Summary
מבחני צריכת המזון כמותיים באוכל צבוע לספק חזקים, תפוקה גבוהה אומר להעריך את המוטיבציה האכלה. שילוב וזמינותו צריכת מזון עם thermogenetic ו optogenetic המסכים היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור את המעגלים העצביים שבבסיס התיאבון למבוגרים melanogaster דרוזופילה.
Abstract
צריכת מזון הוא תחת שליטה הדוקה של המוח, אשר משלב את מצב פיזיולוגי, palatability ותוכן התזונתיים של המזון, וכן בעיות פקודות כדי להפעיל או להפסיק האכלה. פענוח התהליכים שבבסיס בקבלת ההחלטה של מתון האכלה נושאת השלכות עיקריים בהבנה שלנו של הפרעות פיזיולוגיות ופסיכולוגיות הקשורים האכלה שליטה ובמועד. שיטות פשוטות, כמותיים, חזקים נדרשים למדידת בליעה מזון בעלי חיים לאחר מניפולציה ניסויית, כגון בכפייה הגברת הפעילות של הנוירונים יעד מסוימים. . הנה, הצגנו מבוסס-צבען תיוג מבחני האכלה כדי להקל על המחקר neurogenetic של האכלה שליטה ב זבובי פירות למבוגרים. אנחנו סקור מבחני האכלה זמין ולאחר מכן לתאר את השיטות שלנו שלב אחר שלב מהגדרת ניתוח, המשלבים thermogenetic, optogenetic מניפולציה של נוירונים שליטה מוטיבציה האכלה עם assay צריכת מזון התווית על-ידי צבע. נדון גם את היתרונות והמגבלות של השיטות שלנו, לעומת מבחני האכלה אחרים, כדי לסייע לקוראים לבחור וזמינותו המתאים.
Introduction
לכימות בכמות האוכל בלע חשוב להערכת מספר היבטים של האכלה הפקדים על-ידי המוח כתגובה לאסונות לצרכים פנימיים (כגון הרעב הברית), גורמים חיצוניים (כגון איכות מזון ו palatability)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. בשנים האחרונות, המאמצים של פיענוח של סובסטרטים עצבית של האכלה שליטה בדרוזופילה להוביל להתפתחות של מבחני מרובים כדי לכמת את כמות המזון בלע במישרין לשמש בתור מדד של האכלה מוטיבציה 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
12,assay13 נימי מזין (CAFE) פותחה כדי למדוד את כמות הצריכה של מזון נוזלי ב microcapillary זכוכית. וזמינותו CAFE מאוד רגיש, לשחזור17 ומפשטת את המדידה של צריכת מזון, במיוחד עבור לכימות האכלה לטווח ארוך18. עם זאת, וזמינותו הזה דורש הזבובים לטפס אל קצה microcapillary ולהאכיל הפוך, אשר אינו מתאים עבור כל זנים. בנוסף, מפני הזבובים להיבדק באמצעות וזמינותו CAFE חייב להיות גדלו במזון נוזלי, ההשפעה של אלה תנאים על חילוף החומרים מצב או של תת-תזונה פוטנציאל לגידול נשאר להיות נחושים.
11,assay14 תגובה סיומת חוטם (פי) סופרת את התדירות של תגובות סיומת חוטם לכיוון נגיעות עדינות של המזון טיפות. לכל assay הוכיח היא דרך מצוינת כדי להעריך האכלה המוטיבציה של זבוב, ישבנים השפעת palatability ותוכן של מזון18,19. עם זאת, זה לא כימות ישירה של צריכת כמות.
לאחרונה, פותחה שיטה חצי אוטומטי, המדריך האכלה assay (MAFE)15. ב- MAFE, זבוב קיבוע אחד מוזן באופן ידני עם microcapillary המכיל מזון. בהתחשב בכך חוטם סיומת תגובות וצריכת מזון ניתן לנטר בו זמנית, MAFE מתאים הערכת הערכים התזונתיים ואת ההשפעות של טיפול תרופתי. עם זאת, שיתק זבוב עלול להשפיע לרעה על ביצועיו התנהגותית, כולל האכלה.
בנוסף, לטוס חוטם, גלאי פעילות (FlyPAD)10 פותחה באופן אוטומטי לכמת את התנהגות האכילה. באמצעות מכונת ראייה שיטות, FlyPAD רשומות האינטראקציות פיזי בין זבוב מזון כדי לכמת את התדירות והמשך של הרחבות חוטם כמחוון של האכלה מוטיבציה. FlyPAD מספק גישה תפוקה גבוהה כדי לנטר את התנהגויות האכילה של זבוב חינם-המעבר, הרגישות ואת החוסן של מערכת זו עדיין רחוק להיות מאושרות על ידי יותר מחקרים12.
אסטרטגיות תיוג משמשים לעתים קרובות כדי להעריך אוכל בליעה בזבובים. זה נפוץ כדי תווית המזון עם קליעים נותבים כימי, לאחר האכלה, למדוד את כמות בלע מעקב כדי לחשב את כמות צריכת המזון. קליעים נותבים רדיואקטיביים16,17,20,21,22,23,24,25 לאפשר איתור דרך הקוטיקולה בלי המגון של הזבובים. בשיטה זו מספק השתנות נמוך להפליא, רגישות גבוהה18, ריאלי עבור לימוד לטווח ארוך של צריכת המזון. עם זאת, הזמינות של רדיואיזוטופים שמיש, תעריפים שונים של ספיגת, והוצאת צריכים להילקח בחשבון כאשר עובדים עם זה וזמינותו.
תיוג והמעקב צריכת המזון בצבעים שאינם רעילים מזון הוא פשוטה ובטוחה אלטרנטיבית2,3,26,27,28. זבובים הם הומוגני לאחר האכלה עם מזון המכיל צבעי מסיסים ולא נספגים, ואת כמות צבע בלע זה מאוחר יותר לכמת באמצעות ספקטרופוטומטרים3,24,28,29 . אסטרטגיית תיוג הוא קל לביצוע, ומספק יעילות גבוהה, אבל עם אזהרה. הנפח של צריכת המזון מוערך מן לצבוע בלע הוא קטן יותר מאשר אמצעי האחסון בפועל כי הפרשה מתחילה מוקדם ככל 15 דקות לאחר זבובים יתחילו להיות. ניזונים17. בנוסף, וזמינותו מעריך בליעה מזון בדרך כלל תוך תקופה של 60-מין, אשר מתאים רק לחקירה לטווח קצר האכלה התנהגות24,28. יתר על כן, מספר גורמים פנימיים וחיצוניים, כגון גנוטיפ17, מגדר17, הזדווגו המדינה17, לגידול צפיפות30,31,שעון ביולוגי32ומזון איכות3 , 8 , 16, צריכת המזון השפעה. לכן, ייתכן משך ההאכלה צריך להיות מותאם על פי תנאים מסוימים ניסיוני. מלבד בהנחיה כימות של צריכת מזון וצבעי מאכל משמשים גם כדי להעריך אוכל בחירות2,19,27, וכדי להמחיש את מניסקוס ב microcapillary CAFE assay12.
כאן, אנחנו מציגים מניפולציה פרוטוקול בשילוב של פעילות. עצבית בגישה תיוג-צבע. אסטרטגיה זו כבר הוכיח שימושי במחקר שלנו neurogenetic על האכלה שליטה זבובי פירות למבוגרים24. שיטת הניקוד ויזואלי מאפשר הערכה מהירה של צריכת מזון; לפיכך, מומלץ להקרנה דרך מספר רב של זנים במועד. המועמדים מן המסך ואז מאבחנים בפירוט באמצעות שיטה ערכי צבע מוחלטים לספק אובייקטיבית, כימות מדויק במחקר נוסף.
חוץ מזה מבחני האכלה, נתאר גם thermogenetic27,33,34,35 ו- optogenetic36 שיטות בכפייה הפעלת נוירונים היעד בדרוזופילה. כדי להפעיל את הנוירונים מאת thermogenetic המבצע היא פשוטה ונוחה עם דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים Ankyrin 1 (dTRPA1), אשר הוא הקטיון טמפרטורה - ו ממותגת מתח ערוץ זה מגביר דעתנית עצביים כאשר הסביבה הטמפרטורה עולה מעל33,23 ° C37; עם זאת, בדיקות חיות בטמפרטורות גבוהות עשוי לייצר השפעות שליליות על התנהגות. גישה יעילה אחרת כדי להפעיל את הנוירונים בדרוזופילה משתמש optogenetics עם CsChrimson36, אשר הוא אדום-העביר גרסה של channelrhodopsin זה מגביר את רגישות של נוירונים לאור. Optogenetics מציע רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, פחות הפרעה התנהגויות מאשר thermogenetics. שילוב של מדידה כמותית של צריכת המזון עם המניפולציה של פעילות. עצבית מייצג גישה יעילה ללמוד את המנגנונים העצביים של האכלה.
נתאר בפירוט את הכנת האכלה החדר וזבובים להיבדק. באמצעות זבובים טאוטי-Gal4 כמו דגם24, אנו מתארים את הפעלת נוירונים באמצעות thermogenetics ו- optogenetics. שני מבחני של כימות של צריכת מזון עם התווית על-ידי צבע אוכל מתוארים גם בפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת החדר האכלה
הערה: תא האכלה עבור תיוג לצבוע assay האכלה מורכב משני חלקים: המיכל החיצוני (בתור כיסוי), הבתוך מיכל (כמקור מזון).
- לשנות את המיכל החיצוני מ בקבוקון זכוכית עבור culturing דרוזופילה (קוטר פנימי של 31.8 מ מ), בגובה של 80 מ"מ (איור 1 א', 1 ג'). כיסוי בתחתית המיכל עם שכבה של 1% agarose (5 מ"ל) כדי לשמור את ההגדרה האכלה כראוי humidified ולשמש מצע רך לזבובים לדרוך (איור 1B). המיכל ובכך מספק סביבה מבוקרת אבל נטורליסטי נושא עם לחץ מינימלי או הפרעה לזבובים.
- להכין את המיכל החיצוני. להשעות 0.5 גר' agarose ב 50 מ של מים מזוקקים כפול, חום עם עצבנות תכופים, והרתיחו להתמוסס לחלוטין על פגים עם צלחת חום.
- כאשר מתקרר agarose 1% עד בערך 60 ° C, להעביר 5 מ של 1% agarose ריקה מחוץ מיכל (איור 1B), ולתת המכולה תישאר פתוחה עד התקררה לטמפרטורת החדר להניב רכיב pad agarose.
- להכין אוכל התווית על-ידי צבע. הרכב המזון התווית על-ידי צבע משתנה בהתאם לתכלית ניסיוני. הנה דוגמה של הכנת האוכל התווית על-ידי צבע המכיל רק סוכרוז.
- להוסיף 0.5 גר' agarose 50 מ של מים מזוקקים כפול, חום עם עצבנות תכופים, והרתיחו להתמוסס לחלוטין על פגים עם צלחת חום.
- כאשר agarose 1% מעל מתקררת כ 60 מעלות, להוסיף agarose כדי להשיג 100 מ מ סוכרוז 1.71 גר' סוכרוז.
- להוסיף 0.25 g של צבע כחול (erioglaucine ניתרן) הפתרון agarose להצטייד במזון התווית על-ידי צבע 0.5% (w/v).
- להכין הבתוך המיכל. לשים את רוקן במכלים על משטח אופקי שטוח, ואז מוסיפים 750 µL של מזון התווית על-ידי צבע כחול מיכל מזון בודד, עזוב את זה לחזק לפחות 5 דקות.
הערה: הבתוך מיכל הוא מאכל פלסטיק קטן עם קוטר פנימי של 13.6 מ מ, בגובה של 7.5 מ"מ (איור 1 א', 1 ג). זה הוא מלא באוכל התווית על-ידי צבע ולאחר מכן ימוקם במרכז משטח agarose של המיכל החיצוני. - העברה של מילוי בתוך מיכל לתוך מיכל בחוץ מוכן ומקם אותה במרכז משטח agarose. תן את תאי האכלה שפתוחים בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות עד הקיר של המיכל החיצוני ללא עיבוי.
הערה: הקיר היבש יש צורך למנוע את הזבובים להיות תקוע על גבי הקיר על ידי פנייה ישירה טיפות מים. - להכין תאי האכלה עם אוכל ללא צבע (קומפוזיציה זהה אבל בלי לצבוע) על רקע חיסור.
2. הכנת זבובים
הערה: נקבה בוגרת טסה 5-10 יום לאחר וגיחתו משמשים בדרך כלל עבור מבחני האכלה. מומלץ להכין את הזבובים של אחרים שונים, כולל פקדי גנטי, וכדי לבדוק במקביל. זבובים 20 (מתוך תא האכלה אחת) ליצור נקודת נתונים אחת.
- קח בחשבון את צפיפות האוכלוסייה לגידול הזבוב הבוגר. בדרך כלל, שליטה בצפיפות האוכלוסין על ידי שינוי מספר הורים זבובים לפי הזנים וממדים בקבוקי תרבות. לדוגמה, להעביר בקבוק תרבות עם (קוטר של 31.8 מ מ), בגובה של 80 מ מ 15 זכרים ונקבות 30 של קנטון-S ותנו הנקבות להטיל ביצים במשך יום אחד ואז הסר שהמבוגר זבובים.
- היכונו זבובים להפעלה thermogenetic.
- השתמש את מערכת Gal4/UAS38 לבטא dTRPA133 נוירונים שונים על ידי מעבר ש-UAS-dTrpA1 טס עם קווים נהג GAL4 שונים (איור 2B).
- לשמור את הזבובים הבוגרים על מזון רגיל 22 ° C 60% לחות יחסית, מחזור בהירה-כהה 12 h/12 שעות.
- יומיים לפני ההזנה assay, למיין, לאסוף זבובים על CO2 לעוף משטח במיקרוסקופ סטריאו לתוך בקבוקון מזון טרי, לשמור על צפיפות של 20 זבובים לכל מבחנה.
- היכונו זבובים להפעלה optogenetic.
- השתמש את מערכת Gal4/UAS38 כדי לבטא CsChrimson36 בנוירונים שונים על ידי מעבר זבובים UAS-CsChrimson עם קווים שונים של מנהל ההתקן GAL4.
- לאחרונה לאסוף זבובים eclosed (תוך 24 שעות) ולהעביר אותם לתוך בקבוקון עם תקן מזון המכיל 400 מיקרומטר כל-טרנס-רשתית.
- כדי למנוע הפעלה מוקדמת, לעטוף את הבקבוקונים rearing ברדיד אלומיניום ושמת אותם לתוך תיבת כהה להגן על זבובים גירוי אור לא רצויים. שמור את הזבובים 25 ° c, 60% לחות בחושך 4-6 ימים.
- יומיים לפני ההאכלה וזמינותו, מיון הנקבה טסה על משטח לעוף2 CO תחת מיקרוסקופ סטריאו. לאסוף זבובים 20 לתוך המבחנה ממזון אחד ולשמור אותם בחושך לפני הבדיקה האכלה.
- לנהל את כל הפעולות תחת אור עמום במהירות האפשרית כדי למנוע את ההשפעות שנגרמו על ידי אור מקיף. השתמש מנורת LED ממוקמים רחוק מאזור העבודה, העוצמה באזור העבודה µW/ס מ 52.
הערה: שימוש ברעב קנטון-S זבובים כפקד חיובי עבור וזמינותו האכלה. לשלול את היתושים הללו של מזון ולשמור על agarose 1% במשך 24 שעות לפני הבדיקה האכלה. הרמות של צריכת מזון של הזבובים האלה לעזור להעריך את תנודות היומיומית.
3. הפעלת thermogenetic
- לערוך ניסויים האכלה כל באותו זמן של היום סביב Zeitgeber זמן 4-631,32, כדי למזער את הווריאציות עקב השעון הביולוגי.
- להכין אינקובטור (או חדר קטן עם תנור מבוקרי טמפרטורה) כמו הסביבה חימום.
- לפני ניסויים התנהגותיים, equilibrate את תאי האכלה מוכן בטמפרטורה ניסיוני (30 ° C) במשך שעתיים להבטיח הטמפרטורה היחסית המדים בבית הבליעה האכלה.
- כדי להתחיל את תהליך ההזנה, בזהירות להעביר זבובים 20 מ שלהם המבחנה הביתה לתא האכלה preheated על-ידי הקשה עדין. להמשיך בתהליך ההאכלה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ( איור 3 א) .
הערה: המחאות כנגד תכופים שפת ההינדי, כגון פותחים וסוגרים את הדלת חממה, להשפיע לרעה על ההתנהגות האכלה, וכך צריך להיות ממוזער. - הפסקת האכלה ב 60 דקות על ידי הקפאת את תאי האכלה ב- 80 ° C (או-20 ° C) במשך 30 דקות.
הערה: הקפאה מסייעת לעצור בפטריה בלשכה כל בו זמנית. הקפאת זבובים ב-80 מעלות צלזיוס משמשת לשתי מטרות, המתות חסד הזבובים ועל אחסון עד המגון עד לשבוע אחד. - עבור קבוצת בקרת טמפרטורה, העברת הזבובים 20 לתוך טמפרטורת החדר. האכלה קאמרית עם אוכל לצבוע בצבע כדי להתחיל את תהליך ההזנה ב 22 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- הפסקת האכלה של קבוצת בקרת טמפרטורה על ידי הקפאת התאים ב- 80 ° C (או-20 ° C) במשך 30 דקות.
4. Optogenetic הפעלה
- לערוך ניסויים האכלה כל באותו זמן של היום סביב Zeitgeber זמן 4-631,32, כדי למזער את הווריאציות עקב השעון הביולוגי.
- בזהירות להעביר זבובים 20 בקבוקון אחד לתא הזנה על-ידי הקשה עדין ולאחר מכן שים תא לצדדים על הכיוונון תאורה (איור 4A, 4B).
- Optogenetic תמרון, משתמשים במערך של נוריות כתום (607 ננומטר) כמקור של גירוי האור, תיקון לוח פלקסיגלס אופקי מעל נוריות לתמוך ההזנה צ'יימברס בזמן תאורה. שמור את ההתקנה בתוך אינקובטור 25 ° c עם 60% לחות (איור 4A, 4B).
- לעורר את הזבובים הבקרה הגנטית במקביל של טאוטי > CsChrimson זבובים, אך שונים האכלה צ'יימברס.
- המשך תהליך ההזנה עבור 60 דקות עם תאורה האחורי על ידי אור הכתום.
- לקבוע את עוצמות תאורה אופטימלית עבור optogenetics השפעול36. עבור של טאוטי > CsChrimson זבובים, עוצמה של 2.2 מ"מ/mW2 גורם לשיתוק (הפסקת ומכניקה) ואובדן שליטה בתנוחה, לכן, להשתמש עוצמה ביניים של 0.1 מ"מ/mW2 כדי לגרות את של טאוטי > CsChrimson עף במהלך הבחינה האכלה.
- הפסקת ההזנה על ידי הקפאת תאי האכלה ב- 80 ° C (או-20 ° C) במשך 30 דקות.
5. חזותי הערכה של צריכת מזון
הערה: הגישה הבקיע החזותי מספק של הערכה כמותית למחצה של מזון consumptions. למרות שהוא לא הכי אובייקטיבי כשיטת אופטי, שיטה זו מאפשרת לעבור דרך מספר רב של זנים לטוס במועד, הופכים אותו למתאים לשימוש הראשון עגול של מסך גנטית כדי לצמצם במהירות את רשימת המועמדים לבדיקות נוספות.
- לאחר תהליך ההאכלה, עזים ומתנגד, ציון הזבוב על מפקד פד לעוף2 תחת מיקרוסקופ סטריאו. לתת ניקוד בודדים כל זבוב בהתבסס על נפח עוצמת בצבע צבען אוכל בבטן שלה (איור 2 א).
הערה: קריטריונים להערכת חזותי: מערכת ניקוד יש 4 רמות של צריכת המזון המתאים אמצעי אחסון שונים ועוצמות של האוכל צבעוניים על הבטן.- הציון לא טס בלי אוכל לצבוע בצבע לזיהוי ציון 0; תן אותם עם צבע כחול (בקושי לזיהוי) חלש או באוכל לצבוע בצבע שיתפסו פחות משליש אמצעי האחסון של הבטן ציון של 1.
- הציון טסה עם אוכל לצבוע בצבע עז כובשת מחצית אחת של הבטן ציון של 2.
- ציון אלה עם אינטנסיבי צבוע תוכן כובש יותר ממחצית הבטן ציון של 3 (איור 2 א).
- לחשב את הפרופורציה של זבובים עם ציונים שונים לכל תנאי הניסוי (איור 2B).
6. ערכי צבע מוחלטים כימות של צריכת מזון
- לאחר הפסקת האכלה, שופכים זבובים 20 כל הנקה קאמרית על חתיכת נייר במשקל ולאחר מכן להעביר אותם לתוך צינור 1.5 mL בעזרת מברשת רכה.
הערה: לא לקחת את כל התאים מהאחסון-80 ° C במקביל כדי למנוע זבובים נצמדים לקיר קאמרית בגלל עיבוי מים על תא קר. - להוסיף 500 µL של PBST הצינור, homogenize את הזבובים באמצעות מפעל שחיקה בתדר 60hz עבור 5 s.
- לאשר המגון מספיק על ידי תצפית כאשר אין שברי לזיהוי של חלקי גוף.
- לסובב את הצינורות עם homogenates למשך 30 דקות-13,000 סל ד כדי לנקות את הלכלוך.
- לאחר צנטריפוגה, להעביר µL 100 של תגובת שיקוע טוב של צלחת 96-ובכן.
- לאחר כל דוגמאות נטענים, לשים את הצלחת לקורא צלחת כדי למדוד את ספיגת של הדגימות-630 ננומטר.
- כדי להסיר את ספיגת רקע, להפחית את ספיגת של supernatants מהזבובים מוזן על אוכל בלי לצבוע ספיגת של תגובת שיקוע של הזבובים מזון-fed כחול.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי, בהתאם הקומפוזיציות של האוכל. מתי אוכל לעוף (בלי לצבוע) יוצר ספיגת-630 ננומטר, יש צורך לבצע שלב זה לחסל את הרקע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מסך thermogenetic.
תיאבון מוגבר באופן חריג גורמת צריכת המזון גבוהות, ללא קשר צרכים פיזיולוגיים. אנחנו מנוצל ערכה זו לעיצוב של תפוקה גבוהה מסך התנהגותית להשיג ידיות גנטי של נוירונים הקשור רעב, שבעה מצבים (איור 1). המסך הניב של טאוטי-Gal424. כאשר הנוירונים של טאוטי-Gal4 הופעלו בכוח ב 30 מעלות צלזיוס, של טאוטי > TrpA1 זבובים בלע כמויות גדולות יותר של מזון מאשר הפקדים (איור 2, איור 3).
מבחינה ויזואלית הניקוד על צריכת מזון.
כי כבר ציינו כי neuropeptides נוירוטרנסמיטורים מסוימים בוויסות של האכלה התנהגות, בדקנו את הקווים GAL4 המתאימים, לרבות NPF20, sNPF39, octopamine21, דופמין27, 40, סרוטונין41,42, והתייחס35ו Dilp2-7,-8,-35. כדי לכמת את התגובה האכלה, אנו חזותית בדק, הבקיע זבובים עם כמויות שונות של צבע לזיהוי בבטן (איור 2 א). לאחר הפעלה של טאוטי הנוירונים, כ 58% של טאוטי > dTrpA1 זבובים הציג התנהגויות האכלה חזק ו- 23% של התנהגויות האכלה מתון הראה (איור 2B). לעומת זאת, נצפו התנהגויות האכלה שולית רק בזבובים עם נוירונים אחרים מופעל באמצעות dTrpA1 (איור 2B).
כימות ערכי צבע מוחלטים של צריכת המזון.
כדי לכמת את צריכת המזון עם דיוק גבוהה, אובייקטיביות, מדדנו את ספיגת החילוץ לטוס באורך-גל ספציפי כדי לצבוע הוסיף מזון27,2,, או28. כדי לתאם ערך ספיגת עם הנפח של צריכת המזון, עיקול רגיל היה מתקבל על ידי מדידה של ספיגת של הפתרונות לדוגמה (למאגר אותו homogenizing את הזבובים, PBST) מעורבב עם כמויות שונות של צבע). כל התוצאות שלנו להפגין, חריפה מופעל נוירונים של טאוטי-GAL4 ע י TRPA1 מוגברת צריכת המזון לעומת הבקרה הגנטית ובקרת טמפרטורה במהלך אותה תקופת מבחן (איור 3B), המציעה כי את טאוטי-GAL4 נוירונים שכותרתו להשתתף ויסות צריכת המזון של מבוגרים דרוזופילה.
Optogenetic הפעלה כדי לקדם את צריכת המזון בדרוזופילה.
השתמשנו UAS -CsChrimson להפעיל טאוטי נוירונים על-ידי תאורה עם כתום בהיר36 (איור 4A, 4B). כאשר של טאוטי > CsChrimson זבובים היו מגורה על ידי נורות LED-607 nm, שאכלו מזון יותר באופן משמעותי מאשר פקדים (איור 4C). יתר על כן, כמויות מזון בלע בקורלציה עם עוצמות האור גירוי (איור 4D). לכן, חוץ thermogenetics עם dTrpA1, הפעלת optogenetic עם CsChrimson בנוירונים טאוטי גם מקדם מוטיבציה האכלה רציונל בזבובים.
איור 1 . פרדיגמה האכלה לניתוח התיאבון בתוך הזבוב הבוגר. (א) ההזנה קאמרית מכיל מבפנים מיכל מלא אוכל לצבוע בצבע של המיכל החיצוני מרופד עם agarose 1%. משמאל לימין, הבתוך גורם מכיל המיכל החיצוני, תא האכלה מלאה. (B) הבתוך מיכל יושב על גבי משטח agarose בתחתית המיכל החיצוני. מבט מלמעלה (C) של התא האכלה. (ד) A מפרטים טכניים מציג את הניסוי "תיאבון מסך". זבובים רציונל רגיל רק לעתים רחוקות אכל מזון (בקבוקון השמאלי), תוך כדי הפעלת בכפייה נוירונים מסוימים-שליטה האכלה גרם זבובים רציונל לבלוע מזון נוספים, ובכך מפגין לצבוע בצבע מזון על הבטן (נכון המבחנה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . הערכה חזותית של מזון בליעה. (א) שיוצרו תמונות כדי להראות את הקריטריונים עבור ניקוד תוכן מזון על הבטן. (B) חלוקת האכלה ציונים בזבובים עם נוירונים המצוין להיות מופעל על ידי dTrpA1 ב 30 º C. לא-Gal4: UAS-dTrpA1 (הבקרה הגנטית); NPF-GAL4: neuropeptide F נוירונים חיובי; sNPF-GAL4: קצר neuropeptide F נוירונים חיובי; TDC1-GAL4 ו- TDC2-GAL4: נוירונים octopamine; TH-GAL4: נוירונים דופאמין; 5-HT: סרוטונין נוירונים; והתייחס: adipokinetic הורמון נוירונים חיובי; dip2: דמויי אינסולין פפטיד 2 נוירונים חיובי; טאוטי-GAL4: GAL4 של טאוטי תוויות נוירונים (n = 120 זבובים לכל תנאי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . Thermogenetic-הפעלה של טאוטי נוירונים מגדילה את צריכת המזון של הזבוב הבוגר. (א) תמונה מציג את ההגדרה של הניסוי הפעלה thermogenetic. האכלה הבדיקה בוצעה בתוך אינקובטור ב 30 º C. (B) צריכת מזון על ידי ערכי צבע מוחלטים כימות בזבובים רציונל נבדק ב 30 מעלות או 22 ° C עבור 1 h. כמות צריכת מזון של זבוב אחד חושבה מזו של זבובים 20 בתא האכלה אחת (n = 6). נ. ס מציין לא משמעותי (p > 0.05); p < 0.001. חד-כיווני אנובה ואחריו עם מבחן פוסט הוק של Tukey שימש כדי לנתח השוואות מרובות. קווי שגיאה מציינים זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . Optogenetic-הפעלה של טאוטי נוירונים מגדיל את כמות צריכת המזון באופן בלתי תלוי-עוצמת. (A, B) שתי תצוגות של ההתקנה עבור הפעלת optogenetic. האכלה התאים הונחו הצידה על צלחת התומכים ולא מואר מלמטה על ידי מערך של נוריות כתום. הצד הקדמי של תיבת תאורה הוסר כדי להציג הבתוך נוריות. הניסויים התנהגותי בוצעו בתוך אינקובטור 25 ° c, 60% לחות. (ג) צריכת מזון של הזבובים רציונל של אחרים המצוין כאשר נבדק תחת תאורה optogenetic או בחושך 1 h (n = 6). (ד) מזון בליעה על ידי שבעה של טאוטי > CsChrimson זבובים היה בקורלציה עם עוצמת תאורה (n = 6). נ. ס מציין לא משמעותי (p > 0.05); p < 0.001, חד-כיווני אנובה ואחריו עם מבחן פוסט הוק של Tukey שימש כדי לנתח השוואות מרובות, הסטודנט t-מבחן להשוואות קבוצה שני. קווי שגיאה מציינים זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דו ח זה יעסוק על תהליך טכני של תיוג לצבוע מבחני האכלה של צריכת מזון בהקשר של thermogenetic ושליטה optogenetic ההפעלה לתמרן נוירונים האכלה. פרוטוקול זה פשוטה ואמינה יעזור להבהיר את הפונקציה של המועמד נוירונים בהאכלה שליטה, כדי למדוד את העדפת מזון זבובים, וכדי לזהות שחקנים הרומן המעגלים שליטה האכלה באמצעות האכלה מבוססות מסכי גנטי24.
לצבוע תיוג אסטרטגיה אפשרית בחקירת התנהגויות האכלה לטווח קצר. לצבוע, erioglaucine ניתרן, מומס והוא בלע עם האוכל, הוא מחוון קריטי של צריכת מזון. קמה ואח הוכיח כי צבע כחול עצמה הראו כל השפעה על האכלה כאשר נמדדת וזמינותו CAFE והן את radioisotope תיוג וזמינותו של צריכת מזון17. באופן דומה, התוצאות שלנו לכל (גירוי הרגל של הזבוב עם פתרון סוכרוז התווית על-ידי צבע או צבע ללא 100 מ מ) ציין כי זבובים הציג הבדל משמעותי בתגובה שלהם כלפי התווית על-ידי צבע או צבע ללא מזון. עם זאת, יש עדיין אין נתונים ברורים לגבי לצבוע הוא חסר טעם בדרוזופילה.
חוץ מזה לשלבים הקריטיים שצוינו בפרוטוקול, שים לב מסוים הכללי המצב של הזבובים להיבדק. מלבד להיות גדלו, ומתוחזק על צפיפות שאינו צפוף, הזבובים צריך להיות מטופל בעדינות, למנוע זעזועים מיותרים או לחצים על מנת לייצר תוצאות עקביות האכלה.
הפרדיגמה האכלה המוצג כאן יש הגבלות מסוימות. ראשית, השיטות שלנו לכמת צריכת מזון במשך 60 דקות. כדי להעריך את צריכת המזון לאורך תקופות ארוכות יותר, כגון יום, שיטה שונה, כגון קפה, יהיה צורך. שנית, לעומת שיטות כימות באמצעות רדיואיזוטופים, השיטה ערכי צבע מוחלטים היא פחות רגיש וקשה לפתרון הבדלי כאשר כמויות של צריכת מזון נמוכים. שלישית, בהתחשב כמה זבובים יתחיל לשחרר מוקדם ככל 15 דקות לאחר תחילת האכלה, פרוטוקול זה בעצם מודד את התוצאה הסופית של צריכת המזון, והוצאת האוכלוסייה17. רביעית, כימות ערכי צבע מוחלטים של צריכת המזון המתוארים כאן היה כי קבוצת לעוף, שערוך של מזון בליעה של זבוב אחד תלויה אחרים מבחני האכלה, כמו תיוג radioisotope, MAFE assay, או FlyPAD. למרות זאת, יתרונות מסוימים של ערכי צבע מוחלטים כימות של צריכת המזון, כגון שיטה פשוטה, יציבה, גלוי, תפוקה גבוהה, בחירה זה הממשלה על כימות של מספר רב של זנים, במיוחד עבור האכלה מבוססי גנטי את מחקרי מעקב ורשתות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הלאומי בסיסי מחקר תוכנית של סין (2012CB825504), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (91232720 ו- 9163210042), האקדמיה הסינית של מדעי (CA) (GJHZ201302 ו- QYZDY-דר-מז-SMC015), ב"אהבה תוכנית קרן (OPP1119434), ו- 100-כשרונות של רשויות אישורים כדי ז'ו י'.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
