-60 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (10), 2887-2899 (2013).
- Sharma, A. K., et al. Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis, induced rodent models and lesions. Toxicol Pathol. 35 (7), 984-999 (2007).
- Hellier, J. L., Dudek, F. E. Chemoconvulsant model of chronic spontaneous seizures. Curr Protoc Neurosci. 9, Chapter 9 Unit 9 19 (2005).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic epilepsy. Epilepsy Behav. 14, Suppl 1 16-25 (2009).
- Mathern, G. W., Adelson, P. D., Cahan, L. D., Leite, J. P. Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyer's hypothesis revisited. Prog Brain Res. 135, 237-251 (2002).
- Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
- Brulet, R., Zhu, J., Aktar, M., Hsieh, J., Cho, K. O. Mice with conditional NeuroD1 knockout display reduced aberrant hippocampal neurogenesis but no change in epileptic seizures. Exp Neurol. 293, 190-198 (2017).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nat Commun. 6, 6606 (2015).
- Cavalheiro, E. A., Santos, N. F., Priel, M. R. The pilocarpine model of epilepsy in mice. Epilepsia. 37 (10), 1015-1019 (1996).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
- Hester, M. S., Danzer, S. C. Accumulation of abnormal adult-generated hippocampal granule cells predicts seizure frequency and severity. J Neurosci. 33 (21), 8926-8936 (2013).
- Shibley, H., Smith, B. N. Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice. Epilepsy Research. 49 (2), 109-120 (2002).
- Borges, K., et al. Neuronal and glial pathological changes during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model. Exp Neurol. 182 (1), 21-34 (2003).
- Pavlova, M. K., Shea, S. A., Bromfield, E. B. Day/night patterns of focal seizures. Epilepsy Behav. 5 (1), 44-49 (2004).
